CC BY
64
YflK 615.277.3.038
I.B. Showa, A.P. Poloskova, N.A. Oborotova, Z.S. Shprakh, O.L. Orlova, A. Yu. Baryshnikov
INFLUENCE OF LIPOSOMAL DOXORUBICIN AN CELLS LINE EXPRESSING ACTIV PGP170
N.N. Bloknin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
Multidrag resistance (MDR) remain one of the obstacle in the treatment of cancer.
Among the mechanisms of multidrag resistance Pgp 170 related resistance is one of the most investigated. Tumor cells that express Pgp 170 are the most resistant to anticancer drugs such as doxorubicin. An alternative strategy for partially overcoming MDR is use of liposomal anticancer drug. The cytotoxic activity of liposomal formulation of doxorubicin is more strong compared to free drug in resistance cells. Consequently, liposomal doxorubicin, partially overcame MDR in K562 cell line which express Pgp 170.
Key words: Pgp 170, liposomal doxorubicin, K562, MDR
И.Б. Шоу а, А. П. Полозкова, Н.А. Оборотова, З.С. Шпрах, О. Л. Орлова,
А.Ю. Барышников
ДЕЙСТВИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ДОКСОРУБИЦИНА НА КЛЕТКИ ЛИНИИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АКТИВНЫЙ РСР170
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является одним из препятствий при химиотерапии рака [10]. Среди механизмов множественной лекарственной устойчивости наиболее изученным является резистентность, связанная с Pgpl70 - продуктом гена МОК1. Клетки, экспрессирующие Pgpl70, более устойчивы к противоопухолевым препаратам, в частности к доксорубицину. Альтернативной стратегией для частичного преодоления МЛУ является использование липосомальных форм химиопрепаратов. Цитотоксическая активность доксорубицина, включенного в липосомы, в отношении резистентных клеток превышает активность свободного препарата. Следовательно, доксорубицин инкапсулированный в липосомы, частично преодолевает лекарственную резистентность клеток К562, экспрессирующих Р-гликопротеин.
Ключевые слова: Pgpl70, липосомальный доксорубицин, К562, МЛУ
ВВЕДЕНИЕ
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - одно из препятствий при химиотерапии рака [10]. Чаще всего лекарственная устойчивость обусловлена активностью белков, представляющих собой специальные «помпы» (Р-гликопротеин (Pgp 170), MRP, LRP, VMAT, ARX), интенсивно выкачивающие лекарственные препараты из опухолевых клеток [3; 5; 18]. Среди механизмов множественной лекарственной устойчивости наиболее изучена резистентность, связанная с Pgp 170 - продуктом гена
MDR1, который локализуется на длинном плече хромосомы 7 [8]. Pgpl70 - член суперсемейства АТФ-зависимых мембранных транспортных белков - является белком плазматической мембраны, состоит из 1280 аминокислот, условно разделен на две половины, каждая из которых имеет 6 трансмембранных участков и цитоплазматический сайт связывания АТФ [5]. Основная функция Pgp в организме -защита клеток от токсических воздействий. Гиперэкспрессия этого белка в опухолевых клетках приводит к уменьшению внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов вследствие усилен-
ного выброса лекарства из клетки [11; 13; 15; 18; 20]. Активность Р§р170 определяет резистентность опухолевых клеток ко многим противоопухолевым препаратам. В связи со значимостью Pgpl70 в МЛУ ведется поиск путей преодоления его активности. Среди заметных успехов в этом направлении - создание липосомальных форм химиопрепаратов, используемых в медицинской практике [7; 9; 12; 16; 17]. Липосомы, сливаясь с клеточной мембраной, могут изменять ее характеристики, приводя к дисфункции Pgpl70. Они представляют собой микросферы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, а мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что определяет их многие привлекательные качества: они нетоксичны, биодегра-дируемы, в определенных условиях могут поглощаться клетками или сливаться с клеточной мембраной [1; 4]. Большое количество работ посвящено изучению противоопухолевой активности липосомальных препаратов [6; 7; 9; 14; 19]. В последнее время появились работы, в которых предпринимаются попытки использовать данную систему для преодоления МЛУ. Была показана возможность преодоления МЛУ путем включения антрациклинов в липосомы [16].
Антрациклины, в частности, доксорубицин, -один из наиболее широко применяемых противоопухолевых препаратов в связи с его широким спектром действия и приемлемым терапевтическим индексом. Основная проблема при химиотерапии доксо-рубицином - его высокая токсичность. Липосомаль-ный доксорубицин усиливает цитотоксичность по сравнению со свободным доксорубицином и повышает терапевтический эффект препарата [2].
Цель данной работы - изучение влияния липо-сомальной и свободной формы доксорубицина на клетки клеточной линии К562 с гиперэкспрессией Р§р170 и клетки родительской линии К562.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение экспрессии Pgpl70 на пове рхности опухолевых клеток
Для определения иммунофенотипа клеток проводили реакцию иммунофлуоресценции. Сравнивали экспрессию антигенов на резистентной клеточной линии и чувствительной линии К562. Анализ иммунофенотипа клеток проводили на проточном цитофлуориметре (ЕАСЗСаНЬиг).
Для реакции иммунофлуоресценции клетки осаждали центрифугированием в течение 7 мин при 1000 об/мин. Клетки отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) дважды, разносили по пробиркам 250 тыс. клеток в 50 мкл, добавляли моноклональные антитела к исследуемым антигенам по 20 мкл, инкубировали 30 мин при + 4 °С. Затем отмывали в ФСБ, после чего добавляли ¥{гЪ)2 фрагменты, меченные ФИТЦ, и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации отмывали дважды в фосфатно-солевом буфере и добавляли 200 мкл 1 %-ного раствора формалина. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре.
Исследование функциональной активности Pgpl70
Функциональную активность Pgpl70 определяли по выбросу родамина 123. В качестве контроля использовали чувствительную линию К562. Клетки инкубировали с родамином в течение 15 мин при 37°С, далее дважды отмывали фосфатным буфером и инкубировали 30 мин в культуральной среде без красителя. Для блокирования выброса в среду с родамином и отмывочную среду добавляли верапамил (финоптин) в концентрации 10 мкг/мл. Интенсивность флуоресценции клеток анализировали на проточном цитофлуориметре.
Получение липосомального доксорубицина
Для получения липосомальной дисперсии доксорубицина использовали лецитин (Е-80, Lipoid, Германия), холестерин (Sigma, Германия), кардиолипин (Био-лек, Украина) в соотношении 12:6:1 соответственно. Соотношение доксорубицин (ICN Biomedicals, Icn. Германия, 0,03 мг/мл) - липиды 1 : 15.
Липидную пленку получали вакуум-упариванием раствора липидов в 95%-ном этиловом спирте при постоянном перемешивании с помощью роторного испарителя (ИР-1М). Липидную пленку смывали раствором доксорубицина (5 мл суспензии липосом содержит 0,15 мг доксорубицина). Затем зонифициро-вали липосомальную суспензию 30 мин в ультразвуковой ванне и центрифугировали 45 мин при 3000 об/ мин. После этого липосомальную дисперсию подвергали экструзии (Avanti Mini-Extruder, США). Размер липосом определяли с помощью прибора наносайзер (Nanosizer, Coulter Electronics, Inc., США).
Исследование действия липосомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующей активный Pgpl70
Влияние липосомального доксорубицина исследовали in vitro с помощью МТТ-теста, учитывая 1С50 для клеток линии К562, экспрессирующей Pgpl70. В качестве контроля использовали клетки чувствительной к препарату родительской линии К562.
Чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам определяли с помощью МТТ-теста. Для этого суспензию опухолевых клеток помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты (20000 клеток на пробу, объем инкубационной среды 200 мкл). Затем к пробам добавляли по 20 мкл липосомального доксорубицина и инкубировали в атмосфере воздуха с 5 % С02 при 37 °С в течение 72 ч. Препарат использовали в 10 концентрациях с шагом 2 (0,08; 0,04; 0,02;
0,01; 0,005; 0,0025; 0,001; 0,0005; 0,0002; 0,0001 мг/мл).
По окончании инкубации из каждой пробы отбирали по 100 мкл среды, вносили 20 мкл раствора МТТ (ICN Biomedicals, Icn., Германия, маточный раствор 5 мг/мл, конечная концентрация 1 мг/мл) и инкубировали в атмосфере воздуха с 5 % С02 при 37°С в течение 5 ч. Затем из лунок отбирали всю среду, добавляли 100 мкл DMSO и тщательно суспендировали до полного растворения гранул формаза-на, синтезированного клетками. Определяли оптическую плотность на спектрофотометре при длине
волны 540 ± 1 нм. Контролем служли пробы, содержащие свободный доксорубицин, а также все указанные реагенты, кроме свободного доксорубици-на и липосомального доксорубицина. Препарат считали эффективным, если накопление клетками фор-мазана снижалось не менее, чем на 50 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При определении поверхностных антигенов на резистентной клеточной линии и чувствительной линии К562 был выявлен высокий уровень экспрессии Р§р170 у клеточной линии, трансфецированной геном М1Ж1, тогда как у родительской линии экспрессии Р§р170 не наблюдалось. В остальном антигенный состав обеих клеточных линий не отличался (табл. 1).
При определении функциональной активности Рдр170 обнаружилось, что клетки, эспрессирующие Pgpl70, выбрасывали захваченный родамин, а родительская линия К562 краситель поглощала, но не выбрасывала.
Размер липосом составлял в среднем 116 нм (рис.1).
При определении дитотоксической активности препаратов показано, что 1С50 в отношении клеток чувствительной линии для свободного доксорубицина равна 0,0002 мг/мл, а для включенного в липо-сомы - 0,0005 мг/мл (рис. 2); для Pgpl70 положительных клеток 1С50 свободного доксорубицина 0,0025 мг/мл по сравнению с 0,0005 мг/мл липосомальной формой препарата (рис. 3).
ка. тишает {з*и851Аыоштвитюн
100 80 60 40 20 С
10 20 50 100 200 Я» 1К
Им (пт) >
Рис. 1. Распределение липосом доксорубицина по диаметру (усредненное по Гауссу), пт
Таким образом, клетки, экспрессирующие Р§р170, более устойчивы к свободному доксоруби-цину, чем чувствительные. Цитотоксическая активность доксорубицина, включенного в липосомы, в отношении резистентных клеток в 5 раз превышает активность свободного препарата. Следовательно, доксорубицин, инкапсулиррованный в липосомы, частично преодолевает лекарственную резистентность клеток К562, экспрессирующих Р-гликопро-теин. Этот эффект специфичен для клеток с МЛУ, поскольку активность доксорубицина в липосомаль-
Таблица 1
Экспрессия антигенов на поверхности резистентной и чувствительной клеточных линий К562
Клеточные линии Антигены
РйР-170 ША-БЛ СТ>1 СБ13 СБ15 СБ17 0032 СБЗЗ С034 СБ95 спт
К562 0,3 0,8 0,8 1,4 2,7 1,0 0,6 71,5 1,3 0,4 98,8
К562 (тс1г1) 96,6 3,5 1,2 20,1 5,9 4,4 5,7 76,8 1,2 1,6 99,6
концентрация Бох (мг)
Рис. 2. Влияние доксорубицина на выживаемость клеток линии К562:
■■■■ Липосомальный БОХ;
А Свободный БОХ
концентрация Dox (мг)
Рис. 3. Влияние доксорубицина на выживаемость клеток линии К562, экспрессирующей функционально активный PGP 170:
Ш Липосомальный DOX;
™*— Свободный DOX
ной лекарственной форме не превосходила активности свободного препарата в отношении клеток
родительской линии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 10.
2. Дудниченко А. С. Новые возможности в лечении рака / / Провизор. - 2000. - вып. № 7.
3. Невзглядова О.В., Шварцман П. Я. Множественная лекарственная устойчивость эукариотических клеток, обусловленная Р-гликопротеидом // Мол. биол. -1992. - Т. 26(3). - С. 487.
4. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. - 2001. - Т. 121, № 5, С. 464—475.
5. Ставровска А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / / Биохимия. - 2000. - Т. 65. - вып. 1. - С. 112-126.
6. В. W. Barry. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery // European Journal ofPharmaceuticalSciences.-2001.-Vol. 14.-P. 101-114.
7. Daryl C. Drummond, Olivier Meyer, Keelung Hong et al. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors // Pharmacological reviews. - Vol. 51, No. 4.
8. Fatouros D.G., Hatzidimitriou K., Antimisiaris S.G. Liposomes encapsulating prednisolone and prednisolone-cyclodextrin complexes: comparison of membrane integrity and drug release // European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2001. - Vol. 13. P. 287-296.
9. Fojo A., Lebo R. Localization of multidrudg resistance assiosiated DNA sequences to human chromosome 7 // Somatic cell mol. genet. - 1986. - Vol. 12. P. 415-420.
10 .Goldie J.H., Goldman A. J. Quantitative model for multiple levels of drug resistance in clinical tumors // Cancer Treat. Rep. - 1983. -Vol. 67. - P. 923-927.
11 .Goldstein L.J., Galski H., Fojo A.T. et al. Expression of multidrug-resistance gene in human cancer // J. Nat. Cancer Inst. - 1989. - Vol. 81. - P. 116-124.
12. Harrington K.J., Lewanski C.R., Stewart S. W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer. Part.2: Clinical development // Clinical Oncology. - 2000 - Vol. 12. - P. 16-24.
13.Harris A.L., Hochhauser D. Mechanism of multidrug resistance in cancer treatment // Acta-Oncol. - 1992. -Vol. 31(2).-P. 205-211.
14. Hideyoshi Harashima, Yasuo Shinohara, Hiroshi Kiwada. Intracellular control of gene trafficking using liposomes as drug carriers I I European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2001. - Vol. 13. - P. 85-89.
15.Jacques Ferte. Analysis of the tangled relationships between P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and the lipid phase of the cell membrane // Eur. J. Biochem. — 2000. - Vol. 267. - P. 277-294.
16. Oudard S., Thierry A., Jorgensen T.J., Rahman A. Sensitization of multidrug-resistant colon cancer cells to doxorubicin encapsulated in liposomes // Cancer Chemother. Pharmacol. - 1991. - Vol. 28(4). - P. 259-265.
17.Rahman A., Husain S.R., Siddiqui J. et al. Liposome-mediated modulation of multidrug resistance in human HL-60 leukemia cells // J. Nat. Cancer Inst. - 1992. - Vol. 84(24).-P. 1909-1915.
18. Rajesh Krishna, Lawrence D. Mayer. Multidrug resistance (MDR) in cancer mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs // European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2000. - Vol. 11. - P. 265-283.
19. Wang Y, Eksborg S., Lewensohn R. et al. In vitro cellular accumulation and cytotoxicity of daunorubicin and doxorubicin in resistant K562 cells // Anticancer Drugs. -1999. -10 (10).
20. Westerhoff H. V, Riethorst A., Jongsma A.P.M. Relating multidrug resistance phenotypes to the kinetic properties of their drug-efflux pumps 11 Eur. J. Biochem. - 2000. -Vol. 267. - P. 5355-5368.
