CC BY
186
Клин. онкогематол. 2015; 8(2): 120-128
OHI
ГЕМАТОЛОГИЯ
Klin. Onkogematol. 2215; 8(2):120-128
OI\IC'w
HEMATOLOGY
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL STUDIES
Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ
ВС. Покровский1, МВ. Комарова2, С.С. Александрова3, М.В. Покровская3, М.С. Калишьян1, СШ. Каршиева1, ЕМ. Трещалина1
1 ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Бло-хина», Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478
2 ФГАОУ ВО «Самарский государственный аэрокосмический университет им. акад. С.П. Королева (национальный исследовательский университет)», Московское ш., д. 34, Самара, Российская Федерация, 443086
3 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича», ул. Погодинская, д. 10, стр. 8, Москва, Российская Федерация, 119121
Role of Enzymatic Activity in Producing an Antiproliferative Effect of L-Asparaginases
VS. Pokrovskii1, M.V. Komarova2, S.S. Aleksandrova3, M.V. Pokrovskaya3, M.S. Kalish'yan1, S.Sh. Karshieva1, EM. Treshchalina1
1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, 24 Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478
2 Samara State Aerospace University, 34 Moskovskoye sh., Samara, Russian Federation, 443086
3 V.N. Orekhovich Scientific Research Institute of Biomedical Chemistry, 10 bld. 8 Pogodinskaya str., Moscow, Russian Federation, 119121
РЕФЕРАТ
ABSTRACT
Актуальность и цели. Начиная с 70-х годов прошлого века и по настоящее время L-аспарагиназы E. coli (EcA) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в составе схем противоопухолевой химиотерапии острых лимфобласт-ных лейкозов. В последние годы появились сообщения об их эффективности в комбинированной терапии NK/T-клеточных и кожных Т-клеточных лимфом. Цель исследования — изучить взаимосвязь антипролиферативной и ферментативной активности L-аспарагиназ различного происхождения.
Методы. Выполнено проспективное исследование ферментативной и антипролиферативной активности in vitro и in vivo ряда новых L-аспарагиназ: Yersinia pseudotuberculosis (YpA), Rhodospirillum rubrum (RrA), Wollinella succinogenes (WsA), Erwinia carotovora (EwA) в сравнении с L-аспарагиназой Escherichia coli (EcA). Для оценки кинетических параметров рассчитывали Km, kcat и Vmax. С целью анализа цитотоксической активности использовались клеточные линии перевиваемых опухолей человека, а для оценки противоопухолевой активности — мышей-самок линии DBA2 массой тела 18-24 г с внутрибрюшинно трансплантированным лимфаденозом Фишера L5178Y (3-12-й пассаж) из банка ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина». Результаты. Использование L-аспарагиназы II типа (EcA, EwA, YpA и WsA) позволило выявить отчетливую тенденцию: с повышением Km увеличивалась IC50 (r = 0,66; p = 0,007). В диапазоне разовой дозы 2000-8000 МЕ/кг лучшими по выживаемости и излечению оказались L-аспарагиназы с Km = 0,017 и 0,054 ммоль/л по сравнению с L-аспарагиназами с меньшей ферментативной активностью, что подтверждено соответствующими значениями относительных рисков
Background & Aims. E. coli (EcA) and Erwinia chrysanthemi (ErA) L-asparaginases have been used in antitumor chemotherapy for acute lymphoblastic leukemias since 1970s. Reports of their effect in a combined therapy of NK/T-cell and skin T-cell lymphomas have been published lately. The aim of this paper is to evaluate the relation between antiproliferative and enzymatic activities of L-asparaginases of different origin.
Methods. We conducted a prospective study of in vitro and in vivo enzymatic and antiproliferative activity of several new L-asparaginases: Yersinia pseudotuberculosis (YpA), Rhodospirillum rubrum (RrA), Wolinella succinogenes (WsA), Erwinia carotovora (EwA) in comparison with Escherichia coli L-asparaginase (EcA). Km, kcat and Vmax were calculated for evaluation of kinetic parameters. Cell lines of human transplantable tumors were used to analyze the cytotoxic activity, and DBA2 female mice with the body weight of 18-24 g with intraperitoneally transplanted Fisher lymphadenosis L5178Y (3-12 passage) from the bank of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center were used for assessment of the antitumor activity.
Results. The use of type II L-asparaginases (EcA, EwA, YpA and WsA) permitted to determine a clear tendency: IC50 rises simultaneously with Km (r = 0.66; p = 0.007). Using single-dose range of 2000-8000 lU/kg in mice the highest efficacy was shown for L-asparaginases with Km = 0.017 and 0.054 mM in comparison with L-asparaginases with lower enzymatic activity, as confirmed by corresponding odds ratio values in the stratified Cox proportional regression model. The pair-wise comparison of Kaplan-Meier curves and Cox regression method showed that WsA displays the best K /antiproliferative activity ratio both
120
© 2015 практическая медицина
в регрессионной модели Кокса. По результатам попарного сравнения кривых Каплана—Мейера и метода регрессии Кокса лучший профиль соотношения Km и антипролифера-тивной активности in vitro и in vivo показала WsA. По сравнению с препаратами L-аспарагиназ с Km = 0,017 ммоль/л (EcA и YpA) у мышей с L5178 WsA риск неизлеченности статистически значимо снижался в 4-6 раз при диапазонах разовой дозы 500-1000 и 2000-8000 МЕ/кг (относительный риск 0,16 и 0,28) соответственно.
Заключение. Полученные результаты позволили установить прогностическое значение L-аспарагиназной активности ферментов для проявления достоверной антипроли-феративной in vitro и in vivo. В то же время статистический анализ показал, что для отдельных ферментов или дозо-вых диапазонов этот прогноз не является абсолютным. В частности, для диапазона высоких эффективных доз более 12 000 МЕ/кг такая взаимосвязь может отсутствовать.
Ключевые слова: Ьаспарагиназа, противоопухолевая активность, ферментативная активность, механизм действия.
in vitro and in vivo. In the L5178 mice model, it has been shown that WsA decreases the risk of treatment failure by 4-6 times, as compared to L-asparaginases with Km = 0.017 mM (EcA and YpA) using a single-dose range of 500-1000 lU/kg and 20008000 lU/kg, RR = 0.16 and 0.28, respectively. Conclusion. The obtained results confirmed the predictive value of enzymatic activity for demonstration of statistically significant antiproliferative activity both in vitro and in vivo. However, a statistical analysis demonstrated that this prognosis is not absolute for some enzymes or dose ranges. For instance, there might not be such correlation for high effective single dosed > 12 000 lU/kg.
Keywords: L-asparaginase, antitumor activity, enzymatic activity, mechanism of action.
Получено: В ноября 2014 г. Принято в печать: 28 января 2015 г.
Received: November В, 2014 Accepted: January 2В, 2015
Для переписки: Вадим Сергеевич Покровский, канд. мед. наук, Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478; тел.: +7(499)324-14-09; e-mail: [email protected]
Для цитирования: Покровский В.С., Комарова М.В., Александрова С.С., Покровская М.В., Калишьян М.С., Каршиева С.Ш., Трещалина Е.М. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативно-го эффекта L-аспарагиназ. Клин. онкогематол. 2015; 8(2): 120-128.
For correspondence: Vadim Sergeevich Pokrovskii, PhD, 24 Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478; Tel.: +7(499)324-14-09; e-mail: [email protected]
For citation: Pokrovskii V.S., Komarova M.V., Aleksandrova S.S., Pokrovskaya M.V., Kalish'yan M.S., Karshieva S.Sh., Treshchalina E.M. Role of Enzymatic Activity in Producing an Antiproliferative Effect of L-Asparaginases. Klin. Onkogematol. 2015; 8(2): 120-128 (In Russ.).
ВВЕДЕНИЕ
Начиная с 70-х годов прошлого века и по настоящее время L-аспарагиназы E. coli (EcA) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в составе схем противоопухолевой терапии острых лимфобластных лейкозов [1, 2]. В последние годы появились сообщения об их эффективности в комбинированной терапии NK/T-клеточных и кожных Т-клеточных лимфом [3—5].
Считается, что основной механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ различного происхождения заключается в остановке синтеза белка вследствие дефицита незаменимой аминокислоты аспарагина в результате гидролиза в плазме крови с образованием аспарагиновой кислоты и аммиака (рис. 1). Наиболее чувствительны к L-аспарагиназе клетки острого лимфобластного лейкоза, лишенные аспарагинсинтетазы и, соответственно, не способные, в отличие от здоровых клеток, к самостоятельному синтезу L-аспарагина.
O 0
L-аспарагиназа о-
'0- » + nh;
h2n
O NH3 Аспарагин
+ H2O
O NH3 Аспарагиновая кислота
Аммиак
Рис. 1. Реакция ферментативного расщепления L-аспарагина Fig. 1. Enzymatic degradation of L-asparagine
Однако существуют доказательства того, что в реализацию антипролиферативного действия ЕсА существенный вклад вносит также и Ь-глутаминазная активность. Известно, что Ь-глутамин используется клеточной аспарагинсинтетазой для синтеза Ь-аспарагина, а дезаминирование Ь-глутамина приводит к снижению концентрации Ь-аспарагина в плазме крови [6—8]. В пользу этого свидетельствует повышение цитотоксического эффекта ЕсА при целенаправленном угнетении активности глутаминсинтетазы [9, 10].
По последним данным, антипролиферативное действие Ь-аспарагиназ не ограничивается снижением уровня свободного Ь-аспарагина или Ь-глутамина [11]. Обсуждается прямое воздействие на опухолевые клетки путем расщепления связанного Ь-аспарагина в составе гликопротеидных клеточных рецепторов, а также интер-фероноподобный эффект. Известно, что на поверхности клеток при многих онкогематологических заболеваниях присутствует увеличенное количество мембранных рецепторов, таких как CD19, CD40, IGF-R, значительно повышающих чувствительность к действию митогенов различной природы. Связываясь со своими лигандами, эти рецепторы обусловливают усиление роста и пролиферации опухолевых клеток [11, 12]. Как правило, эти рецепторы представляют собой гликопротеидные комплексы, в которых белковая часть объединена с Ы-гликозидной через пептидный спейсер, т. е. разделяющий фрагмент (подобен пептидному мостику Ы-ацетилмурамовой кис-
j.medprint.ru
121
лоты), обогащенный амидными группами L-аспарагина [11, 13]. Существует мнение, что L-аспарагиназа не только разрушает свободный L-аспарагин, но и способна расщеплять аспарагин в составе пептидных спейсеров гликопротеидных рецепторов опухолевых клеток [13]. Рецепторы с отщепленной подобным образом гликозидной частью не могут связываться с соответствующими лиган-дами-митогенами и стимулировать пролиферацию, что может объяснять еще один вероятный механизм антипро-лиферативного действия L-аспарагиназ. Таким образом, совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролифератив-ного действия L-аспарагиназ, ведущая роль в котором все же принадлежит расщеплению L-аспарагина. Вклад каждого механизма в реализацию противоопухолевого эффекта пока остается недостаточно выясненным. В опубликованных работах нет доказательства прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью L-аспарагиназ.
Выделение L-аспарагиназ из новых источников и получение новых данных об их кинетических характеристиках и антипролиферативной активности расширили возможности сопоставления различных параметров их ферментативной, цитотоксической и противоопухолевой активности с целью выявить возможные закономерности. Для обнаружения связи между антипролиферативной и ферментативной активностью мы использовали собственные данные, полученные при изучении пяти различных L-аспарагиназ: Yersinia pseudotuberculosis (YpA), Rhodospirillum rubrum (RrA), Wollinella succinogenes (WsA), Erwinia carotovora (EwA) в сравнении с EcA [14—17].
Цель исследования — изучить взаимосвязь антипролиферативной и ферментативной активности L-аспарагиназ различного происхождения.
Задачи:
• определить кинетические параметры реакции расщепления L-аспарагина, а также антипро-лиферативную активность in vitro и in vivo L-аспарагиназ EcA, YpA, RrA, WsA, EwA;
• выбрать сопоставимые количественные параметры ферментативной и антипролиферативной активности изученных ферментов;
• оценить статистическую значимость взаимосвязи параметров ферментативной и антипролиферативной активности изученных L-аспарагиназ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ферменты
В экспериментах были использованы полученные и очищенные в ФГБНУ ИБМХ им. В.Н. Ореховича пери-плазматические L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis (YpA) и Erwinia carotovora (EwA), а также цитоплаз-матическая L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum (RrA), выделенная и очищенная в ФГУП «ГосНИИгенетика». Кроме того, использовались L-аспарагиназа Wollinella succinogenes (WsA) [14—17] и коммерческий лиофилизи-рованный препарат EcA (Medak, Германия).
Оценка кинетических параметров
Рассчитывали Km (константу Михаэлиса, которая описывает зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата), kcat
122
(константа каталитическая — прочность связывания субстрата с соответствующим ферментом) и Vmax (максимальная скорость ферментативной химической реакции или плотность связывания). Определение Km проводили по скорости образования аммиака при ферментативном гидролизе L-аспарагина. Аспарагиназную активность измеряли в термостатируемой ячейке при 37 °C, рН 8,0. Аликвоту (определенный объем раствора) 1 мл раствора субстрата аспарагина (0,01—0,04 моль/л) смешивали с 0,2 мл 12,5 ммоль/л боратного буфера, затем вносили 0,1 мл раствора RrA (0,5—10 мг/мл). Измерение аммиака проводили с помощью реактива Несслера. Реакцию останавливали, добавляя 0,6 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Величину поглощения определяли при длине волны 480 нм. Графическую обработку полученных данных и расчет Km и Vmax проводили с помощью программы Microsoft Excel по методу двойных обратных величин Лайнуивера—Берка.
Оценка цитотоксической активности
Использовали клеточные линии перевиваемых опухолей человека: хронический миелолейкоз человека K562, аденокарцинома легкого человека А549, рак яичников человека SCOV-3 из коллекции ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина» [18], меланома мышей B16 из банка ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина» [19], а также линии рака простаты человека DU 145 и рака молочной железы человека MDA-MB-231 и MCF-7 из ATCC. Клетки культивировали при температуре 37 °С и 5% СО2 в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (HyClone Laboratories, Великобритания), инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина («ПанЭко», Россия). Достигшие логарифмической фазы роста клетки выращивали в плоскодонные 96-луночные микропланшеты (Costar, США) по 5—6 X 104 клеток на лунку и преинкубировали в течение 24 ч перед добавлением тестируемых ферментов в указанных выше условиях. Световую микроскопию клеток проводили с помощью системы AxioVision 4 (Zeiss, Германия). Жизнеспособность клеток определяли по исключению красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия). Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Препараты L-аспарагиназ в растворе Хенкса («ПанЭко», Россия) в диапазоне уменьшающихся концентраций 0,000062— 50,0 МЕ/мл добавляли в лунки с клеточной культурой и коинкубировали в течение 72 ч. В контрольные лунки добавляли раствор Хенкса в том же объеме. Количество живых клеток в лунках по окончании периода инкубации определяли с помощью МТТ-теста. Оптическое поглощение окрашенных растворов измеряли на планшетном фотометре MultiScan MS (Labsystem, Финляндия) при 1 = 540 нм. Цитотоксичность тестируемых растворов соединений оценивали по формуле: (1 — Ыо/Nk) X 100 %, где No — оптическое поглощение в опытных пробах, Nk — оптическое поглощение в контроле. Для каждого фермента методом нелинейной регрессии рассчитывали IC50 — концентрацию фермента в среде, которая вызывает уменьшение количества живых клеток на 50 %. Кроме того, определяли минимальную эффективную концентрацию (Cmln), вызывающую достоверное ингиби-рование пролиферации по отношению к контролю.
Клиническая онкогематология
Оценка противоопухолевой активности
Использованы мыши-самки линии DBA2 массой тела 18—24 г с внутрибрюшинно (в/б) трансплантированным лимфаденозом Фишера L5178Y (3—12-й пассаж) из банка ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина» [20, 21]. Перед лечением животные были определены в экспериментальную и контрольную группы. На 1 —10-й день после трансплантации мышам опытной группы ежедневно вводили в/б раствор фермента в 0,9% растворе натрия хлорида. Мышам контрольной группы вводили 0,3 мл растворителя по той же схеме. Эффективность лечения оценивали по увеличению продолжительности жизни (ПЖ) в сравнении с контрольной группой (Т/С, treatment/ control), которое рассчитывали как соотношение средней продолжительности жизни (СПЖ) в обеих группах и выражали в процентах. В контрольной группе Т/С = 100 %. Излеченными считали мышей, проживших более 60 дней без признаков опухолевого процесса на аутопсии (отсутствие асцита, узлового роста, поражения брыжеечных лимфатических узлов) [20]. При расчете СПЖ излеченных мышей не учитывали. Переносимость лечения оценивали по изменению поведения, состояния и массы тела мышей, а также наличию изменений внутренних органов павших или выведенных из эксперимента животных на аутопсии. Излеченных животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации на 90-е сутки после трансплантации.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных выполняли с помощью компьютерной программы SPSS21. Статистический анализ результатов экспериментов на культурах клеток проводили путем расчета значения медианы и межквартильного интервала (25—75-й процентиль) в группах. Критическое значение уровня значимости (p) при всех исследованиях принимали равным 0,05. Сравнение долей излеченных животных проводили с помощью анализа таблиц сопряженности с расчетом критерия х2 либо точного метода Фишера и меры связи для данных в порядковой шкале Сомерса [22]. Параметр D Сомерса интерпретируется аналогично коэффициенту корреляции, рассчитываемому для количественных признаков: положительные значения означают прямую связь, отрицательные — обратную, и чем ближе абсолютные значения показателя D к единице, тем теснее взаимосвязь между признаками. Рассчитывали также 95%-е доверительные интервалы (95% ДИ) для долей по методу Клоп-пера—Пирсона [23]. Для оценки взаимосвязи между L-аспарагиназы и показателями эффективности in vitro (IC50) и in vivo (СПЖ) рассчитывали коэффициенты корреляции Спирмена. В опытах in vivo показателю «время жизни» излеченных мышей присвоен максимальный срок наблюдения 90 дней, который при расчете коэффициента корреляции Спирмена получал максимальный ранг. В основе анализируемой экспериментальной модели лежит гипотеза, что если животные были живы на 60-й день после трансплантации лимфаденоза, то в дальнейшем на их ПЖ будут влиять преимущественно иные факторы риска, нежели опухолевый процесс.
Статистический анализ выживаемости мышей проводили с использованием лог-рангового критерия и построения кривых Каплана—Мейера. Для оценки совместного влияния дозы L-аспарагиназы и ее Km на выживаемость
www medprint.ru
животных с опухолями применяли регрессионную модель Кокса. Последнюю строили в трех вариантах для различных диапазонов разовой дозы ферментов: 500—1000, 2000-8000 и 12 000 МЕ/кг и более. Метод построения модели — пошаговый с включением. В качестве возможных факторов риска гибели рассматривали Кп фермента и разовую дозу, а каждый из предикторов — как номинальный признак. Таким образом, с помощью компьютерного алгоритма вычислялись коэффициенты регрессии отдельно для каждого из заданных значений признака по сравнению с референсной категорией. Для К^ за референсное было принято самое низкое значение активности с Кт = 0,017 ммоль/л, а для разовой дозы 2000-8000 МЕ/кг — минимальная доза 2000 МЕ/кг.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение кинетических параметров аспарагиназ
В качестве базовой оценки ферментативной активности использовали показатель Кт, прямо характеризующий сродство фермента к субстрату. Расчетные значения Кт составили 0,017, 0,017, 0,054, 0,073 и 0,221 ммоль/л для YpA, ЕсА, WsA, EwA и НгА соответственно.
Оценка зависимости цитотоксического эффекта от Km
Предварительный графический анализ на парном графике разброса (рис. 2) показал, что цитотоксическая активность НгА с Кп = 0,221 ммоль/л не укладывалась в общую закономерность, поэтому мы провели два варианта корреляционного анализа: по всем проведенным наблюдениям и только по внеклеточным Ь-аспарагиназам II типа WsA, YpA, ЕсА и EwA (табл. 1). Для этих ферментов выявлена отчетливая тенденция: с повышением Кт увеличивалась 1С50 (г = 0,66; р = 0,007). Однако при включении в анализ всех полученных Ь-аспарагиназ
60
50-
40-
у 30 4
2010-
0
0,00 0,02 0,04 0,06 0
Клеточные линии w K562 ♦ A549 □ SCOV-3 A MDA-MB-231
0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 Константа Михаэлиса
V MCF7 □ DU 145 о B16
Рис. 2. Диаграмма рассеивания зависимости цитотоксичности L-аспарагиназ от ферментативной активности по соотношению IC50/Km для разных клеточных линий перевиваемых опухолей
Fig. 2. L-asparaginase-enzymatic activity scatterplot according to IC50/Km ratio for different cell lines of transplantable tumors
123
Таблица 1. Коэффициенты корреляции между IC50 и Km изученных L-аспарагиназ
Вариант изучения П r Р
Только по периплазматическим 1_-аспарагиназам, без ИгД 15 0,66 0,007
По всему исследованному массиву сравнения 19 0,39 0,097
60
50
40
30
20
10
-10
IC '50 -1,9 + 556 ,6 х K - m 2023 ,6 х K 2 m
>
о /* о э
о Q о
о о § >
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 Km, ммоль/л
Рис. 3. Моделирование зависимости цитотоксичности L-аспа-рагиназ от их ферментативной активности методом нелинейной регрессии
Fig. 3. Modeling the dependence of L-asparaginases cytotoxicity on their enzymatic activity using a non-linear regression technique
Таблица 2. Распределение мышей по группам в зависимости от разовой дозы 1_-аспарагиназы
Число мышей в каждой группе Всего
Доза, МЕ/кг YpA EcA WsA EwA RrA
500 0 8 7 0 7 22
1000 13 13 13 8 8 55
2000 0 8 14 8 8 38
4000 0 7 7 8 7 29
8000 0 8 7 8 8 31
12 000 0 0 0 8 0 8
16 000 0 0 0 8 6 14
20 000 0 0 0 8 0 8
Итого 57* 48 56 44 205
* Кт = 0,017 ммоль/л, значения объединены.
коэффициент корреляции закономерно снижался до статистически незначимой величины 0,39 ^ = 0,097), т. к. связь оказалась нелинейной. На основе полученных
данных формально можно построить нелинейную регрессию с квадратичной формой зависимости (рис. 3): 1С50 = -1,9 + 556,6 х Кт - 2023,6 х Кт2.
Модель статистически значима ^ = 3,65; p = 0,049), коэффициент детерминации модели R2 = 0,31 (соответственно коэффициент множественной корреляции R = 0,56). Однако, каков биохимический механизм улучшения противоопухолевых свойств НгА с Кт = 0,221 ммоль/л, остается непонятным.
Оценка зависимости противоопухолевого эффекта от Кт
Общий анализ выполнен в популяции из 205 мышей, получивших лечение Ь-аспарагиназами, и 40 мышей из контрольных групп (табл. 2).
Показано, что в контрольных группах все мыши погибли, ПЖ = 17,05 ± 2,17 дня (среднее ± стандартное отклонение). В группах мышей, получавших препараты Ь-аспарагиназ, достигнут статистически значимый дозозависимый противоопухолевый эффект, вплоть до полного излечения в отдельных случаях. Для сравнения Ь-аспарагиназ с различными Кт по уровню противоопухолевой активности разовые дозы сгруппировали в три диапазона: 500-1000, 2000-8000, 12 000-20 000 МЕ/кг — с выделением доли павших мышей в каждом из них (табл. 3).
При невысоких дозах ферментов (500-1000 МЕ/кг), несмотря на отличия в доле неизлеченных мышей от 35 до 100 % (х2 = 23,22;p < 0,001), зависимости числа павших животных от Кт фермента выявить не удалось ф = 0,13). Этот результат обусловлен высокой противоопухолевой активностью Ь-аспарагиназы WsA, не согласующейся с ее умеренной К^ и не соответствующей ее положению в ряду ферментных препаратов, ранжированных по сродству к Ь-аспарагину.
Наиболее наглядные результаты получены в дозовом диапазоне 2000-8000 МЕ/кг (п = 98). В группах ферментов с различной К, статистически значимым оказалось число неизлеченных мышей (х2 = 17,8; p < 0,001), но также статистически доказана взаимосвязь противоопухолевой активности от Кт: чем больше Кт, тем выше летальность ф = 0,52; p < 0,001).
Внутри выделенных дозовых диапазонов расчет доверительных интервалов для частоты неизлеченных животных показал сопоставимый уровень противоопухолевой активности (рис. 4). Так, в группе высокоактивных аспарагиназ YpA и ЕсА с Кт = 0,017 ммоль/л доля неизлеченных мышей составила 35 % (95% ДИ 16-57 %), а для WsA с Кт = 0,054 ммоль/л — 7 % (95% ДИ
Таблица 3. Статистическая значимость соотношения числа излеченных и неизлеченных мышей с лимфаденозом Фишера
для Ь-аспарагиназ с различной Кт в зависимости от дозы
Абсолютное число мышей, %
Дозовый диапазон, Величина К , ммоль/л Статистическая значимость
МЕ/кг Исход 0,017 0,054 0,073 0,221 и мера связи
500-1000, n = 77 Излечение 8 (24 %) 13 (65 %) — — p < 0,001
Гибель 26 (76 %) 7 (35 %) 8 (100 %) 15 (100 %) х2 = 23,22 D = 0,13
2000-8000, n = 98 Излечение 15 (65 %) 26 (93 %) 1 (4 %) 3 (13 %) p < 0,001
Гибель 8 (35 %) 2 (7 %) 23 (96 %) 20 (87 %) X2 = 51,1 D = 0,50
> 12 000, n = 30 Излечение — — 7 (29 %) 3 (50 %) p = 0,333
Гибель — — 17 (71 %) 3 (50 %) X2 = 0,94 D = -0,17
124
Клиническая онкогематология
0
80
60
40
20
K, = 0,017 Km = 0,054 Km = 0,073 Km = 0,221
Рис. 4. Соотношение излеченных и неизлеченных мышей после применения L-аспарагиназ с различной Km в разовой дозе 2000-8000 МЕ/кг
Fig. 4. Ratio between healed and unhealed mice after administration of L-asparaginases with different Km values using single doses of 2000-8000 lU/kg
1—24 %). Доверительные интервалы перекрываются, что свидетельствует о сопоставимой эффективности Ь-аспарагиназ с Кт = 0,017 и 0,054 ммоль/л.
Аналогично, среди ферментов с низкой противоопухолевой активностью число неизлеченных животных составило 96 % (95% ДИ 79-100 %) для EwA с Кт = 0,073 ммоль/л и 87 % (95% ДИ 66-97 %) для йА с Кт = 0,221 ммоль/л. Таким образом, сопоставляя критерий излечения с уровнем ферментативной активности при дозовом диапазоне 2000-8000 МЕ/кг, прогностически благоприятными по излечению можно считать Ь-аспарагиназы с Кт = 0,017
и 0,054 ммоль/л, а неблагоприятными — ферменты с Кт = 0,073 и 0,221 ммоль/л соответственно.
При оценке антипролиферативной активности Ь-аспарагиназ по показателю выживаемости мышей с лейкозом показано, что при дозе более 12 000 МЕ/кг соотношение числа выживших и погибших мышей идентично (р = 0,333), значение по шкале Сомерса низкое ф = -0,17;р > 0,05). Это свидетельствует об отсутствии связи между антипролиферативной и ферментативной активностью Ь-аспарагиназ при достижении высоких доз.
Оценка этой взаимосвязи выполнена также по ПЖ мышей с лимфаденозом Фишера. При расчете медианы ПЖ учитывали только дозы, не позволяющие вылечить животных. Кривые Каплана—Мейера, построенные по индивидуальным показателям ПЖ мышей, приведены на рис. 5. Поскольку после применения WsA более половины мышей излечены, медиана выживаемости не может быть определена. При дозе 500-1000 МЕ/кг медианы выживаемости составили 31 день для Ь-аспарагиназ с К, = 0,017 ммоль/л, 15 дней — с Кт = 0,073 ммоль/л и 19 дней — с К, = 0,221 ммоль/л. При использовании разовой дозы 2000-8000 МЕ/кг медианы выживаемости для Ь-аспарагиназ с Кт = 0,017 ммоль/л не могут быть определены (более половины животных излечены), для К, = 0,073 и 0,221 ммоль/л медианы составили 17 и 25 дней соответственно.
Лог-ранговый тест позволил заключить, что при сравнении Кт Ь-аспарагиназ и ПЖ мышей для Ь-аспарагиназ с Кт = 0,054 и 0,017 ммоль/л различия значимы: р = 0,001 при разовой дозе 500-1000 МЕ/кг,
В
20 40 60 80 Время, дни
K ммоль/л
□ 0,221
0,221-
+
_ цензурировано
□ 0,073 ь
+ 0,073- О м е
цензурировано а в
□ 0,054 и g
0,054- m
+
цензурировано
□ 0,017
+ 0,017-
100
цензурировано
K , ммоль/л
□ 0,221
0,221-
+
_ цензурировано
□ 0,073
+ 0,073-
цензурировано
□ 0,054
0,054-
+
цензурировано
□ 0,017
+ 0,017-
20
40 60 Время, дни
80
100
цензурировано
g
В
Km, ммоль/л
□ 0,221 0,221-
цензурировано
□ 0,073 0,073-
цензурировано
0 20
40 60 Время, дни
80
100
Рис. 5. Кривые выживаемости мышей, получавших L-аспа-рагиназы внутрибрюшинно в различных разовых дозах: А — доза L-аспарагиназы 500-1000 МЕ/кг; Б — доза L-аспарагиназы 2000-8000 МЕ/кг; В — доза L-аспарагиназы 12 000 МЕ/кг и более
Fig. 5. Survival curves of mice receiving intraperitoneal L-aspa-raginases at different single doses:
А — L-asparaginase dose of 500-1000 lU/kg; Б — L-aspara-ginase dose of 2000-8000 lU/kg; В — L-asparaginase dose of 12 000 lU/kg and more
j .medprint.ru
125
0
0
0
Таблица 4. Статистическая значимость различий кривых
выживаемости мышей при применении трех дозовых диапазонов 1_-аспарагиназ с различной ферментативной активностью
Кт сравниваемых пар ферментов, Диапазон доз, МЕ/кг
ммоль/л 500-1000 2000-8000 > 12 000
0,017 и 0,054 р = 0,001 р = 0,013 —
0,017 и 0,073 р < 0,001 р < 0,001 —
0,017 и 0,221 р < 0,001 р < 0,001 —
0,054 и 0,073 р < 0,001 р < 0,001 —
0,054 и 0,221 р < 0,001 р < 0,001 —
0,073 и 0,221 р < 0,001 р < 0,001 р = 0,160
ПРИМЕЧАНИЕ. Все р по лог-ранговому критерию.
Таблица 5. Статистические показатели взаимосвязи между Кт Ь-аспарагиназ и продолжительностью жизни мышей с лимфаденозом
Диапазон доз, МЕ/кг п г Р
500-1000 77 -0,47 < 0,001
2000-8000 98 -0,58 < 0,001
> 12 000 30 0,37 0,045
p = 0,013 при 2000-8000 МЕ/кг; для Ь-аспарагиназ с Кт = 0,073 и 0,221 ммоль/л значениеp < 0,001 (табл. 4). При применении Ь-аспарагиназ с Кт = 0,017 ммоль/л выживаемость мышей была значимо лучше по сравнению с двумя менее активными ферментами ф < 0,001). При лечении Ь-аспарагиназами в разовой дозе 12 000 МЕ/кг и выше различия в выживаемости между ферментами EwA и НгА не выявлены.
Следует отметить, что кривые Каплана—Мейера не дают оценку направленности взаимосвязи факторов риска и выживаемости или смертности. Именно по этой причине для оценки силы связи между выживаемостью и биохимическими свойствами фермента мы провели корреляционный анализ.
Расчет коэффициентов корреляции при диапазоне разовых доз 500-1000 МЕ/кг показал обратную зависимость между К^ и антипролиферативной активностью Ь-аспарагиназ: чем больше Кт, тем меньше ПЖ (г = -0,47; p < 0,001) (табл. 5). При разовой дозе 20008000 МЕ/кг данная взаимосвязь была подтверждена (г = -0,58; p < 0,001), а при высоких дозах отмечена обратная зависимость (г = 0,37; p = 0,045), возможно,
из-за неодинаковой выборки для сравнения: в дозах до 8000 МЕ/кг сравнивались все ферменты из 5 микроорганизмов, а в разовой дозе 12 000 МЕ/кг и более — только EwA и НгА. Поскольку в высокодозные группы по этическим соображениям не включены самые активные ферменты с Кт = 0,017 и 0,054 ммоль/л, при дозе 12 000 МЕ/кг и более ПЖ неизвестна, сравнение коэффициентов корреляции в группах с разным числом ферментов не вполне корректно. При корреляционном анализе в общей популяции из 205 животных, получивших ферменты в различных дозах, подтверждается обратная зависимость между Кт и ПЖ животного (г = -0,44;p < 0,001).
Помимо описанных выше расчетов для выявления влияния ферментативной активности на антипролифера-тивную была использована регрессионная модель Кокса. Хотя эта модель и не предлагает никакой меры для оценки силы связи, она хорошо отражает цензурированные наблюдения (излеченные животные, у которых истинная ПЖ неизвестна, показано только время до окончания наблюдения за ними). Регрессионная модель Кокса — полупараметрическая, т. е. она не позволяет вычислять непосредственно риск гибели от опухолевого процесса (неизлеченности), но показывает, во сколько раз он возрастает с увеличением значений предикторов — предсказывающих переменных в модели.
Кт и доза препарата были рассмотрены как номинальные признаки, когда каждая градация (т. е. каждая отдельная Кт или дозовый диапазон) сравнивается с референсной категорией. Это обусловлено отсутствием достоверных признаков линейности взаимосвязи Кт и дозы препарата с риском неизлеченности. При этом параметры модели — экспоненциальные коэффициенты — показывают, во сколько раз больше риск неизлеченности при данном значении признака по сравнению с референсным (табл. 6).
Результаты моделирования показали, что при разовой дозе 1000 МЕ/кг Кт Ь-аспарагиназы не имеет выраженной однонаправленной связи с антипролифера-тивной активностью. Так, для WsA с Кт = 0,054 ммоль/л прогноз риска неизлеченности меньше по сравнению с референсным ферментом с Кт = 0,017 ммоль/л (относительный риск [ОР] 0,28; 95% ДИ 0,12-0,65), а для НгА со значительно меньшей ферментативной активностью риск неизлеченности был больше (ОР 10,77; 95% ДИ 4,6-24,75). Для EwA с Кт = 0,073 ммоль/л анализ по
Таблица 6. Моделирование риска неизлеченности мышей с лимфаденозом с помощью регрессионной модели Кокса в зависимости от предиктора (Кт/дозы Ь-аспарагиназы)
Дозовый Число наблюдений Градации
диапазон, МЕ/кг всего излеченные Предиктор предиктора ОР (95% ДИ) р
500-1000 77 21 Кт 0,017* 1 —
0,054 0,28 (0,12-0,65) 0,003
0,073 4,84 х 106 (7,42 х 10-94-3,16 х 10106) 0,896
0,221 10,77 (4,69-24,75) < 0,001
2000-8000
98
45
Доза, МЕ/кг
0,017* 0,054 0,073 0,221 2000* 4000 8000
1
0,16 (0,03-0,75) 26,83 (9,82-73,33) 6,63 (2,72-16,18) 1
0,53 (0,26-1,05) 0,19 (0,08-0,44)
0,020 < 0,001 < 0,001
0,136 < 0,001
* Референсное значение.
ОР — относительный риск неизлеченности.
126
Клиническая онкогематология
К
т
данному параметру оказался статистически незначимым, поскольку влияние на выживаемость мышей отсутствует.
При средней разовой дозе Ь-аспарагиназ (20008000 МЕ/кг) на выживаемость мышей с лимфаденозом оказывала влияние и Кт, и доза. При увеличении разовой дозы до 8000 МЕ/кг риск неизлеченности, как и ожидалось, уменьшался (ОР 0,19; 95% ДИ 0,08-0,44). Что касается Кт, то зависимость противоопухолевой активности от Кт и в этой модели оказалась нелинейной. Использование WsA с К, = 0,054 ммоль/л снижало риск неизлеченности (ОР 0,16; 95% ДИ 0,03-0,75), а ферментов с К, = 0,073 и 0,221 ммоль/л — резко его увеличивало по сравнению с референсным ферментом с к, = 0,017 ммоль/л: ОР 26,83 (95% ДИ 9,82-73,33) и ОР 6,63 (95% ДИ 2,72-16,18) соответственно.
В представленных в табл. 6 результатах референсными были Ь-аспарагиназы с максимальной ферментативной активностью (К, = 0,017 ммоль/л). Если построить аналогичные модели, но использовать в качестве референсного фермент с минимальной активностью (К, = 0,221 ммоль/л), риск неизлеченности статистически значимо снижался для Ь-аспарагиназ с К, = 0,017 и 0,054 ммоль/л. При использовании эквивалентных доз ОР для самых активных ферментов ^рА и ЕсА) составил 0,09 (95% ДИ 0,04-0,21) и 0,15 (95% ДИ 0,06-0,37) для 500-1000 и 2000-8000 МЕ/кг соответственно; для WsA — ОР 0,03 (95% ДИ 0,01-0,08) и 0,02 (95% ДИ 0,01-0,11) соответственно. При этом для ферментов с К, = 0,017 ммоль/л по сравнению с НгА (К, = 0,221 ммоль/л) риск неизлеченности снижался в 7-10 раз в зависимости от примененной дозы, а для WsA — в 39-42 раза.
Таким образом, в изученном диапазоне доз по уменьшению риска неизлеченности мышей ферменты распределяются следующим образом: EwA (К, = 0,073 ммоль/л), НгА (К, = 0,221 ммоль/л), YpA/EcA (К, = 0,017 ммоль/л), WsA (К, = 0,054 ммоль/л). Следовательно, применение WsA, в отличие от математически предполагаемых исходов, снижает риск неизлеченности.
ОБСУЖДЕНИЕ
С момента выявления противоопухолевой активности L-аспарагиназ взаимосвязь антипролиферативного эффекта и кинетических параметров ферментативных реакций статистически не анализировали [14]. Оценка структурно-функциональных особенностей различных L-аспарагиназ позволила лишь сгруппировать ферменты по наличию или отсутствию активности и особенностям первичной структуры. На основании первичной структуры и локализации (внутриклеточной или периплазматиче-ской) было выделено два типа ферментов бактериального происхождения [24]. При этом постулировалось, что антипролиферативное действие проявляют только пери-плазматические бактериальные аспарагиназы II типа с существенно более высоким сродством к L-аспарагину.
Отсутствие данных по установлению взаимосвязи ферментативной и антипролиферативной активности L-аспарагиназ можно объяснить невозможностью сопоставления количественных показателей этих видов активности, полученных с ферментами различного происхождения, разными исследователями и в разнообразных экспериментах, что служит причиной существенной вариабельности указанных параметров. Так, в экспериментах, выполненных на разных
www .medprint.ru
культурах клеток, при различном числе клеток в момент внесения фермента, разной продолжительности коинку-бации и с разными методиками оценки цитотоксичности, получаются неодинаковые величины IC50 для одного и того же фермента. Это обстоятельство справедливо и для экспериментов in vivo: прививочная доза опухолевых клеток, схема применения и чувствительность опухолевой модели, как правило, определяют ответ на лечение.
Поскольку ретроспективные данные оказались несопоставимыми для анализа искомой взаимосвязи, нами в условиях одинакового дизайна выполнено проспективное исследование значимых показателей кинетической ферментативной и антипролиферативной активности in vitro и in vivo ряда новых L-аспарагиназ. В качестве основных сопоставляемых параметров были выбраны константа Михаэлиса (K^), прямо характеризующая сродство фермента к конкретному субстрату, и количественные параметры цитотоксической (IC50) или противоопухолевой активности (увеличение ПЖ, излечение, гибель от опухоли). Идентичность дизайна и одномоментность определения показателей активности позволяют считать результаты экспериментов полностью сопоставимыми.
Анализ зависимости цитотоксической активности от Km в ряду периплазматических L-аспарагиназ II типа (EcA, EwA, YpA и WsA) позволил выявить отчетливую тенденцию: с повышением Km увеличивалась IC50 (r = 0,66; p = 0,007).
Соотношение показателей выживаемости и Km для диапазона разовых доз 2000—8000 МЕ/кг активных L-аспарагиназ позволило выделить группы, сочетающие высокую или низкую ферментативную активность и высокую или низкую эффективность при соответственно низком или высоком числе неизлеченных животных. При данном диапазоне доз лучшими по выживаемости и излечению оказались L-аспарагиназы с Km = 0,017 и 0,054 ммоль/л по сравнению с L-аспарагиназами с меньшей ферментативной активностью, что подтверждено соответствующими значениями ОР в регрессионной модели Кокса. Под действием L-аспарагиназ ПЖ животных до гибели от опухоли или до прекращения наблюдения тем больше, чем меньше Km. При этом обратная связь показателей наиболее тесная при дозовом диапазоне 2000—8000 МЕ/кг (r = —0,58) и несколько меньше в других диапазонах дозы.
Исключение составляет RrA с K^ = 0,221 ммоль/л, которая обладает не столь низкой противоопухолевой активностью, как можно было бы предположить, исходя из гипотезы линейной зависимости биохимических свойств и антипролиферативного эффекта. Это проявилось как in vivo на модели лимфаденоза, так и в культуре клеток, где прослежена нелинейная зависимость IC50 от Km. Лучший профиль соотношения Km и антипролиферативной активности in vitro и in vivo показала WsA. Это продемонстрировано не только с помощью кривых Каплана—Мейера и попарным их сравнением лог-ранговым критерием, но и методом регрессии Кокса, позволяющим рассчитать ОР отсутствия излечения. По сравнению с препаратами L-аспарагиназ с Km = 0,017 ммоль/л у мышей с L5178 WsA риск неизлеченности статистически значимо снижался в 4—6 раз в случае применения разовых доз 500—1000 и 2000-8000 МЕ/кг (ОР 0,16 и 0,28 соответственно).
Таким образом, полученные результаты позволили установить прогностическую значимость активности ферментов, обозначенных в исследовании, для проявления
127
статистически значимой антипролиферативной активности in vitro и in vivo. В то же время статистический анализ показал, что для отдельных ферментов или дозовых диапазонов этот прогноз не является абсолютным. В частности, для диапазона высоких эффективных доз более 12 000 МЕ/кг такая взаимосвязь может отсутствовать. Очевидно, что сродство к L-аспарагину, хотя и служит в ряде случаев достоверным признаком активности L-аспарагиназ в отношении определенных типов злокачественных клеток, не является обязательным фактором в этой зависимости. В качестве возможных альтернативных причинно-следственных связей биологической активности в данной группе ферментов известны по крайней мере две: сродство к другим аминокислотам (прежде всего, к L-глутамину) и возможность связывания с другими эндогенными белками.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Множественность биохимических реакций, протекающих с участием различных Ь-аспарагиназ, остается предметом пристального внимания для выявления факторов прогноза эффективности противоопухолевых ферментов. Это особенно важно на этапе конструирования первичной аминокислотной последовательности и определения биохимических свойств потенциального ферментного препарата с оптимизированной фармакологической активностью, разработка и выведение на рынок которого направлены на улучшение результатов лечения пациентов с онкогематологическими заболеваниями.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Работа выполнена при частичной поддержке гранта благотворительного фонда «Протек».
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: В.С. Покровский, Е.М. Трещалина. Сбор и обработка данных: В.С. Покровский, М.В. Комарова, С.С. Александрова, М.В. Покровская, М.С. Ка-лишьян, С.Ш. Каршиева.
Предоставление материалов исследования: В.С. Покровский.
Анализ и интерпретация данных: В.С. Покровский. Подготовка рукописи: В.С. Покровский. Окончательное одобрение рукописи: В.С. Покровский, Е.М. Трещалина.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Rizzari C, Confer V, Stary J. et al. Optimizing asparaginase therapy for acute lymphoblastic leukemia. Curr. Opin. Oncol. 2013; 1(Suppl.): S1-9. doi: 10.1097/cc0.0b013e32835d7d8.
2. Salzer W, Seibel N, Smith M. Erwinia asparaginase in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Expert. Opin. Biol. Ther. 2012; 12(10): 1407-14. doi: 10.1517/14712598.2012.718327.
3. Gui W, Yang B, Shen Q. et al. Successful treatment with L-asparaginase based regimen for primary pulmonary NK/T cell lymphoma: a case report and review of the literature. Clin. Respir. J. 2014. doi: 10.1111/crj.12156; Online Version of Record published before inclusion in an issue.
4. Emadi A, Zokaee H., Sausville EA. Asparaginase in the treatment of non-ALL hematologic malignancies. Cancer Chemother. Pharmacol. 2014; 73(5): 875-83. doi: 10.1007/s00280-014-2402-3.
5. Tse E., Kwong Y.L. Practical management of natural killer/T-cell lymphoma. Curr. Opin. Oncol. 2012; 24(5): 480-6. doi: 10.1097/cc0.0b013e3283556142.
6. Avramis V.I., Panosyan E.H. Pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships of asparaginase formulations: the past, the present and recommendations for the future. Clin. Pharmacokinet. 2005; 44: 367-93.
7. Avramis V.I., Tiwari P.N. Asparaginase (native ASNase or pegylated ASNase) in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Nanomed. 2006; 1(3): 241-54.
8. Panosyan E.H., Grigoryan R.S., Avramis I.A. et al. Deamination of gluta-mine is a prerequisite for optimal asparagine deamination by asparaginases in vivo (CCG-1961). Anticancer Res. 2004; 24: 1121-5.
9. Rotoli B.M., Uggeri J., Dall'Asta V. et al. Inhibition of glutamine synthetase triggers apoptosis in asparaginase-resistant cells. Cell. Physiol. Biochem. 2005: 15(6): 281-92.
10. Tardito S., Uggeri J., Bozzetto C. et al. The inhibition of glutamine synthetase sensitizes human sarcoma cells to L-asparaginase. Cancer Chemother. Pharmacol. 2007; 60(5): 751-8.
11. Ankel E.G., Zirneski J., Ring B.J., Holcenberg J.S. Effect of asparaginase on cell membranes of sensitive and resistant mouse lymphoma cells. In Vitro. 1984; 20(5): 376-84.
12. Liu J.J., Dai X.J., Xu Y. et al. Inhibition of lymphoma cell proliferation by peroxisomal proliferator-activated receptor-y ligands via Wnt signaling pathway. Cell. Biochem. Biophys. 2012; 62(1): 19-27.
13. Fidler I.J., Montgomery P.C. Effects of L-asparaginase on lymphocyte surface and blastogenesis. Cancer Res. 1972; 32(11): 2400-6.
14. Покровский В.С., Лесная НА, Трещалина Е.М., Лукашева Е.В., Березов Т.Т. Перспективы разработки новых ферментных противоопухолевых препаратов. Вопросы онкологии. 2011; 57(2): 155-64.
[Pokrovskii V.S., Lesnaya N.A., Treshchalina E.M., Lukasheva E.V., Berezov T.T. Perspectives of development of new enzymatic antitumor agents. Voprosy onkologii. 2011; 57(2): 155-64. (In Russ.)]
15. Сидорук К.В., Покровский В.С., Борисова А.А., Омельянюк Н.М., Александрова С.С., Покровская М.В., Гладилина Ю.А., Богуш В.Г., Соколов Н.Н. Создание продуцента, оптимизация экспрессии и очистки рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011; 152(8): 179-84.
[Sidoruk K.V., Pokrovskii V.S., Borisova A.A., Omel'yanyuk N.M., Aleksan-drova S.S., Pokrovskaya M.V., Gladilina Yu.A., Bogush V.G., Sokolov N.N. Creation of producer, optimization of expression and purification of recombinant Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny. 2011; 152(8): 179-84. (In Russ.)]
16. Pokrovskaya M.V., Pokrovsky V.S., Aleksandrova S.S., Anisimova N.Yu., Andri-anovR.M., Treschalina E.M., PonomarevG.V., SokolovN.N. Recombinant intracellular Rhodospirillum riubrum L-asparaginase with low L-glutaminase activity and antiproliferative effect. Biochemistry (Mosc.). Suppl. B: Biomed. Chem. 2012; 6: 121-31.
17. Покровский В.С., Анисимова Н.Ю., Покровская М.В., Александрова С.С., Соколов Н.Н., Трещалина Е.М. Антипролиферативная активность рекомбинантной L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2011; 22(4): 24-31.
[Pokrovskii V.S., Anisimova N.Yu., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Sokolov N.N., Treshchalina E.M. Antiproliferative activity of recombinant Rhodospirillum rubrum L-asparaginase. VestnikRONTs im. N.N. Blokhina RAMN. 2011; 22(4): 24-31. (In Russ.)]
18. Трещалина Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека. М.: Практическая медицина, 2009. 171 с.
[Treshchalina E.M. Kollektsiya opukholevykh shtammov cheloveka. (Collection of human tumor strains.) Moscow: Prakticheskaya Meditsina Publ., 2009. 171 p.]
19. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. I. М.: Гриф и К, 2012: 642-57.
[Treshchalina E.M., Zhukova O.S., Gerasimova G.K., Andronova N.V., Garin A.M. Guidelines for preclinical studies of antitumor activity of medicinal agents. In: Guidelines for preclinical studies of medicinal agents. Part one. Moscow: Grif & K Publ., 2012. pp. 642-57.]
20. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. М.: Практическая медицина, 2005.
[Treshchalina E.M. Protivoopukholevaya aktivnost veshchestv prirodnogo proiskhozhdeniya. (Antitumor activity of substances of natural origin.) Moscow: Prakticheskaya Meditsina Publ., 2005.]
21. Chabner B.A., Longo D.L. Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice. Philadelphia: Lippincott-Raven, 2001.
22. Newson R. Parameters behind "nonparametric" statistics: Kendall's tau, Somers' D and median differences. Stata J. 2002; 2(1): 45-64.
23. Newcombe R.G. Two-sided confidence intervals for the single proportion: comparison of seven methods. Statist. Med. 1998; 17: 857-872.
24. Borek D., Jaskolski M. Sequence analysis of enzymes with asparaginase activity. Acta Biochimica Polonica. 2001; 48(4): 893-902.
128
Клиническая онкогематология
