CC BY
189
Вадим Сергеевич Покровский1, Наталья Юрьевна Анисимова2, Марина Владимировна Покровская3,
Светлана Серебеджановна Александрова4, Николай Николаевич Соколов5,
Елена Михайловна Трещалина6
АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ RHODOSPIRILLUM RUBRUM
1 К. м. н., младший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория клеточного иммунитета НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория медицинской биотехнологии
НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН (119121, РФ, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10)
4 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория медицинской биотехнологии
НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН (119121, РФ, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10)
5 Профессор, д. б. н., заведующий, лаборатория медицинской биотехнологии НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН (119121, РФ, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10) 6 Профессор, д. м. н., заведующая, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24,
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория комбинированной терапии опухолей,
Покровский Вадим Сергеевич, e-mail: vadimpokrovsky@yandex.ru
Представлены результаты сравнительного изучения антипролиферативной активности L-аспараги-назы Rhodospirillum rubrum (RrA) на культурах клеток опухолей человека: хронического миелолейкоза К562, рака предстательной железы DU 145, рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF7, а также на модели лимфаденоза Фишера L5178y мышей. Значимый цитотоксический эффект RrA выявлен на клеточных линиях К562 (IC50 = 1,80 ME/мл), DU145 (IC50 = 9,19 ME/мл) и MDA-MB-231 (IC50 = 34,62 ME/мл). По сравнению с L-аспарагиназой Escherichia coli II типа (EcA) и Erwinia carotovora (EwA) цитотоксичность на этих клеточных линиях убывает в ряду EcA>RrA>EwA. На мышах с L5178y при 10-кратном внутрибрюшинном введении RrA в разовых дозах 4000 и 8000 МЕ/кг обладает высокой антипролиферативной активностью, близкой к таковой EcA и превышающей эффект EwA.
Ключевые слова: L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum, антипролиферативная активность, лимфа-деноз Фишера.
На протяжении последних 30 лет L-аспарагиназы (КФ З.5.1.1.) из Escherichia coli (EcA) и Erwinia chrysanthemi (ErA) включают в схемы стандартной индукционной терапии острого лимфобластного лейкоза [1]. EcA также используют при лечении экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы [2; 3]. Вопросы получения рекомбинантных штаммов-продуцентов, оптимизации экспрессии и очистки, а также физико-химические, каталитические и антипролиферативные свойства L-аспарагиназ различ-
© Покровский В. С., Анисимова Н. Ю., Покровская М. В., Александрова С. С., Соколов Н. Н., Трещалина Е. М., 2011 УДК 615.355.015.44
ного происхождения проанализированы и обобщены в ряде обзорных работ [4—6].
Традиционно считалось, что противоопухолевый эффект оказывают только бактериальные L-аспара-гиназы II типа, характеризующиеся периплазматиче-ской локализацией, высоким сродством к L-аспарагину (Кт = 10-5 М), высокой сопутствующей L-глутаминазной активностью и рядом особенностей первичной структуры [7; 8]. Практически все изученные в эксперименте или в клинике L-аспарагиназы с доказанным антипро-лиферативным эффектом относятся к L-аспарагиназам II типа. Основным фактором, ограничивающим клиническое применение этих препаратов, является широкий
спектр побочных эффектов, обусловленный низкой субстратной специфичностью и иммуногенностью [9].
Бактериальные L-аспарагиназы I типа представляют собой локализованные в цитоплазме конститутивно экспрессирующиеся ферменты с высоким Km (10-3 М) в отношении L-аспарагина. В отличие от аспарагиназ II типа, они имеют, как правило, более короткую аминокислотную цепочку и более высокую субстратную специфичность, определяющие относительно мягкое побочное действие [8; 10]. Отсутствие противоопухолевого эффекта у некоторых ферментов I типа, например из Pseudomonas geniculata и L-глутаминазы-L-аспарагиназы Pseudomonas acidovorans на модели лимфомы Гарднера 6C3HED, стало причиной временного снижения интереса к ним [11; 12]. Однако лимитирующее побочное действие ферментов II типа послужило новым толчком к поиску активных антипролиферативных аспарагиназ I типа.
Нами выделена L-аспарагиназа I типа из Rhodospirillum rubrum (RrA), имеющая в 2 раза более короткую аминокислотную последовательность (172 аминокислотных остатка) и низкую гомологию по сравнению с таковыми у EcA и ErA. Получен рекомбинантный штамм-продуцент, охарактеризованы его свойства и крайне низкая L-глутаминазная активность [13]. Оценка анти-пролиферативной активности нового фермента стала целью настоящего исследования.
Цель работы — сравнительное изучение антипроли-феративного эффекта новой рекомбинантной L-аспара-гиназы Rhodospirillum rubrum in vitro и in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОдЫ Ферменты
Для получения RrA использован охарактеризованный ранее рекомбинантный штамм-продуцент E. coli/ BL-21 (DE3), который культивировали на среде LB при рН 7,2 ± 0,1 в колбах емкостью 1 л, содержащих 250 мл среды на качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин при температуре 37 °С [13]. Индуктор (лактозу) добавляли в среду с оптической плотностью 0,9—1,9 при 600 нм до конечной концентрации 0,2%, наработку биомассы продолжали в течение 17—20 ч.
После окончания инкубации клетки собирали центрифугированием (15 мин, 2500 g). Биомассу ресуспенди-ровали в буфере А (10 мМ NaH2PO4, 1 мМ глицина, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) и подвергали ультразвуковой обработке (дезинтегратор УЗДН-2Т, Россия) в течение 10 мин (1 мин озвучивания, 1 мин перерыв). Клеточный экстракт получали центрифугированием озвученной суспензии (60 мин, 35 000 g) и наносили на колонку с Q-Sepharose (2 х 30 см), уравновешенную буфером А. Фракции, содержащие RrA, разбавляли в 10 раз буфером А, объединяли и наносили на колонку с DEAE-Toyopearl 650m (1,5 х 20 см), уравновешенную буфером А. В обоих случаях белок элюировали линейным градиентом концентрации NaCl (0—1 М). Скорость элюции составляла 78 и 30 мл/ч соответственно. На заключительном этапе выделения раствор фермента обессоливали и концентрировали в ячейке «Amicon», содержащей фильтр «Millipore» (NMWL 18 000). Все стадии очистки проводили при температуре +4 °С.
В качестве контрольных препаратов использовали коммерческий лиофилизированный препарат EcA
(«Medak», Германия), а также аналогичную ErA рекомбинантную L-аспарагиназу Erwinia carotovora (EwA), выделенную и охарактеризованную в предыдущих работах [14].
Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [15], ферментативную активность — методом прямой несслеризации [16]. За единицу активности L-аспарагиназы (1 МЕ) принимали количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль аммиака за 1 мин при температуре 37 °С.
Культуры клеток
Активность RrA тестировали по сравнению с EcA и EwA на линии клеток хронического миелолейкоза человека К562 (коллекция опухолевых штаммов РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН), линии клеток рака предстательной железы человека линии DU 145 (ATCC, США) и двух линиях клеток рака молочной железы человека линии MDA-MB-231 и MCF7 (ATCC, США). Клетки К562, DU 145, MDA-MB-231 и MCF7 культивировали при температуре 37 °С и 5% СО2 в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone Laboratories, Logan, UK), инактивированной при температуре 56 °С в течение 30 мин, 2 мM L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина («ПанЭко», Россия). Достигшие логарифмической фазы роста клетки пассировали в плоскодонные 96-луночные микропланшеты («Costar») по (5—6) х 104 клеток на лунку и преинкубировали в течение 24 ч перед добавлением тестируемых ферментов в указанных выше условиях. Световую микроскопию клеток проводили с помощью системы «AxioVision 4» («Zeiss», Германия). Жизнеспособность клеток определяли по исключению красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.
Оценка цитотоксичности in vitro
Препараты L-аспарагиназ в растворе Хенкса («ПанЭко», Россия) в широком диапазоне прогрессивно уменьшающихся концентраций добавляли в лунки с клеточной культурой и коинкубировали в течение 72 ч. Диапазон концентраций ферментов в среде культивирования соответствовал 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0031 и 0,00062 МЕ/мл. В контрольные лунки добавляли раствор Хенкса в том же объеме. Уровень клеточного метаболизма по окончании периода инкубации определяли с помощью стандартного МТТ-колориметрического метода (МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбо-ксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразоли-ум) [17]. Оптическое поглощение окрашенных растворов диметилсульфоксида измеряли на планшетном фотометре «Multiskan MS» («Labsystem», Финляндия) при X = 540 нм. Влияние тестируемых растворов соединений на жизнеспособность клеточной культуры оценивали по формуле: (№/№) х 100%, где No — оптическое поглощение в опытных пробах; № — оптическое поглощение в контроле. Для каждого фермента методом нелинейной регрессии рассчитывали ингибирующую концентрацию фермента в среде, которая вызывала снижение количества живых клеток на 50% (IC50).
Животные
В опытах использовали мышей-самок линии DBA2 массой тела 18—24 г разведения РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде.
Перед лечением мышей распределяли на группы (n 7—13). Одну группу оставляли без специфического лечения и считали контрольной (n 6—10).
Опухолевая модель
Штамм лимфаденоза Фишера L5178y получен из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, в опытах использованы 3—5-й пассажи in vivo. Опухоль трансплантировали мышам подкожно по стандартной методике [18].
дозы и режимы введения
Эффективность RrA сравнивали с эффективностью EcA и EwA в сопоставимом диапазоне доз. Препараты вводили внутрибрюшинно на 1—10-е сутки после трансплантации опухолевых клеток в разовых дозах 500—8000 МЕ/кг в концентрации 50—200 МЕ/мл, растворитель — 0,9% раствор натрия хлорида. Мышам контрольной группы вводили 0,3 мл растворителя внутри-брюшинно в том же режиме.
Оценка противоопухолевого эффекта
Эффективность лечения оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) по сравнению с контрольной группой, которое рассчитывали как отношение средней продолжительности жизни (СПЖ) и выражали в процентах. Излеченными считали мышей, проживших более 60 сут без признаков процессирования опухоли на аутопсии (асцит, узловой рост, поражение брыжеечных лимфатических узлов) [18]. При расчете СПЖ излеченных мышей не учитывали.
Оценка переносимости лечения
О побочном действии препаратов судили по состоянию и поведению животных, достоверному уменьшению массы тела (косвенный признак общей токсичности). Учитывали гибель и результаты аутопсии павших или умерщвленных передозировкой эфирного наркоза мышей.
Статистическая обработка результатов
Статистический анализ результатов экспериментов in vitro проводили, рассчитывая медианы и размах 25-го и 75-го квартилей данных в группах (Med, 25—75%). Данные опытов in vivo подвергали статистической обработке по методу Стьюдента в модификации Р. Б. Стрелкова, рассчитывая доверительные интервалы средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при p < 0,05.
результаты и обсуждение
Цитотоксичность RrA in vitro
В ходе экспериментов установлено, что RrA проявляет наиболее значимую цитотоксичность на клеточных линиях К562 и DU 145. На К562 достоверный цитотокси-
ческий эффект наблюдался при воздействии RrA в концентрациях 0,016—50 МЕ/мл. Как следует из данных, представленных на рис. 1 и 2, RrA обладает выраженной цитотоксической активностью, немного уступающей ЕсА (!С50 = 1,80 против 0,82), но значительно превосходящей эффективность EwA (!С50 = 11,06).
Аналогично RrA в концентрациях 0,4—50 МЕ/мл демонстрировала достоверный цитотоксический эффект в отношении DU 145 (рис. 3, 4). При этом следует отметить сопоставимый эффект RrA и ЕсА в концентрациях 10 и 50 МЕ/мл. Расчетные значения !С50 соответствуют 9,19 МЕ/мл для RrA, 2,33 МЕ/мл для ЕсА и 19,61 МЕ/мл для EwA.
Тестирование цитотоксичности испытуемого фермента на клетках линии MDA-MB-231 показало, что диапазон эффективно действующих концентраций находится в пределах 2—50 МЕ/мл. Интенсивность цитотоксичности RrA и ЕсА в области высоких концентраций (10, 50 МЕ/мл) примерно одинакова и соответствует 44—48% и 51—54%, однако диапазон эффективных концентраций ЕсА существенно шире и составил 0,0016— 50 МЕ/мл. Согласно проведенным расчетам на культуре клеток MDA-MB-231 значения !С5[| составили для RrA — 34,62 МЕ/мл, для ЕсА — 14,32 МЕ/мл, для EwA — 50,01 МЕ/мл (рис. 5).
Из всех использованных в проведенном исследовании культур клеток MCF7 оказалась менее чувствительной к RrA, !С5[| = 43,30 МЕ/мл. Диапазон эффективных концентраций этого фермента достигал 10—50 МЕ/мл, т. е. был меньше чем 0,016—50 МЕ/мл для ЕсА или 2—50 МЕ/мл для EwA. В данном исследовании не удалось обнаружить значимого угнетения жизнеспособности клеток этой культуры при коинкубации с EwA в испытанном концентрационном диапазоне, в отличие от ЕсА: !С5[| > 50 МЕ/мл против 10,94 МЕ/мл соответственно (рис. 6, 7).
В целом анализ критерия !С5[| протестированных ферментов на клеточных линиях К562, MDA-MB-231, DU145 дает основание сделать заключение о том, что RrA оказывает более выраженный, чем EwA, цитотоксический эффект, но уступает ЕсА (табл. 1).
Рисунок 1. Антипролиферативная активность RrA на клетках линии К562 по сравнению с EcA и EwA. 1 — RrA; 2 — EcA; З — EwA.
RrA
EcA
EwA
10 МЕ/мл
^ Л с
с с * ^ ‘ Л 7 4
> *
р $
г «V -«
</© *$? ' V » ншш с
2 МЕ/мл
е О О ^ о, • 2»
О О о ГЧ
0 с ° <&
А V/ & * О « А Я
0,4 МЕ/мл
Контроль
*> -ад » ▼ ^ г
V - _ ^ 4 д ил .
?•* «• •г..;'*
ь>
* *&■
г;
й% "*
и
Г
&. <м> е
Г«2* и •?,
^ ж мл *
о
*л> о
Рисунок 2. Цитотоксическое воздействие RrA, EcA, EwA на клетки линии К562 по сравнению с интактным контролем (окраска МТТ, х200).
Таблица 1
Значения IC50 RrA по сравнению с EcA и EwA на различных культурах клеток
Линии опухолевых клеток IC50, МЕ/мл
RrA EcA EwA
MDA-MB-231 34,6 14,3 50,0
MCF7 43,3 10,9 35,1
DU 145 9,2 2,3 19,6
К562 1,8 0,8 11,1
Эффективность и переносимость RrA у мышей с лимфаденозом Фишера
Для сравнительной оценки противоопухолевой активности in vivo использовали охарактеризованные ранее эффективные разовые дозы EcA в диапазоне от 500 до 8000 МЕ/кг [19]. В аналогичных дозах вводили RrA и второй фермент сравнения — EwA. Результаты представлены в табл. 2.
Из полученных данных следует, что эффективность RrA и EwA в изученном диапазоне доз была практически одинаковой, при максимальной разовой дозе 8000 МЕ/кг УПЖ 86 и 71%, а излечение — 25 и 13% соответственно. Уменьшение дозы приводило к снижению эффекта, но при этом EwA в разовой дозе 4000 МЕ/кг была неэффективной (УПЖ = 12%), а RrA вызывала достоверное УПЖ = 72% (р < 0,05) и излечение 14% мышей. EcA была более эффективной, чем EwA или RrA, вызывая УПЖ 84—123% независимо от величины примененной дозы в диапазоне 1000—8000 МЕ/кг с излечением 31—75% мышей. Снижение разовой дозы до 500 МЕ/кг приводило к пропорциональному уменьшению эффекта как по критерию УПЖ, так и по излечению мышей. Таким образом, эффективные дозы RrA и EcA различаются примерно на порядок.
Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной. При применении препаратов в разовой дозе < 4000 МЕ/кг масса тела мышей практически не снижалась: уменьшение < 10% (р > 0,05). Через сутки после окончания лечения RrA, EcA и EwA в дозе 8000 МЕ/кг потеря массы тела мышей составила < 19% (р < 0,05), масса селезенки практически не менялась. Максимальное снижение массы тела на уровне 19% было отмечено в группе EcA. Полученные данные свидетельствуют, что в дозе 8000 МЕ/кг переносимость EcA ухудшается, в то время как лечение RrA или EwA переносится мышами удовлетворительно.
Таким образом, L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum проявляет достоверно высокую цитотоксичность в культурах опухолевых клеток человека (хронического миелолейкоза К562, рака предстательной железы DU 145 и рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF7) и значимо ингибирует развитие лимфаденоза Фишера у мышей. В изученном диапазоне доз 4000—8000 МЕ/кг антипро-лиферативная активность RrA сопоставима с таковой
Рисунок 3. Антипролиферативная активность RrA на клетках линии DU 145 по сравнению с EcA и EwA. 1 — RrA; 2 — EcA; 3 — EwA.
EcA и превышает эффект EwA. Полученные результаты позволяют считать RrA перспективной для углубленного изучения иммуногенности, сопоставления токсических эффектов по сравнению с EcA и прогнозирования клинической перспективности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Van den Berg H. Asparaginase revisited // Leuk. Lymphoma. — 2011. — Vol. 52, N 2. — P. 168—178.
2. Efficacy of L-asparaginase with methotrexate and dexametha-sone (AspaMetDex regimen) in patients with refractory or relapsing ex-tranodal NK/T-cell lymphoma, a phase 2 study / Jaccard A., Gachard N., Marin B., Rogez S., Audrain M., Suarez F., Tilly H., Morschhauser F., Thieblemont C., Ysebaert L., Devidas A., Petit B., de Leval L., Gaulard P., Feuillard J., Bordessoule D., Hermine O. // Blood. — 2011. — Vol. 117, N 6. — P. 1834—1839.
3. Yok-Lam K. The Diagnosis and Management of Extranodal NK/ T-Cell Lymphoma, Nasal-Type and Aggressive NK-Cell Leukemia // J. Clin. Exp. Hematol. — 2011. — Vol. 51, N 1. — P. 21—28.
4. Соколов Н. Н., Занин В. А., Александрова С. С. Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность // Вопр. мед. химии. — 2000. — Т. 6, вып. 46. — С. 531—548.
Таблица 2
Эффективность RrA по сравнению с EcA и EwA на модели лимфаденоза Фишера
Разовая доза, МЕ/кг УПЖ, % Излечение
RrA EcA EwA RrA EcA EwA
500 12 45 - 0/7 2/8 -
1000 21 84а 7 0/8 4/13 0/8
2000 26 118 8 0/8 6/8 0/8
4000 72а 102 12 1/7 4/7 0/8
8000 86а 123 71 2/8 5/8 1/8
а Различия по сравнению с контролем достоверны (р < 0,05).
2 МЕ/мл
Рисунок 4. Цитотоксическое воздействие ЯгД, EcA, EwA на клетки линии DU 145 по сравнению с интактным контролем (окраска МТТ, Х100).
5. Labrou N. E., Papageorgiou A. C., Avramis V. I. Structure-func-tion relationships and clinical applications of L-asparaginases // Curr. Med. Chem. — 2010. — Vol. 17, N 20. — P. 2183—2195.
6. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent / Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. // Crit. Rev. Biotechnol. — 2007. — Vol. 27, N 1. — P. 45—62.
7. Crystal structure and allosteric regulation of the cytoplasmic Escherichia coli L-asparaginase I / Yun M. K., Nourse A., White S. W., Rock C. O., Heath R. J. // J. Mol. Biol. — 2007. — Vol. 369, N 3. — P. 794—811.
8. Bonthron D. T., Jaskolski M. Why a «benign» mutation kills enzyme activity. Structure-based analysis of the A176V mutant of Saccha-romyces cerevisiae L-asparaginase I // Acta Biochim. Pol. — 1997. — Vol. 44, N 3. — P. 491—504.
9. Role of glutamine depletion in directing tissue-specific nutrient stress responses to L-asparaginase / Reinert R. B., Oberle L. M.,
Wek S. A., Bunpo P., Wang X. P., Mileva I., Goodwin L. O., Aldrich C. J., Durden D. L., McNurlan M. A., Wek R. C., Anthony T. G. // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281, N 42. — P. 31 222—31 233.
10. Structure of the type I L-asparaginase from the hyperthermo-philic archaeon Pyrococcus horikoshii at 2.16 angstroms resolution / Yao M., Yasutake Y., Morita H., Tanaka I. // Acta Crystallogr. — 2005. — Vol. 61. — P. 294—301.
11. Tumor inhibitory and non-tumor inhibitory L-asparaginases from Pseudomonas geniculata / Kitto G. B., Smith G., Thiet T., Mason M., Davidson L. // J. Bacteriol. — 1979. — Vol. 137, N 1. — P. 204—212.
12. Purification and properties of L-glutaminase-L-asparaginase from Pseudomonas acidovorans // Davidson L., Brear D. R., Wing-ard P., Hawkins J., Kitto G. B. // J. Bacteriol. — 1977. — Vol. 129, N 3. — P. 1379—1386.
13. Физико-химические и каталитические свойства рекомбинантной L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum / Покровский В. С.,
Рисунок 5. Антипролиферативная активность RrA на клетках линии MDA-MB-231 по сравнению с EcA и EwA. 1 — RrA; 2 — EcA; З — EwA.
Рисунок б. Антипролиферативная активность RrA на клетках линии MCF7 по сравнению с EcA и EwA. 1 — RrA; 2 — EcA;
З — EwA.
RrA
EcA
EwA
10 МЕ/мл
Контроль
Рисунок 7. Цитотоксическое воздействие ЯгД, ЕсД, EwA на клетки линии М0Р7 по сравнению с интактным контролем (окраска МТТ, Х100).
Покровская М. В., Александрова С. С., Андрианов Р. М., Жданов Д. Д., Омельянюк Н. М., Соколов Н. Н. // Тез. докл. V Рос. сим-поз. «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8—12 авг. 2011 г. — С. 410.
14. Выделение, очистка и некоторые свойства рекомбинантной L-аспарагиназы Егшша carotovora, экспрессированной в клетках Е. соИ / Борисова А. А., Эльдаров М. А., Жгун А. А., Александрова С. С., Омельянюк Н. М., Соков Б. Н., Березов Т. Т., Соколов Н. Н. // Биомед. химия. — 2003. — Т. 49, вып. 5. — С. 502—507.
15. Hartree E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response // Anal. Biochem. — 1972. — Vol. 48, N 2. — P. 422—427.
16. Wade H. E., Phillips B. P. Automated determination of bacterial asparaginase and glutaminase // Anal Biochem. — 1971. — Vol. 44, N 1. — P. 189—199.
17. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol.
Methods. — 1983. — Vol. 65. — P. 55—63.
18. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабрие-ва. — 2-е изд. — М.: Медицина, 2005. — С. 637—651.
19. Трещалина Е. М. Противоопухолевая активность веществ
природного происхождения. — M.: Практическая медицина, 2005. — 270 c.
Поступила 05.09.2011
Vadim Sergeyevich Pokrovsky1, Natalia Yurievna Anisimova2,
Marina Vladimirovna Pokrovskaya3, Svetlana Serebedjanovna Alexandrova4, Nikolay Nikolayevich Sokolov5, Elena Mikhailovna Treschalina6
ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY OF RECOMBINANT L-ASPARAGINASE FROM RHODOSPIRILLUM RUBRUM
1 MD, PhD, Junior Researcher, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, RF)
2 MSc, PhD, Senior Researcher, Cell Immunity Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, RF)
3 MSc, PhD, Senior Researcher, Medical Biotechnology Laboratory, V. N. Orekhovich Biomedical Chemistry Research
Institute, RAMS (10, Pogodinskaya ul., Moscow, 119121, RF)
4 MSc, PhD, Senior Researcher, Medical Biotechnology Laboratory, V. N. Orekhovich Biomedical Chemistry Research
Institute, RAMS (10, Pogodinskaya ul., Moscow, 119121, RF)
5 MSc, PhD, DSc, Professor, Head, Medical Biotechnology Laboratory, V. N. Orekhovich Biomedical Chemistry Research
Institute, RAMS (10, Pogodinskaya ul., Moscow, 119121, RF)
6 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy
Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, RF)
Address for correspondence: Pokrovsky Vadim Sergeyevich, Tumor Combination Therapy Laboratory,
Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow,
115478, RF; e-mail: vadimpokrovsky@yandex.ru
The paper compares antiproliferative activity of L-asparaginase from Rhodospirillum rubrum (RrA) on cell cultures of the following human tumors: chronic myeloleukemia K562, prostate carcinoma DU145, breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF7, and on a mouse model of Fisher lymphadenosis L5178y. RrA produced significant cytotoxic effect on cell lines K562 (IC50 = 1.80 IU/ml), DU145 (IC50 = 9.19 IU/ml) and MDA-MB-231 (IC50 = 34.62 IU/ml). As compared to L-asparaginase type II from Escherichia coli (EcA) and from Erwinia caro-tovora (EwA) the cytotoxicity on these cell lines decreased as EcA>RrA>EwA. In mice with L5178y RrA at 4,000 and 8,000 IU/kg after 10 intraperitoneal administrations demonstrated a high antiproliferative activity close to that of EcA and higher than that of EwA.
Key words: L-asparaginase from Rhodospirillum. rubrum, antiproliferative activity, Fisher lymphadenosis.
