CC BY
179
УДК 615.015. 576.535-31
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГЕНЕРАТИВНОМ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА «СТЕЛЛАНИН» (1,3-ДИЭТИЛБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ ТРИЙОДИД)
© 2012 г. К.В. Двадненко1, Б.В. Страдомский1'2, Д.И. Водолажский1, Н.Н. Тимошкина1, Д.Г. Матишов1,
Ю.Ю. Солодунов2
1Институт аридных зон Южного научного центра РАН, 1Institute of Arid Zones of the Southern Scientific Centre RAS, ул. Чехова, 41, г. Ростов н/Д, 344006, Chekhov St., 41, Rostov-on-Don, 344006,
dmatishov@mail. ru dmatishov@mail. ru
2ООО «Фармпрепарат», 2Company «Farmpreparat»,
ул. Калинина, 2, г. Азов, Ростовская обл., 346780 Kalinin street, 2, Azov, Rostov Region, 346780
Проведено сравнительное исследование влияния йодсодержащих мазей «Стелланин-ПЭГ» («Фармпрепарат», Россия) и «Бетадин» («Egis», Венгрия) на механизмы репаративной регенерации гнойных ран при местном лечении с помощью комплекса электронно-микроскопических, морфометрических методов. В модельных условиях на культуре клеток человека линий HEp-2 и А549 с помощью методов ПЦР-РВ (полимеразная цепная реакция в реальном времени) было изучено воздействие 1,3-диэтиблензимидазолия йодида — фармакологически активного метаболита препарата «Стелланин-ПЭГ» на генную экспрессию ядерных (vegfA, vegfB) и митохондриального (^2) локусов.
Ключевые слова: «Стелланин-ПЭГ», 1,3-диэтилбензимидазолия иодид, фибробласты, репаративная регенерация, грануляционная ткань, макрофаги, экспрессия генов, hv2, vegfA, vegfB.
A comparative study was performed to analyze the effect of iodine-containing ointments «Stettanin-PEG» produced by «Farmpreparat», Russia, and «Betadin» produced by «Egis», Hungary, on mechanisms of reparative regeneration of septic wounds during local treatment u sing a set of electron microscopic and morphometric techniques. Under the model conditions of HEp-2 and A549 human cell lines, RT-PCR (Real-time polymerase chain reaction) was used to examine the effect of 1.3-iodine diethylbenzimidazole, a pharmacologically active metabolite contained in «Stellanin-PEG», on gene expression of nuclear (vegfA and vegfB) and mitochondrial (hv2) loci.
Keywords: «Stellanin-PEG», 1.3-iodine diethylbenzimidazole, fibroblasts, reparative regeneration, granulation tissue, macrophages, gene expression, hv2, vegfA, vegfB.
Лечение пациентов с гнойной хирургической патологией остается актуальной медицинской проблемой. Характерное для заживления гнойных ран нарушение синхронизации фаз воспаления и регенерации негативно отражается на процессах репарации, увеличивает продолжительность пребывания больных в стационаре, повышает риск развития осложнений. В настоящее время применение мазевых форм в первой фазе лечения раневого процесса является основным методом медикаментозной терапии гнойных ран. В частности, всё большее применение находят лекарственные средства, содержащие в качестве активной субстанции комплекс поливинилпирролидона и активного йода [1]. К таким препаратам относятся «По-видон-йод», «Йодопирон», «Бетадин» и др.
В настоящей работе представлены результаты исследования свойств нового оригинального препарата под коммерческим названием «Стелланин®-ПЭГ мазь для наружного применения 3 %» (в дальнейшем «Стелланин-ПЭГ»), содержащего 1,3-диэтилбензимидазолия трийодид как активную фармакологическую субстанцию (разработчик и производитель ООО «Фармпрепарат», г. Азов, Россия). В качестве препарата сравнения была использована мазь «Бетадин» («Е^я», Венгрия). Эти препараты имеют весьма схожий состав, поскольку содержат полиэтиленоксид (полиэтиленгликоль, макро-гол), повидон (поливинилпирролидон) и активный йод. Тем не менее композиция мази «Стелланин-ПЭГ» и «Бетадин» имеет также и важное различие. Активный
йод (12) в «Бетадине» представлен в виде комплекса с повидоном, а в «Стелланине-ПЭГ» - в виде комплекса с 1,3-диэтилбензимидазолия йодидом с образованием 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида [1].
Из имеющихся литературных данных известно, что различные производные бензимидазола имеют широкий спектр собственной фармакологической активности: антибактериальной [1], противовирусной [2], противоаллергической [3], антигельминтной [4], противовоспалительной [5] и иммуномодулирующей [6]. Образование в одной лекарственной формуле комплексного соединения 1,3-диэтилбензимидазолия с активным йодом, обладающим сильными окислительными свойствами, детерминирует противомик-робные свойства препарата «Стелланин-ПЭГ».
В процессе лечения гнойных ран мазью «Стелла-нин-ПЭГ» и препаратом сравнения - мазью «Бета-дин» с помощью методов световой и электронной микроскопии было проведено исследование динамики морфологических изменений в образцах тканей гнойных ран больных, находившихся на лечении в отделении ран и раневой инфекции Института хирургии им. А.В. Вишневского. Фармакокинетические исследования проводились с целью выяснения путей биотрансформации в организме активной фармацевтической субстанции препарата «Стелланин» - 1,3-диэтил-бензимидазолия трийодида.
В модельных экспериментах исследовали способность метаболита препарата «Стелланин» изменять
активность экспрессии митохондриальной ДНК (мтДНК), а также генетических локусов сосудистых эндотелиальных факторов роста (vegfA, vegfB) с использованием метода ПЦР-РВ в клетках двух линий человека - HEp-2 и А549 после их экспозиции с 1,3-диэтилбензимидазолия йодидом.
Материалы и методы
Биопсийный материал гнойных ран больных, получавших лечение мазью «Стелланин-ПЭГ» (4 пациента) и «Бетадин» (3 пациента) в отделении ран и раневой инфекции Института хирургии им. А.В. Вишневского, забирали до начала, а также на 1, 2, 3, 4, 5 и 8-е сут проводимой терапии. Материал для электронной микроскопии фиксировали в 2,5%-м растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,27,4). Все дальнейшие этапы выполняли согласно общепринятым методикам. На ультрамикротоме Leica EM UC6 (ФРГ) изготавливали прицельные полутонкие, а затем ультратонкие срезы, которые контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе FEI Tecnai 12 Spirit при ускоряющем напряжении 80 кВ. Во все сроки исследования выполняли подсчёт полиморфно-ядерных нейтрофилов, макрофагов, фибробластов и сосудов микроциркуля-торного русла в 20 произвольно выбранных полях зрения площадью 100 мм2 при увеличении х 1000.
Исследование фармакокинетики проводили на самцах крыс линии Wistar массой 500-600 г после вживления катетера в правую яремную вену. На 3 -й день после операции трём животным вводили однократно перорально жидкую лекарственную форму препарата «Стелланин, капли 40 мг/мл» в дозе 50 мг/кг. Затем отбирали кровь через 15, 30, 60, 120, 180, 240, 480, 720 и 1440 мин после введения препарата. Плазма одного животного, не получавшего препарат, служила отрицательным контролем.
Содержание 1,3-диэтилбензимидазолия йодида в плазме крови крыс определяли методом LC-MS/MS-анализа. Основные фармакокинетические параметры рассчитывали внемодельным методом с помощью компьютерной программы WinNonlin Professional 6.0 (Pharsight Corporation).
Объектом исследования экспрессии генов были две паспортизированные линии клеток человека: HEp-2 (эпидермоидная карцинома гортани человека) и А549 (аденокарциномные клетки альвеолярного базального эпителия легкого человека) («Биолот», Санкт-Петербург). Монослойные адгезионные культуры клеток выращивали в стандартных условиях [7].
1,3-диэтилбензимидазолия йодид исследовали в двух концентрациях (0,1 и 1,0 мМ) в условиях 12- и 36-часового культивирования клеток в питательной среде. Эксперимент сопровождался инкубацией клеток в питательной среде, не содержащей 1,3-диэтил-бензимидазолия йодид (контроль).
Препараты суммарной РНК экстрагировали из клеток методом кислой гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции по Хомчинскому [8] с использованием набора реагентов «РИБО-золь-А» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Остаточную ДНК удаляли путем обработки препаратов РНК ДНКазой I
(#EN0525, «Fermentas») с последующим центрифугированием в растворе 2М LiCl [9].
Для получения кДНК на выделенной РНК-матрице использовали комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия) и рэндомных гек-самерных праймеров.
Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили с помощью набора реактивов R-441 (ЗАО «Синтол», Россия) на приборе iCycler IQ 4 («BioRad», USA) в трех повторах для каждого гена. Каждый опыт сопровождали контрольной реакцией на пробе, не содержавшей кДНК. Подбор праймеров для некодирующего локуса мтДНК (hv2), генов эндотелиальных факторов роста сосудов (vegfA, vegfB) и референтного гена actb провели с помощью базы данных RTPrimer DB и на основании литературного поиска [10-13]. Данные ПЦР-РВ обрабатывали с помощью программного обеспечения iCycler IQ4 («BioRad», USA). Достоверность различий определяли с помощью U-критерия Манна-Уитни с использованием программного пакета Statistica 6.1.
Результаты исследования
Динамика морфологических изменений при лечении гнойных ран мазью «Стелланин-ПЭГ» и препаратом сравнения - мазью «Бетадин».
До начала лечения в биоптатах тканей пациентов наблюдали типичную гистологическую картину, характерную для гнойной вяло заживающей раны. Клеточный детрит в зоне раны был обильно инфильтрирован нейтрофильными лейкоцитами и множеством микробных тел. В результате дегенеративно-деструктивных изменений эндотелия капилляров замедлялся локальный кровоток, что приводило к развитию выраженных гемодинамических нарушений - расширению просвета сосудов, интерстициальному отёку, стазу форменных элементов.
После назначения препарата «Стелланин-ПЭГ» положительная динамика заживления ран наблюдалась уже с первых суток лечения. В области раны уменьшалась нейтрофильная инфильтрация грануляционной ткани. По сравнению с гистологическими данными, полученными до начала лечения, содержание макрофагов практически не менялось, а фиброб-ластов увеличивалось почти в 3 раза. На фоне применения «Бетадина» в области раны сохранялись выраженные воспалительные изменения. Небольшое число фибробластов грануляционной ткани находилось в состоянии дистрофии и некробиоза. Ультраструктура микрососудов в биоптатах пациентов, получавших лечение «Стелланином-ПЭГ», в отличие от «Бетади-на» была нормальной.
В последующем при лечении «Стелланином-ПЭГ» в области раны происходила постепенная смена ней-трофильного пула мононуклеарными фагоцитами. Наступала фаза репарации, сопровождаемая повышением функциональной и пролиферативной активности фибробластов параллельно с активным очищением гнойных ран. Ультраструктура фибробластов свидетельствовала о том, что они активно синтезируют коллаген и гликозаминогликаны (рис. 1а).
б
Рис. 1
В грануляционной ткани значительно возрастала численность кровеносных сосудов, что указывает на усиление процессов неоангиогенеза. Эндотелиальные клетки новообразованных капилляров были соединены плотными контактами, окружены отростками перицитов и имели замкнутый просвет. К пятым суткам лечения наступала фаза образования и реорганизации рубца. Раневой дефект полностью заполнялся грануляционной тканью, степень зрелости которой повышалась по направлению от поверхности ко дну раны. Содержание клеток фибробластического дифферона в зоне рубца было в 1,2 раза выше, чем при лечении «Бетадином». В области раневого дефекта появлялись участвующие в контракции краёв раны миофибробла-сты с характерными субплазмолеммально располо-
женными пучками миофиламентов. Новообразованные кровеносные сосуды формировали характерные сосудистые петли, ориентированные перпендикулярно к поверхности раны.
Заживление ран при использовании «Бетадина» было более длительным. В ранние сроки лечения грануляционная ткань всё ещё содержала большое количество фибриновых отложений, эритроцитов и была обильно инфильтрирована лейкоцитами, которых было в среднем в 1,9 раз больше, чем при лечении «Стеллани-ном-ПЭГ». Среди фибробластов преобладали молодые формы (рис. 1б). На 5-е сут лечения ран «Бетадином» морфологическая картина раны соответствовала лишь третьим суткам лечения «Стелланином-ПЭГ».
К завершению исследования процессы реорганизации грануляционной ткани при лечении «Стеллани-ном-ПЭГ» в основном были завершены. Коллагено-вые волокна и фибробласты ткани рубца были ориентированы параллельно поверхности кожи. Содержание фибробластов в грануляционной ткани было выше в 1,2 раза по сравнению с аналогичным показателем для препарата сравнения. С исчезновением признаков воспаления снижалось и содержание макрофагов в грануляционной ткани. Постепенная редукция сосудов микроциркуляторного русла к этому сроку наблюдений свидетельствовала о высокой степени зрелости грануляционной ткани. При лечении «Бета-дином» очищение ран от клеточного детрита только завершалось, что было характерно для пятого дня терапии «Стелланином-ПЭГ». В грануляционной ткани раны преобладали функционально активные фиброб-ласты. Постепенное усиление васкуляризации происходило за счет активного новообразования сосудов микроциркуляторного русла. В то же время в верхних слоях грануляционной ткани сохранялись незначительные признаки воспаления.
Фармакокинетика и метаболизм активной фармацевтической субстанции - 1,3-диэтилбензимида-золия трийодида.
Результаты проведенных исследований фармакоки-нетики 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида у крыс при однократном пероральном введении препарата «Стелла-нин, капли 40 мг/мл» в дозе 50 мг/кг свидетельствуют о том, что в плазме крови экспериментальных животных препарат был представлен в виде своего метаболита -1,3-диэтилбензимидазолия йодида уже через 15 мин после применения 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида. Время достижения максимальной концентрации этого метаболита в плазме крови составило 30 мин (таблица).
Фармакокинетические параметры Значение
Kel - константа скорости элиминации, 1 мин 0,00215
T1/2 - период полувыведения, мин 323
Tmax - время достижения максимальной концентрации вещества в плазме крови, мин 30
Cmax - максимальная концентрация вещества в плазме крови, нг/мл 259
AUC0^t - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация вещества - время», рассчитывается от момента введения до последнего измерения, мин-нг/мл 83208
AUC0^„ - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация вещества - время», рассчитывается от момента введения до бесконечности, мин-нг/мл 87241
MRT - среднее время удержания препарата в системном кровотоке, мин 432
Значения основных фармакокинетических параметров 1,3-диэтилбензимидазолия йодида у крыс после однократного перорального введения препарата «Стелланин, капли» в дозе 50 мг/кг субстанции 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида
Экспрессия генетических локусов в культурах клеток HEp2 и A549 после обработки метаболитом «Стелланина» - 1,3-диэтилбензимидазолия йодидом.
Согласно полученным данным, после обработки клеток исследуемым препаратом в концентрации 0,1 мМ в течение 12 ч наблюдалось статистически достоверное увеличение экспрессии генетических локусов сосудистых эндотелиальных факторов роста vegfA и vegfB одновременно в двух клеточных линиях. Изменение экспрессии митохондриального локуса hv2 при данных режимах обработки клеток в двух исследованных культурах имели однонаправленный характер -увеличение экспрессии. Однако статистически достоверными были различия только для клеток линии А549 (p<0,05) (рис. 2).
Экспрессия всех исследованных локусов при концентрации препарата 0,1 мМ и экспозиции 36 ч в двух клеточных линиях была существенно ниже показателей, наблюдавшихся при экспозиции 12 ч (рис. 2).
Рис. 2
В результате 12-часовой экспозиции двух линий клеток человека в присутствии исследуемого препарата в концентрации 1,0 мМ наблюдалось значительное и статистически достоверное увеличение экспрессии только локуса митохондриальной ДНК hv2 в двух клеточных линиях (рис. 3).
Рис. 3
При обработке двух линий клеток человека 1,3-диэтилбензимидазолия йодидом в концентрациях 1,0 мМ в течение 36 ч также увеличивалась экспрессия только митохондриального локуса hv2 по отношению к показателям контроля (р<0,05) (рис. 3).
Сравнение между собой результатов экспрессии мтДНК в двух разных экспозициях (12 и 36 ч) проде-
монстрировало сходную динамику изменении, однако при 36-часовой экспозиции эти изменения носили более депрессивный характер в цифровом эквиваленте. Данные отличия могут свидетельствовать об адаптации клеток к исследуемому препарату через 36 ч после инкубации с 1,3-диэтилбензимидазолия йодидом.
Таким образом, при воздействии препарата 1,3-диэтилбензимидазолия йодида в концентрациях 0,1 и 1,0 мМ при экспозициях 12 и 36 ч на клетки линий A549 и HEp2 отмечены в целом однонаправленные и статистически достоверные изменения экспрессии локуса hv2. Наиболее выраженное увеличение в экспрессии локусов vegfA и vegfB наблюдали при воздействии 0,1 мМ 1,3-диэтилбензимидазолия йодида в течение 12 ч.
Обсуждение
Обобщение результатов морфологических исследований позволяет сделать вывод о том, что препарат «Стелланин-ПЭГ мазь для наружного применения 3 %» стимулирует процессы регенерации раневого дефекта более интенсивно, чем мазь «Бетадин». Уже с первых суток применения «Стелланина-ПЭГ» повышается функциональная активность фагоцитов, что является необходимым условием для эффективного очищения ран. Смена нейтрофильного пула мононуклеарными фагоцитами происходила к третьим суткам, а процесс заживления вступал в фазу репарации, чего не наблюдалось при лечении «Бетадином». По данным Н.Н. Зо-лотова и др., противовоспалительное действие «Стел-ланина-ПЭГ», по-видимому, осуществляется за счёт влияния на активность ключевых ферментов метаболизма арахидоновой кислоты и синтеза простагланди-нов - фосфолипазы А2 и экспрессии циклооксигеназы-2 тромбоцитами [14]. Согласно данным электронно-микроскопических исследований, снижение инфильтрации грануляционной ткани, отсутствие краевого стояния лейкоцитов, уменьшение отёка на фоне использования «Стелланина-ПЭГ» также убедительно свидетельствуют об уменьшении воспалительных проявлений.
Единственным качественным различием состава препаратов «Бетадин» и «Стелланин-ПЭГ» является наличие в последнем такого компонента, как 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида, представляющего собой, по сути, комплекс 1,3-диэтилбензимидазолия йодида и молекулярного йода (I2). Таким образом, можно констатировать, что наличие в составе мази «Стелланин-ПЭГ» 1,3-диэтилбензимидазолия с его собственной биологической активностью и определяет регенерационные свойства препарата. Данное заключение подтверждается результатами фармакоки-нетических исследований, свидетельствующих о том, что в организме препарат «Стелланин» при его применении очень быстро метаболизируется до 1,3-диэтилбензимидазолия йодида.
Действие метаболита «Стелланина» - 1,3-диэтилбензимидазолия йодида в концентрациях 0,1 и 1,0 мМ в режимах экспозиции 12 и 36 ч на культуры клеток в условиях in vitro в подавляющем большинстве случаев вызывало статистически достоверное увеличение экспрессии мтДНК. Это может свидетельствовать об акти-
вации процессов митохондриального окислительного фосфорилирования и, соответственно, о повышении энергетического потенциала клеток, что хорошо коррелирует с картиной ультраструктурных изменений в митохондриях. Также было отмечено значимое и статистически достоверное увеличение экспрессии генетических локусов сосудистых эндотелиальных факторов роста vegfA и vegfB при режиме обработки 0,1 мМ 1,3-диэтилбензимидазолия йодида при 12-часовой инкубации клеток. Этот эффект может приводить к стимуляции роста кровеносных сосудов и других клеточных элементов, что подтверждают данные наших морфологических исследований. В то же время необходимо отметить, что другие производные бензимидазола подавляют пролиферацию гладких миоцитов аорты и рост эндотелиаль-ных клеток in vitro и in vivo [15].
Таким образом, комплексное исследование изменений клеточных элементов и интерстициального компонента в грануляционной ткани, наблюдающихся при лечении гнойных ран, свидетельствует о более высокой терапевтической эффективности «Стелланина-ПЭГ» по сравнению с мазью «Бетадин», несмотря на сходство состава обоих препаратов. Данные по экспрессии генов в условиях культуры клеток позволяют предположить наличие у основного метаболита препарата «Стелла-нин-ПЭГ» - 1,3-диэтилбензимидазолия йодида способности к активации ангиогенеза на фоне увеличения экспрессии генетических локусов сосудистых эндоте-лиальных факторов роста vegfA и vegfB и активации митохондриального энергетического обмена клеток.
Литература
1. Страдомский Б.В., Солодунов Ю.Ю., Лыкова Е.О. Экс-
периментальная и клиническая фармакология мазевых форм Стелланина (1,3-диэтилбензимидазолия трийоди-да). Ростов н/Д, 2009. 70 с.
2. Design and synthesis of novel benzimidazole derivatives as
inhibitors of hepatitis B virus / Y. Luo. [et al.] / Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2010. Vol. 18. P. 5048-5055.
3. RHC 3288 [1-methyl-2 (1,3,4-oxadiazol-2(3H)-one-5-yl)
benzimidazole] and related compounds: Novel inhibitors of
Поступила в редакцию
histamine release from rat mast cells and human basophils / A. Khandwala [et al.] // Biochem Pharmacol. 1983. Vol. 32, is. 22. P. 3325-33.
4. El-On J. Benzimidazole treatment of cystic echinococcosis
// Acta Tropica. 2002. Vol. 85, is. 2. P. 243-252.
5. Achar Kavitha C.S., Hosamani Kallappa M., Seetharama-
reddy Harisha R. In-vivo analgesic and anti-inflammatory activities of newly synthesized benzimidazole derivatives // Eur. J. Med. Chemistry. 2010. Vol. 45. Р. 2048-2054.
6. The immunostimulatory activity of 3-(p-chlorophenyl)-2,3-
dihydro-3-hydroxythiazole [3,2]-benzimidazole-2-acetic acid / A. Tagliabue [et al.] // Eur. J. Cancer. 1978. Vol. 14, is. 4. P. 393-400.
7. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практ. руково-
дство. М., 2010. 691 с.
8. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA iso-
lation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.
9. A Simple Method for the Quantitative Isolation of
Undegraded High Molecular Weight Ribonucleic Acid / J.J. Barlow [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1963. Vol. 13. P. 61-66.
10. Vascular endothelial growth factor production and regulation
in human peritoneal mesothelial cells / S. Mandl-Weber [et al.] // Kidney Int. 2002. Vol. 61, is. 2. P. 570-578.
11. Expression of vascular endothelial growth factors A, B, C,
and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma / T. Niki [et al.] // Clin. Cancer. Res. 2006. Vol. 6. P. 2431-2439.
12. Корниенко И.В., Колкутин В.В., Водолажский Д.И.
Комплексный анализ генетических маркеров митохон-дриальной и ядерной ДНК // Клин. лаб. диагностика. 2004. № 9. С. 79.
13. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data
by geometric averaging of multiple internal control genes / J. Vandesompele [et al.] // Genome Biol. 2002. Vol. 3. P. 7.
14. Влияние 1,3-диэтидбензимидазолия трийодида (Стелла-
нин) на активность дипептидилпептидазы-IV (фактор CD26), фосфолипазы А-2 и экспрессию циклооксигена-зы-2 / Н.Н. Золотов [и др.] // Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам: материалы 5-й Междунар. конф. 1-4 июня 2010. Москва, 2010. С. 46.
15. Novel benzimidazole derivatives selectively inhibit endothelial
cell growth and suppress angiogenesis in vitro and in vivo / A. Hori [et al.] // Cancer Letters. 2002. Vol. 183, is. 1. P. 53-60.
27 июля 2011 г.
