CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 1993 УДК 616-006.04-085.35-097
С.Н. Быковская, Н.В. Малахова, И.Ф. Абронина,
Т.А. Куприянова, Л.В. Демидов, А.В. Болвачева,
Л.Н. Буачидзе, О.М. Дронова
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO АУТОЛОГИЧНЫХ ЛИМ-ФОКИНАКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРНЫХ И МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ В ХОДЕ АДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
НИИ клинической онкологии
Как известно, стимуляция лимфоцитов интерлейкином-2 (ИЛ-2) приводит к генерации лимфокинакти-вированных киллеров (ЛАК), вызывающих деструкцию аутологичной и сингенной опухоли [9, 10, 18].
Культивирование лимфоцитов периферической крови человека в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 (рИЛ-2) с целью получения ЛАК-клеток лежит в основе метода адоптивной иммунотерапии (АИТ) онкологических больных. В соответствии с этим методом была разработана технология получения ^ЛАК-клеток в больших количествах (более чем 10 клеток), а также проведено лечение больных полученными in vitro противоопухолевыми киллерами в сочетании с рИЛ-2, которое оказалось наиболее результативным по сравнению с лечением только одним рИЛ-2 [19, 20].
Очевидно, что при проведении АИТ с использованием ЛАК-клеток необходимо определять цитотоксиче-скую активность полученных ЛАК-клеток персонально у каждого больного, как это было сделано L.M. Muul и соавт. [14 ], поскольку способность к генерации этих клеток у больных может быть различной вследствие неодинакового содержания в крови предшественников ЛАК-клеток [12, 15, 17], а также возможного присутствия супрессоров [1, 24], которые могут быть активированы под действием рИЛ-2 в процессе культивирования.
Кроме того, при АИТ в комбинации с рИЛ-2, очевидно, необходимо проводить оценку цитотоксической активности мононуклеарных клеток (МНК) крови после введения больным аутологичных ЛАК-клеток с рИЛ-2. Ранее было показано, что при лечении онкологических больных ЛАК-клетками в сочетании с рИЛ-2 наблюдалось увеличение противоопухолевой цитоток-
ORIGINAL
PEPERS
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
S.N. Bykovskaya, N. V. Malahova, I.F. Abronina,
T.A. Kupriyanova, L. V. Demidov, A. V. Bolvacheva, L.N. Buachidze, O.M. Dronova
CYTOTOXIC ACTIVITY OF IN VITRO CULTURED AUTOLOGOUS LYMPHOKINE-ACTIVATED KILLER AND MONONUCLEAR CELLS IN CANCER PATIENTS’ BLOOD DURING ADOPTIVE IMMUNOTHERAPY
Research Institute of Clinical Oncology
Stimulation of lymphocytes with interleukin-2 (IL-2) is known to lead to generation of lymphokine-activated killers (LAK) that cause destruction of autologous and syndeneic tumors [9, 10, 18].
Cultivation of human peripheral blood lymphocytes in the presence of recombinant IL-2 (rIL-2) aimed at production of LAK cells is a basis of adoptive immunotherapy (AIT) of cancer patients. A techique of culture of LAK cells in great amount (more than 106 cells) has been developed, and treatment of patients has been undertaken with in vitro cultured antitumor killers in combination with rIL-2 which has produced a better effect as compared to therapy with rIL-2 alone [19, 20].
AIT with LAK cells evidently requires cytotoxic activity of the LAK cells to be determined in every patient as it was done by L.M. Muul et al. [14], because patients’ ability to generate these cells may vary depending upon levels of LAK cell progenitors in the patients’ blood [12, 15, 17], as well as upon presence of suppressors [ 1, 24 ] that may be activated by rIL-2 during the culture.
Besides, AIT in combination with rIL-2 requires assessment of cytotoxic activity of blood mononuclear cells (MNC) after administration of autologous LAK cells with rIL-2 to patients. It was shown previously [23 1 that treatment of cancer patients with LAK cells in combination with rIL-2 increased antitumor cytotoxic activity of MNC correlating in some patients with partial tumor response [23 [.
High doses of the lymphokine (105 U per kg body weight) are usually administered in AIT with rIL-2, which leads to unwanted adverse reactions in the patients [14]. However, M.S. Mitchell et al. [13] have
сичности МНК, коррелирующее у некоторых пациентов с частичной регрессией опухоли [23 ].
Обычно АИТ в сочетании с рИЛ-2 используется с применением высоких доз этого лимфокина (105 ЕД на 1 кг массы тела), которые приводят к нежелательным побочным эффектам у больных [14]. Однако M.S. Mitchell и соавт. [13] удалось добиться снижения токсического эффекта рИЛ-2 у больных меланомой при введении им более низких доз этого препарата в сочетании с циклофосфамидом.
В ОНЦ РАМН было проведено лечение 7 больных диссеминированной меланомой кожи и рака почки ЛАК-клетками в сочетании с рИЛ-2 отечественного производства [21 ].
Нами была изучена цитотоксическая активность культивируемых in vitro ЛАК-клеток, а также противоопухолевая активность МНК периферической крови, определяемая в разные сроки проведения АИТ. Кроме этого, проводилось электронно-микроскопиче-ское исследование ультраструктуры ЛАК-клеток на стадии их взаимодействия с опухолевыми клетками-мишенями.
Материал и м етоды. Лечение онкологических больных ЛАК-клетками и рИЛ-2 проводилось по схеме, предложенной S.A. Rosenberg [19]. Лечение АИТ получали 6 больных меланомой: 3 мужчин в возрасте 38, 35, 47 лет (больные № 2, 5, 6) и 3 женщин 53, 40 и 33 лет (больные № 1, 3, 4), а также 1 больная (№ 7) раком почки 36 лет. Все больные имели метастазы опухоли.
В зависимости от клинического состояния больных их подвергали 2—5 курсам еженедельной АИТ. В начале каждой недели в первые ,3 дня у больных брали кровь методом лейкофереза с целью получения из нее ЛАК-клеток. В последующие 2—3 дня недели проводили курс АИТ, состоящий из 2—3 внутривенных инъекций (2,5— 13,6) 10 аутологичных ЛАК-клеток с 75 ООО ЕД рИЛ-2 ("Биоген", Рига), активность которого была равна активности аналога (Biological response molifier Program unit).
Для получения МНК кровь онкологических больных подвергали лейкоферезу на сепараторе крови "Fenwall CS-3000" (США). Полученную лейкомассу смешивали с раствором полиглюкина в соотношении 1:1 и отстаивали при комнатной температуре. Через 1 ч собирали верхний слой, обогащенный МНК. Процедуру повторяли, смешивая полиглюкин с осадком, содержащим преимущественно гранулоциты и эритроциты, а также небольшую примесь МНК, чтобы избежать потерь последних. Полученные таким образом МНК отмывали и культивировали в концентрации 1—3-10 клеток на 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2% прогретой телячьей эмбриональной сыворотки, 2% 0,1 M IIEPES, 1 % 200 мМ L-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина и 1000 ЕД/мл рИЛ-2. Культивирование проводили в роллерных бутылях вместимостью 3 л ("New Brunswik Scientific", США) на установке той же фирмы при вращении бутылей со скоростью 0,5 об/мин. Активированные клетки собирали через 48 ч культивирования, отмывали средой и вводили внутривенно больному в 200 мл физиологического раствора, содержащего 75 000 ЕД рИЛ-2.
Кровь из вены больных брали в разные сроки проведения АИТ. МНК периферической крови получали методом центрифугирования на фиколле — верографине с плотностью 1,077 г/см . Выделенные МНК дважды отмывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640.
Для определения цитотоксической активности ЛАК-клеток были использованы NK-резистентные — Mel-1, HeLa и NK-чувствитель-ные — К562 и Molt-4 опухолевые клетки-мишени (КМ), культуральные линии которых были предоставлены Е.С. Ревазовой (лаборатория экспериментальных моделей ОНЦ); (0,5—4,0) 10 КМ инкубировали 1 ч при 37°С с 50—200 мКи Na2 Сг^ и трижды отмывали в среде RPMI-1640; 10“* меченных ^*Cr КМ смешивали с 510^ эффекторных клеток и инкубировали в 96-луночных микропластинах в течение 18 ч при 37°С в атмосфере 5% С02- Каждый тест ставился в триплетах. По окончании инкубации пробы центрифугировали 7 мин при 300 об/мин и отбирали половину супернатанта для
managed to reduce rIL-2 toxic effect in melanoma patients by administration of lower doses of the drug in combination with cyclophosphamide.
Seven patients with disseminated skin melanoma and kidney cancer were treated with LAK cells in combination with rIL-2 of domestic production at the CRC of the RAMS [21 ].
We studied cytotoxic activity of in vitro cultured LAK cells and antitumor activity of peripheral blood MNC as determined at different stages of AIT. Besides, we performed an electron microscopic study of LAK cell ultrustructure during interaction with tumor target cells.
Materials and Methods. The treatment of cancer patients with LAK cells and rlL-2 was carried out according to
S.A. Rosenberg’s schedule [19]. AIT was undertaken in 6 patients with melanoma including 3 males at the age of 38, 35, 47 (patient No 2, 5, 6) and 3 females of 53, 40 and 33 years of age (patient No 1,
2, 4), and 1 patient with kidney cancer, a 36-year old female (No 7). All the patients had tumor metastases.
The patients received 2 — 3 cycles of weekly AIT depending upon their performance status. For the first 3 days of every week the patient blood samples were processed by leukapheresis to isolate LAK cells. For the next 2 — 3 days the patient received AIT consisting of 2 — 3 intravenous injections of (2.5 — 13.6)x 10 autologous LAK cells with 75,000 U of rIL-2 ("Biogen", Riga) whose activity was equal to that of the analog (Biological Response Modifier Program Unit).
To obtain MNC the cancer patients’ blood was subjected to leukapheresis using a Fenwall CS-3000 (USA) blood separator. The obtained leukocytes were mixed with polyglukine solution (1:1) and allowed to stay at room temperature. One hour later the upper layer enrtiched with MNC was harvested. The procedure was repeated by mixing polyglukine with the precipitate containing mainly granulocytes and erythrocytes with a small amount of MNC in order to avoid MNC loss. The MNC obtained were theii washed and cultured at a concentration of (1 — 3)xl0 cells per ml in RPMI-1640 with 2% heat-activated calf fetal serume, 2% 0.1M HEPES, 1% 200 mM L-glutamine, 40 ^g/ml gentamycin and 100 U/ml rIL-2. The cultivation was carried out in 3 1 roller hotter ("New Brunswik Scientific", USA) using a unit of the same production at a rotation rate of 0.5 rpm. The activated cells were harvested after 48 h culture and washed in the medium to be administered intravenously to patients in 200 ml saline solution containing 75,000 U of rIL-2.
The patients’ venous blood was taken at different stages of AIT. Peripheral blood MNC were isolated by rentrufugation with phycolli — verographin at a density 1.077 g/cm . The isolated MNC were washed two times to be resuspended in RPMI-1640.
To determine cytotoxic activity of the LAK cells we used NK-resistant Mel-1, HeLa and NK-sensitive K562 and Molt-4 tumor target cells (TC) whose culture lines were provided by E.S. Revazova (Laboratory of Experimental Models of the CRC); (0.5 — 4.0)xl0 TC were incubated i h at 37“C with 50 — 200 mCi of Na2 Cr^ and washed three tirrnis in RPMI-1640; 10^ ^*Cr-labeled TC were then mixed with 5x10 effector cells to be incubated in 96-well microplates for 18 h at 37°C in 5% CO2 atmosphere. Every test was set up in triplets. After incubation the samples were centrifuged 7 min at 300 rpm, half of the supernatant was harvested to evaluate its radioactivity. Spontaneous label yield (LY) was assessed in samples containing TC only, maximal yield — in samples containing TC with 1 % sodium dodecylsulfate solution. Percentage of Cr specific yield was
calculated by a formula:
.. .. LYexper - LYspont
% cytotoxicity = ... F--------tt; ---xl00.
LYmax - LYspoilt
The isotope spontaneous yield in control samples was 20 — 25%.
To study ultrastructure of LAK cells in interaction with TC the former were added to suspension of TC (Mel-1) (25:1) and
centrifuged at 1000 rpm for 1 min. The precipitate was fixed with
2.5% glutaric aldehyde immediately on centrifugation or after 30 and 180 min incubation at 37°C in 5% CO2 atmosphere. The fixed
Таблица 1 Tablel
Цитотоксическая активность ЛАК-клеток онкологических больных в ходе АИТ Cytotoxic activity of LAK cells in cancer patients receiving AIT
больного Курс АИТ N1 лейкофереза Цитотоксическая активность ЛАК-клеток против КМ, %
Mel-1 <P K562 <P HeLa <P
1 2 3 4 5 6 7 — — 47,3±7,4 58,2+5,1 18,1+2,6 17,4±5,0 41,8+2,4 36,1+2,4 28,0+0,8 58,7±6,7 51,2+9,2 14,2+1,8 38,4+1,3 75,8+3,7 55,6+4,6 26,3+1,4 52,4±4,1 47,5+2,9 20,4+3,7 24,0+1,0 49,7+2,0 35,0+119 15,6+0,6
1 1 2 3 55,8±5,2 69,2+2,7 78,8+7,4 0,01 (+) 0,05 (+) 57,6±9,2 56,6+4,3 91,8±5,6 0,01 (+) 16,8+1,8 68,4+2,8 47,7+3,0 0,002 (-) 0,05 (+)
II 1 2 3 76,4+1,7 49,3+3,5 38,0+1,4 0,02 (+) H.T./NT 48,3+2,2 19,2+4,0 0,01 (-) 33,6+1,2 H.T7NT 19,8+4,8 0.01 (-) 0,01 (-)
III 1 3 48,2+5,0 19,2±3,1 0,05 (-) 36,8+1,1 54,6+4,8 0,05 (-) 18,6+3,6 12,4+2,5 0,001 (-) 0,001 (-)
IV 1 54,1+5,4 61,8±6,6 H.T./NT
2 I 1 2 3 48,2+5,0 77,0+3,8 56,1±4,8 0,05 (+) 36,8+1,1 93,0+7,5 59,4+3.1 0,05 (+) 18,6+1,6 H.T./NT 66,8+4,7 0,001 (-) 0,05 (+)
II 1 3 62,5+3,2 56,0±3,5 43,6+1,9 56,8+3,4 30,9+1,9 29,2+2,1 0,01 H 0,01 (-)
3 I 1 2 3 34,1+3,4 66,9+2,8 9,6±2,1 0,02 (+) 0,001 (+) 0,05 (-) 57,4+6,8 69,5+4,4 36,3±3,8 0,01 (+) 0,002 (+) 0,01 (+) 25,7+6,0 41,0+1,9 14,0+3,8 0,01 (+)
II 1 2 34,8+1,9 24,0+4,1 0,01 (+) H.T./NT H.T./NT 31,6+0,8 H.T7NT 0,05 (+)
4 I 1 2 57,8+2,9 60,9±7,1 0,01 (+) 0,01 (+) 14,4+2,3 40,1±4,2 0,001 (-) 9,5+1,1 54,5+2,8 0,001 (-) 0,001 (+)
5 I II III 1 2 3 2 62,3+5,5 59,5+1,9 40,8+6,0 78,2±6,5 0,05 (+) 0,01 (+) 0,01 (+) 75,6+4,9 84,1+3,1 76,6+2,0 71,8±7,1 H.T./NT H.T./NT 39,2+2,5 34,1±3,3 0,05 (-) 0,02 (-)
6 1 3 65,1+5,3 0,01 (+) 80,7+1,4 0,01 (+) H.T./NT
7 1 2 13,9±3,7 0,02 (-) 61,7+2,0 0,001 (+) H.T./NT
Patient No AIT cycle Leukapheresis No Mel-1 < P K562 < P HeLa < P
Cytotoxic activity of LAK cells (%) against TC
Примечание. Здесь и в табл. 2 Н.Т. — не тестировали.
р — достоверность различий между значениями цитсггоксической активности ЛАК-клеток в ходе АИТ. Увеличение (+) либо снижение (—) цитотоксичности ЛАК-клеток по сравнению с исходным уровнем.
Note. Here and in table 2 NT stands for ’not tested’.
p, significance of difference between values of LAK cell cytotoxic activity during АГГ. Increase (• ) or decrease (-) in cytotoxic activity of LAK cells as compared with baseline.
определения радиоактивности. Спонтанный выход метки (ВМ) оценивали в пробах, содержащих только КМ, максимальный — в пробах, содержащих КМ с добавлением 1 % раствора додецилсульфата натрия. Процент специфического выхода Сг вычисляли по формуле:
ВМ опыт — ВМ спонтанный
% цитотоксичности = -гг:----------—--------------х 100.
ьм макс — спонтанный
Спонтанный выход изотопа в контрольных пробах составлял 20— 25%.
Для ультраструктурного исследования взаимодействия ЛАК-кле-ток с КМ ЛАК-клетки добавляли к суспензии КМ (Mel-1) в соотношении 25:1 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 1 мин. Осадок фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида сразу после центрифугирования или через 30 и 180 мин инкубации при 37”С в атмосфере 5% С02- Фиксированные препараты обрабатывали 1 % OSO4, проводили через ряд спиртов возрастающей концентрации и заливали смесью эпон-812—аралдит. Ультратонкие срезы
preparations were treated with 1 % OsO^ and a series of alcohols at escalated concentration to be embedded in epon-812 — araldit mixture. Ultrathin sections were contrasted with 1 % uranyl acetate aqueous solution and stained with lead citrate to be studied using a JEM-100B electron microscope.
Estimates of killer cytotoxic activity were processed statistically to determine mean values and the standard mean error (SME). Significance of difference between the mean values was estimated by Student’s Mest.
Results and Discussion. The experiments carried out during AIT are presented schematically (fig. 1). Study of immunologic reactivity during AIT discovered increased or decreased cytotoxicity of LAK cells and MNC as compared with the baseline. The cytotoxic effects in these cases were summed up with respect to cytotoxic activity of the three types of tumor TC.
Цитотоксичность ЛАК-клеток LAK-cell cytotoxicity
Mon Tue Wed| Thu Fr Sat
Лейкофе- Лейкофе- Лейксфе- Забор крови
рез N= 1 рез Nfe 2 рез Nfc 3 из вены
Leukaphe- Leukaphe- Leukaphe-resis No1 resis No2 resis No3 I Venous
blood take
Введение ЛАК-клеток LAK-cell administration
Рис. 1. Схема проведения АИТ.
контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата и докрашивали лимоннокислым свинцом. Срезы просматривали в электронном микроскопе 1ЕМ-100В.
При статистической оценке результатов цитотоксической активности киллерных клеток вычисляли значение средней величины и стандартную ошибку показателя средней (5МЕ). Достоверность разницы между средними значениями определяли по ^-критерию Стью-дента.
Результаты и обсуждение. Приведена общая схема (рис. 1) проведения экспериментов при АИТ. При оценке иммунологической реактивности в ходе АИТ наблюдались случаи повышенной либо сниженной по сравнению с исходным уровнем цитотоксичности ЛАК-клеток и МНК. Цитотоксический эффект в этих случаях был суммирован по цитотоксической активности трех типов опухолевых КМ.
Результаты опытов по изучению цитотоксичности ЛАК-клеток приведены в табл.1. После I курса АИТ при тестировании цитотоксичности ЛАК-клеток больных № 1—7 было отмечено 19 случаев увеличения и 6 случаев снижения цитотоксического эффекта против КМ МеМ, К562 и НеЬа (больные № 1—4 и 7). После II курса лечения наблюдалось 3 случая повышения цитотоксической активности ЛАК-клеток против КМ Ме1-1 и НеЬа (больные № 1, 3) и 6 случаев со сниженной цитотоксической активностью против КМ К562 и НеЬа (больные № 1, 2, 5). После III курса лечения наблюдался только 1 случай увеличения цитотоксичности против Ме1-1 (больной № 5) и 4 случая снижения цитотоксической активности ЛАК-клеток против К562 и НеЬа (больные № 1, 5). После IV курса лечения, полученного больным № 1, изменения противоопухолевой цитотоксичности ЛАК-клеток не происходило.
Результаты опытов по изучению цитотоксичности МНК приведены в табл.2. Оценка цитотоксичности МНК проводилась до и после каждого курса АИТ. Цитотоксичность МНК (в отличие от ЛАК-клеток) оценивали отдельно для каждого типа КМ. После I курса АИТ отмечено 10 случаев усиления цитотоксичности МНК против МеМ, Мо1М и К562 (у больных № 1—3, 5—7) и 2 случая снижения против МоИ-4 (у больных
Results of experimental study of LAK cytotoxicity are presented in table 1. The LAK cytotoxicity tests showed 19 instances of increased and 6 instances of decreased cytotoxicity against Mel-1, K562 and HeLa (patients No 1 — 4 and 7) after the 1st AIT cycle; 3 instances of increased LAK cytotoxic activity against Mel-1 and HeLa TC (patients No 1, 3) and 6 instances of decreased cytotoxic effect against K562 and HeLa (patients No 1, 2, 5) after the 2nd AIT cycle; a single instance of increased cytotoxicity against Mel-1 (patient No 5) and 4 instances of decreased cytotoxic activity of LAK cells against K562 and HeLa (patients No 1, 5) after the 3rd AIT cycles; and no changes in the LAK cell cytotoxic activity after the 4th AIT cycle received by patient No 1.
Results of experimental study of MNC cytotoxicity are presented in table 2. The MNC cytotoxicity was assessed before and after every AIT cycle. In contrast to the LAK cells the MNC cytotoxic activity was evaluated individually for each TC type. There were 10 instances of increased MNC cytotoxicity against Mel-1, Molt-4 and K562 (patients No 1 — 3, 5 — 7) and 2 instances of decreased cytotoxicity against Molt-4 (patients No 4, 5) after the 1st AIT cycle; 7 instance of increased cytotoxicity against Mel-1, Molt-4 and HeLa (patients No 1, 3 — 5,7) and 3 instances of decreased cytotoxic effect against Mel-1 and Molt-4 (patients No 2, 6) after the 2nd AIT cycle; 5 instances of increased MNC cytotoxicity (patients No 1, 2, 5) against Mel-1, Molt-4 and 1 instance of decreased cytotoxicity against Molt-4 (patient No 3) after the 3rd AIT cycle; patient No 1 showed decreased cytotoxicity against Mel-1 after the 4th AIT cycle.
The ultrastructural study showed that after 30 min interaction the LAK cells formed close contacts with tumor TC involving a considerable portion of lymphocyte surfaces. The LAK cytoplasm demonstrated asymmetric position of the nuclei and organelles: areas com-taining mitochondria, secretory granules, lysosomes and Golgi’s apparatus were oriented towards TC contact zones (fig. 1,2). There were LAK cells interacting with more than one TC. The cyetoplasm in such lymphocytes also showed a tendency of its contents to move towards the TC contact zones (see fig. 2). The LAK cell populations contained lymphocytes forming uropodes which was evidence of active movement of effector cells (see fig. 3, a). In the uropode cytoplasm there were mitochondria, cisterns of rough-surface endoplasmic reticulum, numerous polyribisomes and elements of vesicular apparatus (see fig. 3, b). It is evident that treatment of cancer patients with LAK cells and rIL-2 may produce a considerable effect on their immunity. P.A. Paciucci et al. [16] showed that slow administration of rIL-2-activated cells to patients with progressive cancer led to enhancement of cytotoxic activity of secondary LAK cells. I. Wang et al. [23 ] observed increased cytotoxicity of natural killers and antiboby-specific cytotoxicity against renal cancer after administration of autologous LAK cells and low doses of rIL-2 to renal cancer patients. W.J. Urba et al. [22 ] reported that intraperitoneal administration of LAK cells and rIL-2 to 20 patients with abdominal tumors resulted in increasing cytotoxicity of peritoneal cells.
Таблица 2
Цитотоксическая активность МНК онкологических больных в ходе АИТ до (А) и после (В) АИТ Cytotoxic activity of MNC of cancer patients receiving AIT before (A) and after (В) a cycle
Table 2
Nfc
больно-
го
Курс
АИТ
Цитотоксичность МНК (в %) против КМ
Mel-1
В
Molt-4
В
HeLa
В
1
IV
V
I
II
III
I
II
I
II
III
I
II
III
22,3+1,0 20,6+4,3 19,3+1,1 22,3+1,8 16,5+3,0 24,1+3,2 23,1+3,4 8,2+1,2 14,0+3,1 H.T./NT 4,1±3,2 5,4+3,4 0,0 32,7+3,1 5,4+5,3 H.T./NT 34,9+5,0 31,0+3,5 26,0+2,8 —1,9+4,1
36,7+1,5 28,3+3,0 29,4+2,4 0,04+2,0 H.T./NT 26,0+3,4 27,0+3,4 17,7+2,3 21,7±2,6 12,4+6,0 0,0 1,4+1,2 -7,4 33,7+5,0 26,8+4,8 18,3+5,3 31,5+5,2 22,6+3,4 H.T./NT 10,9+3,0
< 0,001 (+) > 0,1 < 0,001 (+) < 0,001 (-)
> 0,1 > 0,1
< 0,05 (+)
> 0,1
>0,1
> 0,1 < 0,01 (+)
> 0,1
< 0,05 В
< 0,001 (+)
37,8±5,0 —1.4±1,2 37,4+3,2 H.T./NT 23,9±1,5 12,7+1,2 10,2±1,6 0,0 7,5±2,2 8,4+1,1 H.T./NT 29,2+5,8 0,0 61,8±1,6 49,9+0,7 9,8±4,8 61,4±2,9 67,3±4,3 53,7+2,9 11,3+2,6
30,1+1,9 6,8±1,7 55,4±7,5 52,7±1,2 H.T./NT 57,6±4,7 -28,3+3,4 30,1+4,0 H.T./NT 43,3+5,1 H.T./NT 11,5+3,1 7,5±2,0 50,6+6,2 70,2+8,3 17,6±4,0 90,1+9,4 52,2±1,3 H.T./NT 11,5±3,1
>0,1 < 0,05 (+)
< 0,001 (+) < 0,001 (-) < 0,001 (+)
< 0,001 (+)
< 0,01 (-)
> 0,1 < 0,01 (-)
< 0,05 (+)
< 0,01 (+)
< 0,02 l+j
< 0,01
< 0,001 (+)
11,8±2,5 6,4+1,7 7,7+3,6 H.T./NT 31,6±4,5 21,1+3,3 37,8+4,0 23,3+1,4 10,7±1,2 0,0 49,0+12,0 20,3+2,1 0,0 18,5+1,3 22,4+3,4 H.T./NT 26,6±2,6 H.T./NT H.T./NT -5,5±2,1
21,6±3,6
17,6±2,4
12,6+4,1
28,6+9,5
H.T./NT
27,8+1,5
H.T./NT
24,9+2,9
33,9±1,0
34,0+3,6
8,2±3,4
25,6+3,4
13,2+2,8
72,0+10,6
H.T./NT
H.T./NT
75,5±15,5
27,7+3,0
H.T./NT
27,8+2,4
< 0,01 (+) < 0,01 (+) > 0,111
> 0,1
< 0,001 (+) < 0,001 (+) < 0,001 (-) > 0,1 < 0,001 (+) < 0,01 (+)
< 0,05 (+)
< 0,001 (+)
Patient
No
В
В
В
AIT
cycle
Mel-1
Molt-4
HeLa
MNC cytotoxicity (%) against TC
Примечание, p — достоверность различий между значениями цитотоксической активности МНК в крови больных до и после АИТ. Увеличение (+) либо снижение (-) цитотоксичности МНК по сравнению с исходным уровнем.
N о t е. р, significance of difference between values of MNC cytotoxic activity in patients’ blood before and after AIT. Increase (+) or decrease (-) in MNC cytotoxic activity as compared to baseline.
N9 4, 5). После II курса отмечено усиление цитотоксичности МНК у 7 больных против МеЫ, МоИ-4 и НеЬа (больные № 1, 3—5, 7) и 3 случая снижения против МеЫ и МоИ-4 (больные № 2, 6). После III курса увеличение цитотоксичности МНК наблюдалось в 5 случаях (у больных № 1, 2, 5) против Ме1-1 и МоИ-4, в 1 случае отмечено снижение цитотоксичности против МоИ-4 (у больного № 3). После IV курса АИТ у пациента № 1 отмечена сниженная цитотоксичность против МеЫ.
Ультраструктурное исследование показало, что через 30 мин взаимодействия ЛАК-клетки образуют с опухолевыми КМ плотные контакты, в которые вовлечена значительная часть поверхности лимфоцита. В цитоплазме ЛАК-клеток наблюдается асимметричное расположение ядра и органелл: участки, содержащие митохондрии, секреторные гранулы, лизосомы и аппарат Гольджи, ориентированы в зону контакта с КМ (рис. 2, 3). Выявляются ЛАК-клетки, взаимодействующие одновременно более чем с одной КМ. В цитоплазме таких лимфоцитов наблюдалась также характерная реориентация содержимого цитоплазмы в зону контакта с КМ (см. рис. 3). В популяциях ЛАК-клеток встречаются лимфоциты, образующие уроподы, что свидетельствует об активном движении эффекторных клеток (см. рис. 3, а). В цитоплазме уроподы выявляются митохондрии, цистерны шероховатого эндо-
In our study in order to obtain LAK cells with sufficiently high antitumor cytotoxicity we used MNC isolated by leukapheresis from cancer patients’ peripheral blood that were further cultured with rIL-2 for 48 h because it had been shown previously that after 72 h culture LAK cells exhibited a 1.5 — 2-fold decrease in cytotoxicity due to activation of antitumor immunity suppressors [7 ].
We showed that LAK cells isolated from blood of patients treated with autologous LAK cells and rIL-2 had increased antitumor cytotoxicity in 76% of the tests.
The 2nd and 3rd AIT cycles resulted in lower percentage of cases of enhanced cytotoxicity while the fraction of decreased cytotoxicity was rising.
The 1st, 2nd and 3rd AIT cycles mainly caused increase in cytotoxicity of peripheral blood lymphocytes.
The cytotoxicity enhancement in LAK cells and MNC during the 2nd and 3rd AIT cycles may be due to elevation of cytotoxic T-lymphocyte and IAK precursors in patients’ blood as a result of administration of autologous LAK cells and rIL-2. This may account for partial (to 50%) tumor response in patient No 2 after the first 2 cycles of treatment which allowed complete surgical removal of the tumor [21 ].
The fall in cytotoxocity of LAK cells and MNC in some patients during the 1st, 2nd, 3rd and 4th AIT cycles, as well as the rise in the number of such obser-
Рис. 2. Ультраструктура ЛАК-клеток через 30 мин взаимодействия с опухолевой КМ Ме1-1.
а — общий вид. В цитоплазме лимфоцита наблюдается реориентация ядра (Я) и цитоплазматических органелл. х 20 ООО.
Митохондрии (М), аппарат Гольджи (АГ) ориентированы в зону контакта с КМ; Ь — фрагмент цитоплазмы ЛАК-клетки. х 60 ООО. СГ — секторальные гранулы.
Fig. 2. LAK cell ultrastructure after 30 min interaction with tumor TC.
a, general view. The lymphocyte cytoplssm demonstrates reorietation of the nucleus (N) and cytoplasmic organelles. x20,000. Mitochondria (M), Golgi's apparatus (GA) are oriented towards the TC contact; b, a LAK cell cytoplasm fragment. x60,000, SG, sectoral granules.
плазматического ретикулума, многочисленные полирибосомы, а также элементы везикулярного аппарата (см. рис. 3, Ь).
Очевидно, что введение ЛАК-клеток с рИЛ-2 может оказывать существенное влияние на состояние иммунной системы онкологических больных. Р.А. Paciucci и соавт. [16] показали, что медленное введение активированных рИЛ-2 клеток больным с прогрессирующим раком приводило к усилению цитотоксической активности вторично получаемых ЛАК-клеток. I.Wang и соавт. [23 ] после введения больным раком почки аутологичных ЛАК-клеток и малой дозы рИЛ-2 наблюдали усиление дитотоксичности естественных киллеров в крови этих людей, а также антителозависимой цитотоксичности против клеток рака почки. W.J. Urba и соавт. [22 ] показали, что внутрибрюшинное введение
vations by the end of treatment may be due to the ability of "old" LAK cells to kill newly administered LAK cells [8 ] or due to activation of suppressor cells. We showed previously [7 ] that human peripheral blood suppressors inhibit generation of LAK cells in elderly donors.
Electron microscopy of the LAK cells at the stage of contact with tumor TC discovered features supporting secretory mechanism of the interaction. The LAK cell cytoplasm contained numerous secretory granules, Golgi’s apparatus and demonstrated characteristic organelle reorientation described by the authors elsewhere [2 — 6] for cytotoxic T-lymphocytes. The LAK cells under study were characterized by the presence of uropodes in some of them. The preponderance of lymphocytes with uropodes in LAK cell populations
Рис. 3. ЛАК-клетка, образующая уроподу (У) и взаимодействующая с опухолевой КМ.
а — общий вид. х 9000; Ь — в цитоплазме уроподы (У) выявляются митохондрии (М), секторальные гранулы (СГ), цистерны эндоплазматического ретикулума (ЭР), полирибосомы (П), центриоль (Ц), мультивезикулярное тельце (/Iff) х 35 ООО.
Fig. 3. LAK cell forming uropode (U) and interacting with tumor TC.
a, general view. x9,000; b, in the uropode cytoplasm there are mitochondria (M), sectoral granules (SG), endoplasmic reticulum (ER) cisterns, polyribosomes (P), centriole (C), multiveslcular carpuscles (MG). x35,000.
ЛАК-клеток и рИЛ-2 20 больным с опухолями брюшной полости приводило к усилению цитотоксичности перитонеальных клеток.
В настоящей работе для получения ЛАК-клеток с достаточно высокой противоопухолевой цитотоксично-стью были использованы МНК периферической крови онкологических больных, выделенные методом лейко-фереза, которые культивировали с рИЛ-2 в течение 48 ч, поскольку ранее было показано, что через 72 ч культивирования цитотоксичность ЛАК-клеток уменьшается в 1,5—2 раза вследствие активации супрессоров противоопухолевого иммунитета [7 ].
Нами было показано, что при генерации ЛАК-клеток, полученных из крови пациентов после инъекций аутологичных ЛАК-клеток и рИЛ-2, в 76% тестов наблюдалось повышение противоопухолевой цитотоксичности этих клеток.
После II и III курсов АИТ снижалось число случаев усиления цитотоксичности ЛАК-клеток и возрастало число случаев уменьшения их цитотоксичности.
После I, II и III курсов АИТ в основном отмечались случаи увеличения цитотоксичности лимфоцитов периферической крови.
(upto 80%) was previously described by P.A. Pacuicci et al. [16] who observed this phenomenon in peripheral blood of cancer patients after AIT.
Our findings are in agreement with results of ultrastructural study of LAK cell conjugates with SNB-92 human glioma cells performed by G.R. Hook et al. In the opinion of these investigators tumor TC lysis is associated with local exocytosis of effector lymphocyte vacuoles towards zones of contacts with tumor cells, and is similar to lysis mechanism of cytotoxic T-lympocytes and natural killer cells [11].
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Абронина И.Ф., Ананьев B.C. // Бюл. экспер биол. — 1988.
— № 10. — С. 473.
2. Bykovskaya S.N., Rytenko A.N., Rauschenbach M.O. et al. // Cell. Immunol. — 1978. — Vol. 40. — P. 164.
3. Bykovskaya S.N., Rytenko A.N., Rauschenbach M.O. et al. // Ibid. — P. 175.
4. Bykovskaya S.N., Sergeev A.V., Rauschenbach M.O. et al. // Scand. J. Immunol. — 1980. — Vol. 11. — P. 261.
5. Bykovskaya S.N., Kupriyanova T.A., Rayschenbach M.O. et al. // Sov. Sci. Rev. — 1984. — Vol. 4. — P. 41.
6. Bykovskaya S.N., Shevelev A.A., Kupriyanova T.A. // Biomed. Pharmacother. — 1988. — Vol. 42. — P. 461.
Усиление цитотоксичности JIAK-клеток и МНК в ходе I, а в случае МНК II и III курсов АИТ может быть связано с увеличением в крови больных предшественников цитотоксических Т-лимфоцитов и ЛАК-клеток за счет введения аутологичных ЛАК-клеток и рИЛ-2. Этим можно объяснить частичную (до 50%) регрессию опухоли у больного № 2 после первых двух циклов лечения, вследствие чего стало возможным ее полное оперативное удаление [21 ].
Снижение цитотоксичности ЛАК-клеток и МНК, наблюдаемое у некоторых больных в ходе I, II, III и IV курсов АИТ, а также увеличение числа таких случаев к концу лечения может быть связано со способностью "старых" ЛАК-клеток убивать вновь введенные ЛАК-клетки [8 ] либо с активацией супрессорных клеток. Ранее нами [7] было показано, что супрессоры, присутствующие в периферической крови человека, препятствуют образованию ЛАК-клеток пожилых доноров.
Электронно-микроскопическое исследование ЛАК-клеток на стадии контакта с опухолевой КМ выявило признаки, свидетельствующие о секреторном механизме взаимодействия. В цитоплазме ЛАК-клеток были обнаружены многочисленные секреторные гранулы, аппарат Гольджи, а также отмечена характерная реориентация органелл, описанная нами ранее для цитотоксических Т-лимфоцитов [2—6 ]. Одной из особенностей изученных ЛАК-клеток являлось наличие уро-под у части некоторых клеток. Преобладание лимфоцитов с уроподами в популяции ЛАК-клеток (до 80%) было описано ранее Р.А. Paciucci и соавт. [16 ], наблюдавших эти морфологические изменения в периферической крови онкологических больных после АИТ.
Полученные нами данные согласуются с результатами ультраструктурного исследования конъюгатов ЛАК-клеток с опухолевыми клетками глиомы человека SNB-92, проведенного G.R. Hooku с соавт. По мнению этих авторов, лизис опухолевых КМ связан с локальным экзоцитозом везикул эффекторных лимфоцитов в зону контакта с опухолевой клеткой и является сходным с механизмом лизиса цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток [11].
© Коллектив авторов, 1993 УДК 616-018-006.04-076.4-085.015
Н.Т. Райхлин, Ю.Л. Володина, А. Г. Перевощикоо,
Б.П. Копнин
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ТОЛСТОЙ КИШКИ ЛИНИИ LIM 1863 ПРИ РАЗВИТИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
НИИ клинической онкологии, НИИ канцерогенеза
Одно из наиболее перспективных направлений в изучении резистентности опухолей человека к химиотерапии связано с открытием так называемой множественной лекарственной устойчивости — МЛУ (англ. — Multidrug Resistance — MDR), обусловливаемой повышением функции Р-гликопротеина (Р170). Кодиру-
7. Bykovskaya S.N., Abronina I.F., Kupriyanova Т.А. II Ibid. — Vol. 44. — P. 333.
8. Callacher G., Findlay J., Al-Azzawi F.A. II Immunology. — 1989. — Vol. 66 — P. 471.
9. Grimm E.A., Mazumder A., Chang H.L. et al. 111. exp. Med.
— 1982. — Vol. 155. — P. 1823.
10. Grimm E.A., Rosenberg S.A // Limphokines. Ed. E. Pick. — New York, 1984 — P. 279.
11. Hook G.R., Greenwood M.A., Barba D. et al. // J. nat. Cancer Inst. — 1988. — Vol. 80. — P. 171.
12. lton JC, Tilten B., Kumagai C. et al. // J. Immunol. — 1985. — Vol. 134. — P.802.
13. Mitchel M.S., Kempf R. A., Harel W. et al. Hi. clin. Oncol. —
1988. — Vol. 6 — P. 402.
14. Muul L.M., Nason-Burchenal JC, Carter C.S. et al. // J. Immunol. Methods. — 1987. — Vol. 101. — P. 171.
15. Ortaldo J.O., Mason A., Overton К. II J. exp. Med. — 1986. — Vol. 264. — P. 1193.
16. Paciucci P.A., Holland J.E., Glidwell O. et al // J. clin. Oncol.
— 1989. — Vol. 7. — P. 869.
17. Ramsdell F.J., Lindemann R.A., Shau H. et al. II Cell. Immunol.
— 1988. — Vol. 116. — P. 287.
18. Rosenstein М., Yron J., Kaufman Y. et al. // Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 1946.
19. Rosenberg S./I., Jjotze M.T., Muul L.M. et al. // New Engl. J. Med. — 1987. — Vol. 316. — P. 889.
20. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Yang J.C. et al. // Immunol. Today.
— 1990. — № 11. — P. 113.
21. Trapeznikov N.N., Yavorsky V.V., SyrkinA.B. et al. II All Union Cancer Res. Center Transaction Collection. — 1990. — № 1. — P. 31.
22. Urba W.J., Clark J.W., Steis R.G. et al II J. nat. Cancer Inst. —
1989. — Vol. 81. — P. 602.
23. Wang I., Wall A., Gordon B. et al. // Amer. J. Med. — 1987. — Vol. 83. — P. 1016.
24. Yu A., Watts H., Jaffe N. et al. // New Engl. J. Med. — 1977.
— Vol. 297. — P. 121.
Поступила 30.01.92 / Submitted 30.01.92
N.T. Raikhlin, J.L. Volodina, A.G. Perevoschikov,
B.P. Kopnin
ELECTRON MICROSCOPIC STUDY OF DIFFERENTIATION OF HUMAN COLONIC CARCINOMA LIM 1863 DURING DEVELOPMENT OF MULTIDRUG RESISTANCE
Research Institute of Clinical Oncology, Research Institute of Carcinogenesis
A most promising field of research of human tumor resistance to chemotherapy is associated with discovery of multidrug resistance (MDR) caused by enchanced functioning of P-glycoprotein (PI70). The membrane protein PI70 coded by the mdrl gene acts like an energy-dependent pump that throws off from cells a wide
