Модели in vitro для скрининга противоопухолевых соединений различной природы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

y#K 616-006-092.4:615.277.3.035.1

O.S. Zhukova

IN VITRO MODELS IN SCREENING OF DIFFERENT NATURE ANTITUMOR COMPOUNDS

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

Model system to screen potential antitumor drugs in vitro devrloped in All-Russian Cancer Research Center include different histogenesis 6 human tumor cell lines. All cell lines exhibited differential sensitivity to well known antitumor drugs such as 5-FU, methotrexate, AraC, sarcolyzin, cis-DDP, vincristine, adriamycin, rubomycin, nitrozomethylurea and nidran. The developed panel of human tumor cell lines was effective to screen cytotoxic compounds, new photosensetizers and active phthalocyanines for new methods of antitumor therapy. New promising antitumor compounds with different mechanism of action were found as a result of current screening.

Key words: screening, cell lines, antitumor compounds, photosensitizer, phthalocyanine.

О. С, Жукова

МОДЕЛИ IN VITRO ДЛЯ СКРИНИНГА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ

ГУРОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Модельная система для скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов, разработанная в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина, включает 6 линий клеток различного гистогенеза. Все линии клеток проявили различную чувствительность к известным противоопухолевым препаратам - 5-фторурацилу, метотрексату, арабинозилци-тозину, сарколизину, цис-ДЦП, винкристину, адриамицину, рубомицину, нитрозометилмочевине и нидрану. Разработанная панель линий опухолевых клеток человека позволила эффективно отбирать цитотоксические соединения, новые фотосенсибилизаторы и активные фталоцианины для новых методов терапии опухолей.

Ключевые слова: скрининг, линии клеток, противоопухолевые соединения, фотосенсибилизатор, фталоцианин.

ВВЕДЕНИЕ

Система отбора противоопухолевых препаратов в онкологических центрах США и Европы более 30 лет включала стадию первичного отбора, выполняемую на лейкозах мышей Р-388 или Ь-1210. Анализ клинических данных для отобранных соединений за Шлете 1975 г. показал, что данная система имеет низкую прогностическую возможность, а большинство известных препаратов эффективны в основном на лейкозах и лимфо-мах. В связи с этим возникла необходимость в системе скрининга, которая позволяла бы выявлять соединения с высокой активностью на солидных опухолях.

В 1985 г. отдел химиотерапии опухолей Национального института рака в США начал проект по созданию опухоль-ориентированного широкомасштабного скрининга противоопухолевых препаратов, I фаза

которого включала панель линий клеток, происходящих из основных типов опухолей человека: легкого, молочной железы, толстой кишки, яичника, меланомы, почки, опухолей мозга и лейкоза. Каждый тип опухолевых клеток представлен группой из нескольких линий одного происхождения. Показано, что средняя чувствительность группы линий определенного гене-за соответствует чувствительности опухоли того же генеза к химиотерапии. Данная система отбора более информативна и позволяет получать профили биологической активности отбираемых соединений [6].

Аналогичные этапы развития системы отбора противоопухолевых препаратов прошла в Российском онкологическом научном центре. В 1987 г. была введена двухфазная система первичного отбора противоопухолевых препаратов, включавшая клетки карциномы яичника человека линии CaOv на I фазе и пере-

виваемый лейкоз Р-388 на П.

Учитывая происшедшие изменения в подходах к первичному отбору, в 1993 г. возникла необходимость разработать систему скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов in vitro, основанную на панели клеточных культур, представляющих основные гистологические типы опухолей человека.

В последние годы появились новые методы терапии опухолей, к которым относятся фотодинами-ческая тералия и каталитическая терапия опухолей. Фото динамическая терапия основана на образовании активных форм кислорода при световом облучении клеток [4]. Каталитическая терапия относится к бинарным методам терапии опухолей. Она основана на генерации кислородных радикалов при комбинированном применении водорастворимых фталоцианинов и восстанавливающего агента. Свойствами катализировать в растворах окисление аскорбиновой кислоты с образованием кислородсодержащих радикалов обладают водорастворимые фталоцианиновые комплексы железа и кобальта [3]. Развитие обоих методов связано с поиском эффективных фотосенсибилизаторов нового поколения и фталоцианиновых комплексов с высокой каталитической активностью. В связи с этим представляло интерес изучить возможность использовать панели линий опухолевых человека для скрининга новых фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и фталоцианиновых комплексов для каталитической терапии опухолей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Соединения, линии клеток и условия культивирования.

В качестве объекта исследования были использованы линии опухолевых клеток человека различного гистогенеза: моноцитарный лейкоз L-41 (получен из Института вирусологии), карцинома яичника CaOv (получена в ГУ РОНЦ ), карцинома толстой кишки WiDr (из банка опухолевых штаммов и Colo -получены из NCI), немелкоклеточный рак легкого А549 и карцинома молочной железы линии МСР7(получены из NCI). Все линии клеток были адаптированы к росту на среде RPMI1640, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки теленка при 37 °С и 5 % С02.

Противоопухолевые препараты: 5-ФУ, метотрексат (МТХ), арабинозилцитозин(АгаС), адриамицин, рубомицин, винкристин, цис-ДЦП, нитрозометилмо-чевина (НММ) и нидран (ACNU).

Фотодинамические комплексы представлелны Институтом биомедицинской химии, ИОНХ РАН и ЗАОО “Вета”, фталоцианиновые комплексы - из «ГНЦ «НИОПИК».

Исследованные соединения следующих классов получены: антиметаболиты - из лаборатории химического синтеза НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН; комплексные соединения платины - из Ленинградского химико-фармацевтического института; комплексоны ДНК- из Ленинградского технологического института; производные флавоноидов-из МИГУ;

на соматостатина - из лаборатории химического синтеза; ферменты - на кафедре биохимии опухолей УДН.

Соединения различной природы для случайного скрининга были получены из НИИ биологических испытаний химических соединений.

Все исследованные соединения растворяли непосредственно перед опытом.

Цитотоксический тест

Цитотоксическую активность химических соединений и бинарной системы оценивали с помощью 3Н-тимидинового (3H-TdR) теста и МТТ-теста.

3Н-тимидиновый тест

Основан на измерении уровня включения меченого тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток Уровень включения 3H-TdR измеряли в распадах/ мин/образец на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack Beta. Включение 3Н-ТdR пропорционально количеству клеток в пробе [1].

МТТ-тест

Основан на ферментном восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5,-диметилтиазол-2-ил]-2,5,-дифенилтетразолия бромид, МТТ) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых кристаллов формазана, растворимых в ДМСО [5]. Для эксперимента клетки вносили в 96-луночную пластину. Далее в лунки добавляли ДМСО и измеряли поглощение окрашенных растворов на Titertek Multiskan МСС/340 при длине волны 540 нм. Оптическое поглощение растворов ДМСО пропорционально количеству клеток в пробе.

Для обоих методов оценки цитотоксического эффекта показатели в опытных образцах (По) оценивали по отношению к контролю (Пк) (без исследуемых соединений). Ингибирование роста клеток (ИК) в образцах определяли по формуле: ИК%=(1-По/Пк)хЮ0)%.

Оценка фототоксического эффекта

В начале эксперимента в опытные образцы вносили фотосенсибилизатор в определенной концентрации и инкубировали при 37 °С в течение 2 ч для взаимодействия с клетками. Затем облучали пробы в соответствии с параметрами, указанными ниже. Облученные пробы инкубировали в течение 48 ч при тех же условиях. По окончании инкубации ингибирование роста клеток в пробах оценивали с помощью 3Н-тимидинового теста или МТТ-теста. Контролем служили пробы, содержащие фотосенсибилизатор без облучения. Все фотосенсибилизаторы не имели темновой токсичности.

Схема тестирования фототоксического эффекта фотосенсибилизаторов различных классов in vitro

Предварительное культивирование клеток -

24 часа

Инкубация клеток с фотосенсибилизатором -

2,5 часа

Облучение клеток галогеновой лампой:

мощностью 250 Вт

в диапазоне 600 - 900 нм

фильтры ЖС-16+СЗС-2Э,

КС-11 + тепл, световая доза 10 Дж/см2

время о блучения 10 минут

Инкубация облученных клеток 48 Определение уровней ингибирования роста клеток радиометрическим методом по включению 3Н- в кислотонерастворимую фракцию и МТТ- тестом.

Оценка фототоксичности по концентрации, вызывающей гибель 50 % клеток (ИК50) с учетом темновой токсичности.

Оценка цитотоксической активности каталитической системы

В начале эксперимента в образцы с клетками вносили фталоцианин или фоталоцианин и аскорбиновую кислоту в определенных соотношениях. После 48 ч инкубации оценивали цитотоксический эффект с помощью 3Н-тимидинового теста.

Исследованные соединения считали цитотоксич-яыми, если их концентрация, вызывающая 50 % ингибирование роста клеток (ИК50) < 100 мкМ.

Определение уровня экспрессии Об-алкилгуании ДНК-алкштрапсферазы (АГТ) в клетках. Экспрессию АГТ определяли стандартным пероксидазным им-муноцитохимическим методом на цитопрепаратах клеток, полученных с помощью цитоцентрифуги Universal2 [2]. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела против АГТ (Chemicon). Реакцию «антиген-антитело» проявляли с помощью стрептавидин-биотиновой тест системы LSAB+Kit (Dako). Результаты окрашивания клеток оценивали под световым микроскопом Leica с традиционными критериями:

0 - отсутствие окрашивания,

1 + - слабое окрашивание клеток,

2 + - среднее окрашивание клеток,

3 + - сильное окрашивание клеток антителами

к АГТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис.1 представлены результаты тестирования чувствительности набора линий к противоопухолевым препаратам из класса антиметаболитов - 5-ФУ, МТХ и АраЦ. Из результатов, полученных для 5-ФУ, следует, что линии клеток солидных опухолей были чувствительны к препарату при различном уровне ответов для каждой линии. Чувствительность, превосходящую среднюю в 100 раз, показали клетки аденокарциномы молочной железы и яичника. Уровень ответа клеток лейкоза линии L-41 был ниже среднего значения. Аналогичная чувствительность солидных и лейкозной линий продемонстрирована для МТХ. Обратная зависимость получена для АраЦ. В этом случае высокий уровень чувствительности был у линии L-41 по сравнению со слабой чувствительностью линий, полученных из солидных опухолей. Графические данные для адриами-цина, рубомицина и винкристина представлены на рис. 2. В этом случае наблюдалось равномерное распределение чувствительности для всех линий, за исключением низкого уровня ответа для клеток аденокарциномы толстой кишки линии WiDr. Аналогичные данные по-

Клетки logío ИК50, И III

Лейкоз 141 -э _ ■ |_

Немелкоклеточный рак легкого А549 -4,6 - _ ■

Карцинома толстой кишки \ViDr -4,4 ■ -

Карцинома яичника СаОг -Sß — ■

Карцинома молочной железы МСБ7 -5,7 _. ““ ■

Рис. 1. Графические значения цитотоксической активности 5-ФУ ®, МТХ (П), АгаС (Ш):

индивидуальные значения logI0 ИК50 для каждой линии клеток показаны для 5-ФУ;

средние значения log10 ИК50 для I, II, III соответственно равны: -3,7; -5,7; -4,5.

лучены для сарколизина, цис-ДДП и двух производных мочевины НММ И ACNU (рис. 3).

Из представленных данных следует, что препараты, взаимодействующие с ДНК, дают сходные профили биологической активности при равномерной чувствительности лейкозной и солидных линий клеток.

Низкий уровень ответа к препаратам нитрозоме-тилмочевины связан с высоким уровнем экспрессии О6-алкилгуанинДНК-алкилтрансферазы (АГТ) в клетках всех исследованных линий. АГТ осуществляет необратимый перенос алкильной группы на SH-группу фермента. Этот процесс обуславливает репарацию повреждений ДНК, вызванных действием препаратов нитрозометилмочевин. На рис. 4 представлены микрофотографии экспрессии АГТ на примере клеточных линий L41, А-549, CaOvn WiDr. Полученные резуль-

Клетки

Лейкоз IA1

Немелкоклеточный рак легкого А549

Карцинома толстой кишки WiDr

Карцинома яичника CaOv

loglo

ИК50,

-8,7

-4,6

-4,4

-5,3

IV

Vi

Карцинома молочной -5,7 железы MCF7

Рис. 2. Графические значения цитотоксической активности Адриамицина (TV), Рубомицина (V), Винкристина (VI):

индивидуальные значения log10 ИК50 для каждой линии клеток показаны для адриамицина;

средние значения log10 ИК50 для IV, V, VI соответственно равны: -6,2; -6,6; -7

таты соответствуют клиническим данным о высоком уровне АГТ у больных различными опухолями [7].

Таким образом, представлена различная чувствительность исследованных линий клеток различного типа к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия

С1987г. первичный отбор in vitro прошли более2000 соединений. Базу для отбора составили вещества, синтезированные в лабораториях, где ведется направленный синтез аналогов известных противоопухолевых препаратов или поиск новых классов агентов, а также соединения различнойприроды для случайного скрининга.

Направленный отбор проводили в классах: антиметаболитов, комплексных соединений металлов, комплексонов ДНК, циклофосфорилированных сахаров, производных антрациклиновых антибиотиков, производных флавоноидов, производных аналогов гормона соматостатина и ферментов.

Соединения, представляющие интерес, были отобраны в следующих классах: антиметаболитов, комплексных соединений металлов, комплексонов ДНК, производных флавоноидов, соматостатина и ферментов.

В классе антиметаболитов были отобраны как перспективные на линии CaOv 5 '- и 3 хиналвдиновые производные тимидина, на клетках CaOv и MCF7-ос-и(3-изомерыазидо-производныхоксиметилуридина, 5-фос-фитаденозин и 5-гептафторпропилцигозин - на клетках CaOv. Для производных хинальдиновой кислоты получены данные о противоопухолевой активности.

В классе комплексных соединений металлов цито-токсичность на клетках карциномы яичника показана для ряда комплексов платины. Из них оценены как перспективные моно- и биядерные теофилиновые производные; бензимидазолный и биядерный пиразиновый комплексы; амминокарбогадразид платины и биядерный комплекс триазолата платины. Все комплексы проявили высокую противоопухолевую активность in vivo.

В классе комплексонов ДНК были отобраны и переданы на II фазу отбора производные имидазола,

Клетки

Лейкоз Ь41

Немелкоклегочный рак легкого А549

Карцинома толстой кашки \ViDr

Карцинома яичника СаОт

Карцинома молочной железы МСЕ7

logio wit ИК50,

VIII IX

■5,5

■4,7

•3,5

-5,6

46

^ ''.V

гг; ‘ - rf

......

'iFVfV %

* - 4 fs.

Рис. 3. Графические значения цитотоксической активности Сарколизина (VII), цис-ДДП (VIII), НММ (IX), ACNU(X):

индивидуальные значения log10 ИКЯ для каждой линии клеток показаны для сарколизина;

средние значения и^10ИКядля VII, VIII, DC, X соответственно равны: -4; -5,2; -2,7; -3,7

Рис, 4, Экспрессия АГТ в клеточных линиях:

а - А549; б - CaOv; в - L41; г - Colo.

Окрашивание антителами к АГТ наблюдается в цитоплазме и ядрах клеток (коричневое), ядра докрашены гематоксилином (голубое).

Увеличение*400.

актияомицина Д и краун-производное актиномицина Д, в молекулу которого входит фрагмент полицикли-ческого эфира.

В новом классе производных флавоноидов цито-токсический эффект на линиях CaOv и L41 показан для оригинального соединения, содержащего диэти-ламидоэтилфосфатную группу.

В классе модифицированных аналогов гипотала-мического гормона соматостатина для 3 пентапептидов и гексапептида показана цитотоксическая активность на линии CaOv и противоопухолевая активность на гормонозависимых опухолях крыс.

В классе ферментов цитотоксический эффект на клетках линии CaOv и лимфомы Беркитта линии P3HRj проявил фермент грибного происхождения L-лизин-а-оксидаза с высокой субстратной специфичностью, вызывающий дефицит L-лизина. В экспериментах in vivo лизин-оксидаза была оценена как перспективный фермент с оригинальным спектром противоопухолевой активности.

Случайный скрининг соединений из различных источников не выявил цитотоксичных соединений, представляющих интерес для исследования противоопухолевой активности.

С целью скрининга новых фотосенсибилизаторов для метода фотодинамической терапии проведена оценка фототоксической активности производных дейте-ропорфирина IX, хлорина еб и фталоцианиновых комплексов алюминия и лютеция.

Для оптимизации отбора новых фотосенсибилизаторов был разработан метод тестирования их фототоксической активности в комбинации со световым облучением in vitro, в котором определены условия и параметры облучения опухолевых клеток.

Исследования фототоксической активности фотосенсибилизаторов (рис. 5) на клетках карциномы яичника человека показали, что из 9 производных дейте-ропорфирина IX был отобран 2,4-дигидроксидейтеро-порфирин IX, для которого концентрация, ингибирующая рост клеток CaOv на 50 %, была в 4 раза ниже чем у препарата сравнения фотогем. Комплекс краун-дифталоцианин лютеция в 5 раз превосходил фототок-сическую активность препарата фотосенс. Производное хлорина еб-диглюкозоаминхлорин, или фотодита-зин, выделенный из Spirulina platensis, в 56 раз превосходил по фотохимической активности фотогем. У всех изученных фотосенсибилизаторов отсутствовала темновая токсичность.

Изучение фототоксической активности наиболее активного фотосенсибилизатора фотодитазина (рис. 6) на панели клеточных линий показало максимальный эффект на клетках линии L-41. В группе карцином чувствительность проявили клетки линий CaOv и Colo 320. Линии клеток MCF7 и А-549 были на порядок менее чувствительны с наиболее высоким показателем ИК50, равным 32 мкМ для линии А549. В настоящее время фотодитазин прошел полный цикл предклинических исследований и находится в Фармкомитете для получения разрешения на клинические испытания.

Результаты исследования способности каталитической системы, содержащей фталоцианины Fe ++или Со** и аскорбиновую кислоту, ингибировать рост кле-

Фотосенсибилизаторы

Рис. 5. Фототоксическая активность фотосенсибилизаторов на клетках линии CaOv:

доза облучения = 10 дж/см2, X = 600 - 900 нм

■ PcLu

В Фотосенс В Фотогем

□ 2,4-дигидрокси-ДП IX

■ Фотодитазин

ток карциномы яичника и молочной железы представлены в таблице. Максимальное подавление роста клеток более 90% наблюдалось в присутствии системы, содержащей комплекс кобальта- окта натриевую соль окта - 4,5 карб оксифталоцианина кобальта, получившего название терафтал. На рис. 7 изображено отсутствие цитотоксичности у компонентов каталитической системы - терафтала и аскорбиновой кислоты и высокая активность самой каталитической системы на линиях клеток CaOv, MCF7 и А549.

Оптимальные условия реализации цитотоксичес-кого эффекта каталитической системы (рис. 8) показаны для одновременного или с интервалом не более часа введения компонентов в соотношении 1:10. Полученные результаты были подтверждены при испытании каталитической системы in vivo. Терафтал был рекомендован для разработки на его основе лекарственного средства. В настоящее время он проходит II фазу клинических испытаний.

35 -

30 -

А 549 MCF7 Colo 320 CaOv L41

Рис. 6. Фототоксическая активность фотодитазина на линиях опухолевых клеток человека:

доза облучения = 10 дж/см2, %= 662 нм

Таблица

Ингибирование пролиферации опухолевых клеток человека в присутствии фтало- и нафталоцнаниновых комплексов металлов* и аскорбиновой кислоты** при одновременном введении 'концентрация комплексов - 50 мкМ ‘'концентрация аскорбиновой кислоты - 500 мкМ

Комплекс металла Ингибирование пролиферации, %

Карцинома яичника, линия CaOv Карцинома молочной железы, линия MCF7

Co[Pc(S03Na)z] 0

CorPc(S03Na)2]+H2A 52

Fe[Pc(S03Na)2] 0

Fe|Pc(SOsNa)al+HaA 12

Fe[Pc(COONa)g] 50

Fe[Pc(COONakl+H,A 51

Co[Pc(CH2C5H4N)6]C16 0 0

СоГРс(СН,С,Н4М)гЛС1й+Н,А 74 50

Co[Pc(S03H)2] 0 0

CofPc(SO,H)2]+H2A 76 30

Co[PcCH2(NH2)2SCH2C1)8] 0

Co[PcCH2(NH,,),SCH2C1)r1+H,A 64

Co[Pc(€H2C5H4N)2]CI 0

Co[Pc(CH2C5H4N)2ia+H2A 64

Co[Pc(COONa)8] 0 0

Co[Pc(COONa)8]+H2A 93,5 86

ВЫВОДЫ

1. Показана различная чувствительность 6 исследованных линий клеток различного генеза к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия - сарколизину, цисДЦП, винкристину, 5-ФУ, метотрексату, АраЦ, адриамицину, рубомицину, нит-розометилмочевине и нидрану.

2. В результате скрининга 2000 химических соединений in vitro отобраны химические соединения с вы-

Рис. 7. Цитотоксический эффект бинарной каталитической системы [ТФ + HjA] и ее компонентов на линиях опухолевых клеток человека in vitro:

■ ТФ [50 мкМ.] о НгАрООмкМ]

Ш ГГФ + НгА](1:10)

сокой датотоксической активностью в классе антиметаболитов, комплексных соединений платины, комплексонов ДНК, производных флавоноидов, соматос-татина и ферментов.

3. В результате скрининга in vitro новых фотоди-иамических комплексов для ФД Т отобраны как перспективные: производные дейтеропорфирина, фталоци-анина и хлорина е6.

1:5 1:10 1:20 1:30

[СоР^СООШЫ: [ША1 Рис. 8. Зависимость цитотоксического эффекта каталитической системы СоРс(СО(Жа)8 + аскорбиновая кислота от молярного соотношения компонентов

Концентрация комплекса:

1 —1,0'ККМ

2 — .2,510*1«

3-... 5,0• 10*М

4. Показана высокая цитотоксичность in vitro каталитической системы, содержащей в качестве катализатора окисления аскорбиновой кислоты фталоци-аниновый комплекс Со++ - терафтал.

5. Разработанная система первичного отбора in vitro позволяет проводить емкий скрининг соединений различной природы с высокой корреляцией оценки цитотоксической активности in vitro и противоопухолевой активности in vivo.

ЛИТЕРАТУРА

1, Жукова О.С., Хадуев С.Х, Добрынин Я.В. и др. Влияние L-лизин-оксидазы на кинетику клеточного цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта // Экспер. он-кол. - 1985. - № 7. - С. 42-44.

2. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Под редакцией С.В.Петрова,

Н.Т.Райхлина. Казань: РИЦ «Титул», 2000.

3. Сыркин А.Б., Жукова О. С., Кикоть Б. С. и др. Терафтал - новый препарат для каталитической терапии злокачественных заболеваний//Рос. хим. журн. - 1998. -№

5.-С. 140-146.

4. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодина-мическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России // Рос. хим. журн. - 1998. - № 5. - С. 5-9.

5. Alley М. С., Scudiero D.A., Monks A. et al. Feasibility of drug screening with panel of human tumor cell lines using a mieroculture tetrazolium assay // Cancer Res. - 1988. -Vol. 48.-P.569-601.

6. Boyd M.R. Status of the NCI preclinical antitumor drug discovery Screen // Cancer: Principles and discovery of Ocology. -1989. - Vol. 3. - P. 1-12.

7. Citron М., Decker R., Chen S. et al. 06-methylguanine-DNA methyltransferase in human normal and tumor tissue from brain, lung, and ovary // Cancer Res. - 1991. Vol. 51. - P. 4131-4134.