CC BY
51
ляют интерес еще и потому, что если у больного с ПМЗН первая опухоль локализуется в молочной железе (толстой кишке, эндометрии, яичниках, желудке), то следует ожидать повышенной частоты идентичных единственных опухолей у их родственников 1-й степени родства.
В рамках мультифакториальной модели была проведена оценка наследуемости к проявлению ПМЗН. Исходя из частоты поражения ПМЗН среди родственников 1-й степени родства больных этим заболеванием и распространенности ПМЗН среди населения был вычислен коэффициент корреляции, который оказался равным 0,387±0,045, и на его основе получен коэффициент наследуемости подверженности к проявлению ПМЗН, который оказался равен 77,4±9,0 %. Это свидетельствует о существенном вкладе генетических факторов в формирование такого патологического признака, как первично-множественное злокачественное новообразование.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белев Н. Ф. Клинико-генетические исследования рака толстой кишки: Автореф. дио. ... канд. мед. наук.— М., 1985.
2. Первично-множественные злокачественные опухоли / Под ред. Н. П. Напалкова, Я- В. Бохмана, В. Ф. Семиглазова.—
' Л., 1987,— 169 с.
3. Muller Hj„ Weber W. Familial cancer.— Basel, 1985.
4. Larson T. S., Sjogren T. A. // Acta physhiat. scand.— 1954,— Vol. 89.— P. 44—47.
5. Li F. P. 11 Cancer Res.— 1988.— Vol. 48.— P. 5381—5386.
6. Muller Hj., Weber W. Familial Cancer.— Basel, 1985.— P. 103—112.
7. Schilakraut ]., Rlsch М., Thompson W. D. et al. // Amer. J. hum. Genet.— 1986.— Vol. 39, N 3.— P. 171.
8. Weber-Stadelmam W. // Anticancer Research.— 1986.— N 6,— P. 701—704.
Поступила 4.01.90
GENETIC ASPECTS OF MULTIPLE PRIMARY MALIGNANT NEOPLASMS
V. Yu. Setchuk, T. P. Kazubskaya, N. F. Belev, M. D. Nefedov, P. F. Garjkavtseva
Familial-population and genetic-correlation analysis of 305 patients with multiple primary malignant neoplasms (MPMN) has been conducted. It was shown that relatives are affected with more than one tumor in 2 % of them. The frequency rate of different tumor types among 1817 the first-degree relatives exceeds 7-fold the analogous frequency rate in population. The assessment, obtained among segregation frequency of different tumor types in various family groups do not respond to the hypothesis of monogenous determination that presents evidence in favour of multifactor nature of MPMN. However, on the basis of genealogical and phenotype data hereditary diseases could be identified in 17,3 % of cases that indicates genetic heterogeneity of MPMN. Genetic correlations between breast and gastric cancer, endometrium and colon cancer (0,80 and 0,90, respectively) were calculated and that evidences for high genetic community. On the basis of genetic correlations the greatest genetic burden was shown in families with MPMN in contrast to those with solitary one cancer. It is proved that the coefficient of heritable predisposition to MPMN makes 77,4 % that indicates significant contribution of genetic factors in MPMN incidence.
'С', КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1900 УДК 615.37
Н. Н. Трапезников, В. В. Яворский, А. Б. Сыркин,
В. Л. Кассиль, С. Ю. Быковская, Л. А. Буачидзе,
Л. В. Демидов, Е. А. Черемушкин, 3. Г. Кадагидзе,
Е. В. Савельева, Н. И. Переводчикова, В. А. Горбунова,
Л. С. Бассалык, Е. А. Соловьева, В. Г. Кондратьев,
О. М. Дронова, Т. А. Куприянова, 3. В. Павлова
ПЕРВЫЙ ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
НИИ клинической онкологии
В настоящее время интерлейкин-2, и в частности рекомбинантный его вариант (РИЛ-2), применяется как один из мощных иммуноте-рапевтических препаратов, индуцирующих образование лимфоцитов, «вооруженных» против опухолевых клеток (лимфокин-активированные клетки — ЛАК) [1]. По-видимому, с появлением интерлейкина-2 и с доказательством роли ЛАК в противоопухолевом иммунитете найдено одно из важных звеньев адоптивной иммунотерапии.
Во всем мире в настоящее время идет интенсивное изучение интерлейкина-2. Клинический опыт применения интерлейкина-2, и в том числе рекомбинантного, насчитывает несколько сот больных. Наметились определенные пути введения и вырабатываются конкретные показания к применению данного препарата в клинике.
Во Всесоюзном онкологическом научном центре АМН СССР с января 1988 г. проводятся клинические и экспериментальные исследования рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2), синтезированного в Институте органического синтеза АН Латвийской ССР (г. Рига) под руководством
Э. Я. Грен. РИЛ-2 получен генно-инженерной технологией, причем для его синтеза была использована кишечная палочка.
В результате предклинического токсикологического изучения рекомбинантного интерлейкина-2 установлены летальные, токсические и переносимые дозы препарата для мышей, крыс, кроликов и собак. Выявлено, что наиболее чувствительным видом животных к токсикологическому действию препарата являются кролики (МПД= = 1 • 10?. МЕ/кг).
Собаки, мыши и крысы переносили однократно внутривенно препарат в дозах 5-10ь— 1,2-107 МЕ/кг. При ежедневном в течение 45 дней внутривенном введении для них переносимой оказалась доза, равная 1-105 МЕ/кг, для мышей при ежедневном в течение 30 дней внутрибрюш-ном введении — ЫО6 МЕ/кг.
Установлены следующие виды токсичности, лимитирующие применение препарата: гастроинтестинальная (рвота, понос, кишечное кровотечение), гематотоксичность (лейкопения в первые часы после применения; лейкоцитоз, моноцитоз, лимфоцитопения, тромбоцитопения, увеличение числа ретикулоцитов на 1—28-е сутки наблюдения), нефро- и гепатотоксичность (увеличение мочевины и креатинина; повышение активности трансаминаз и щелочной фосфатазы, увеличение билирубина в сыворотке крови). В специальных исследованиях по нейротропным свойствам РИЛ-2 установлено действие на ЦНС с повышением эмоциональной напряженности животных.
Препарат обладает пирогенностью, которая зависит от дозы РИЛ-2.
Патоморфологические изменения в органах животных при однократном и курсовом введении интерлейкина-2 у обоих видов животных проявлялись однонаправленно и выражались в дистрофических изменениях в печени, почках, легких, тонком кишечнике, а также в эндокринных и герминативных органах.
Специфический эффект интерлейкина обнаруживался в виде гиперплазии лимфатических фолликулов белой пульпы селезенки, лимфатических узлов, а также образования лимфомакро-фагальных инфильтратов в большинстве органов. Выраженность гиперпластических процессов в лимфопролиферативных органах собак не зависела от дозы интерлейкина и сохранялась в поздние сроки наблюдения; реактивные изменения в лимфоузлах и селезенке мышей исчезали к 45-м суткам. Патоморфологические изменения в органах проявлялись на фоне выраженных сосудистых нарушений: отеков, плазморрагий, геморрагий. Токсический эффект интерлейкина зависел от величины примененной дозы препарата и был наиболее выражен в печени и почках. Дистрофические и некробиотические изменения клеток паренхимы печени и ретикулоэндотелиальной системы, а также гломерулярного и тубулярного аппарата почек были четко выражены при всех дозах и не имели обратимого характера.
Всего было проведено лечение 17 больных: у 15 наблюдались диссеминированные меланомы кожи (преимущественная локализация метастазов в мягкие ткани, лимфоузлы, легкие), 2 имели распространенный рак толстой кишки и множественные метастазы рака почки в лимфатические узлы (в данной работе не оценивались).
Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови больных и доноров выделяли по методу Boyum [2].
Для получения лимфокинактивированных киллеров (ЛАК) использовали МНК периферической крови больных, выделенные из лейкомассы после цитофереза на сепараторе CS-3000 («Trave-nob «Fenwalb, США) в отделении переливания крови ВОНЦ АМН СССР. С этой целью лейкомас-су смешивали с раствором полиглюкина (Красноярский завод медпрепаратов) в соотношении 1:1 и отстаивали при температуре 37 °С. Через 60 мин собирали верхний слой, обогащенный МНК. Процедуру повторяли, смешивая полиглю-кин с осадком, содержащим преимущественно гра-нулоциты и эритроциты. Полученные МНК отмывали и культивировали в концентрации 1—ЗХЮЬ клеток на 1 мл среды RPM1-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР), содержащей 2 % прогретой телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС) , 2 % L-глютами-на («Flow», Англия), 1 % HEPES («Microbiological associates», США), 40 мкг/мл гентами-цина (Харьковское производственное химико-фармацевтическое объединение «Здоровье») и 1000 ед/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (МНТК «Биоген», Рига). Культивирование проводили в роллерных бутылях («New Brunswick Scientific», США) на установке фирмы «New Brunswick Scientific» (США) в режиме
0,5 об/мин. Активированные клетки собирали через 48—72 ч культивирования, отмывали средой РРМ1-1640 и вводили больному в 200 мл физиологического раствора, содержащего 75 000 ед рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2).
В качестве опухолевых клеток-мишеней (КМ) для оценки цитотоксичности МНК и ЛАК использовали клетки линий К562, МоИ-4, Не1а Ме11. 0,5—2,5-106 КМ инкубировали в 0,5 мл среды, содержащей 50—100 мкКи №251Сг04 в течение 60 мин при температуре 37 °С, трижды отмывали и вносили в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций (Ленинградский завод медицинских полимеров). Эффекторные клетки добавляли к КМ в соотношении 50:1, 25:1, 12:1. Общий объем содержимого лунки составлял 0,2 мл. Через 18 ч инкубации при 37 °С 5 % СОг планшеты центрифугировали при 1000 об/мин в течение 7 мин и забирали по 100 мкл содержимого лунок для определения радиоактивности. Цитотоксический эффект определяли по формуле:
опыт — спонтанный выход ^ 0
полный лизис — спонтанный выход °’
где опыт — выход изотопа из КМ при добавлении эффекторных клеток, спонтанный выход — высвобождение изотопа интактными КМ, полный лизис — выход изотопа из КМ, разрушенных '
1 % раствором додецилсульфата натрия.
Терапию больных проводили по следующим схемам (см. таблицу): В 1-й группе (3 больных) вводили высокие дозы РИЛ-2 (600— 1200 тыс МЕ) в 2 приема внутривенно капельно по 3—5 дней подряд. После перерыва 2 сут производили забор крови для приготовления ЛАК, которые вводили ежедневно в течение 3 сут.
Все 3 больных перенесли лечение крайне тяжело. Были отмечены резкая тахикардия, выраженное и стойкое снижение артериального давления, плохо поддающееся коррекции допами-ном, олигурия, гипертермия, многократная изнуряющая рвота, диарея. У 1 больного внезапно возникли сильные («морфинные») боли в опухолевых узлах, в которых наступил видимый глазу некроз. Боли в узлах возникли у 2 других пациентов. Во всех наблюдениях отмечены тахип-
Характер токсичности при внутривенном введении РИЛ-2 (приведено число больных с реакциями и осложнениями)
Метод введения РИЛ-2
Реакции и осложнения системное применение высоких доз по 75 000 MB с ЛАК инфузионное введение ВЫСОКИХ доз
Гипертермия, озноб 3 6 5
Кожные проявления (зуд, 3 7 5
герпес)
Головные боли 3 7 5
Расстройства желудочно- 3 7 5
кишечного тракта (тошнота, рвота, диарея)
Полисерозит 3 1 —
Падение АД 3 7 —
Повышение АД 3 7 4
Нарушение системы гемо- 3 7 5
стаза (ДВС-синдром, анемия
Нарушения функции почек 3 7 —
Нарушения функции пече- 3 7 —
ни
ноэ, ощущение нехватки воздуха. Резко снизилась фибринолитическая активность крови; у 2 больных на скеннограмме легких выявлена тромбоэмболия ветвей легочной артерии. В 1—2-е сутки у всех трех больных появились трещины слизистой полости рта, кровоточивость десен, герпес на губах.
Курс лечения удалось провести только 1 раз, в 1 наблюдении не удалось закончить даже 1-й курс. В дальнейшем мы были вынуждены отказаться от этой методики применения РИЛ-2. Во всех случаях лечебный эффект был неудовлетворительным. У 1 больного наблюдался быстрый распад наибольших узлов метастазов меланомы, однако через 2 нед отмечен бурный рост опухоли. Кроме того, у этого больного развился сепсис. У 2 больных положительного эффекта также не выявлено.
Во 2-й группе (7 больных) вводили РИЛ-2 по 75 000 МЕ/сут в сочетании с ЛАК. Такой метод введения больные переносили несколько легче. Отмечались только гипертермия, умеренная олигу-рия, рвота, диарея. Однако у 3 больных развился отек легких (у одного на фоне остро возникшего перикардита и асцита), двум потребовалось проведение чрескатетерной высокочастотной ИВЛ во вспомогательном режиме (в 1 наблюдении непрерывно в течение 3 сут).
Проведенное лечение дало следующие результаты: у 1 больного регрессия опухоли составила более чем 50 %, и стало возможным оперативное вмешательство; в одном случае достигнуто уменьшение размеров опухоли и площади поражения до 30 %, сменившееся через 2 нед дальнейшим прогрессированием; в остальных наблюдениях эффекта не зарегистрировано.
В 3-й группе (5 больных) РИЛ-2 вводили в дозе 350—600 тыс. МЕ инфузионно непрерывно в течение 5 сут. Переносимость этой дозы в указанном режиме введения оказалась удовлетворительной. У больных возникали рвота, диарея, гипертермия, незначительная олигурия, головные боли. Ни у одного больного не было нарушений витальных функций, падения артериального давления. У 4 больных отмечали тенденцию к повышению АД.
Все же следует отметить, что во всех наблюдениях быстро развивались коагулопатические изменения, свидетельствующие о развитии ДВС-синдрома.
Регрессия более чем 50 % опухоли отмечена у 1 больной, у 4 больных эффекта зарегистрировано не было. Необходимо подчеркнуть, что из 13 больных с меланомой кожи 6 при дальнейшем прогрессировании опухолей были переведены на различные варианты химиотерапии, хотя перед началом лечения РИЛ-2 все они проявляли устойчивость к различным химиопрепаратам. Положительный эффект зарегистрирован у 2 больных: в одном случае отмечена 100 % регрессия метастатических очагов меланомы кожи нижней конечности после регионарной химиотерапии; в другом наблюдении из 8 подкожных и внутрикожных узлов меланомы в различных отделах туловища остался 1 (в последующем иссечен). Обе эти больные наблюдаются свыше 1 года.
Таким образом, на 1-м этапе клинического исследования установлено, что переносимой дозой
при струйном введении является доза 600 000 МЕ, после введения которой наблюдались тем не менее токсические проявления воздействия препарата на сердечно-сосудистую систему, почки, печень и свертывающую систему крови, которые сохраняются свыше 2 нед.
Установлено, что начальной дозой инфузионно-го введения препарата является 600 000 МЕ за 24 ч введения.
Особого внимания заслуживает токсичность, проявившаяся у всех больных даже при использовании небольших доз (75 000 МЕ) в сочетании с ЛАК.
При струйном введении препарата можно наблюдать резкое падение или подъем артериального давления; нарушение функции сердца, перикардит, ухудшение ЭКГ, отек легких; ДВС-син-дром, снижение фибринолитической активности крови; нарушение функции почек и печени с недостаточностью их деятельности; анемию и лейкопению.
У всех больных, как показали тщательные гематологические исследования, после первого и последующих курсов введения РИЛ-2 наблюдается снижение уровня гемоглобина (на 25—30 %), количество эритроцитов (на 1 —1,5-1012). Сразу после введения РИЛ наступает лейкопения до
1 тыс. клеток и ниже и держится в течение 3—4 ч.
В дальнейшем происходит увеличение количества лейкоцитов за счет выброса в кровь палочкоядерных нейтрофилов (40—50 %).
Количество лимфоцитов снижается сразу же после введения интерлейкина-2 и держится в течение 24 и более часов.
Во всех случаях отмечалась только лимфопе-ния. Лейкоцитоз наблюдался только за счет нейтрофилов.
Уровень тромбоцитов снижался у отдельных больных после повторных курсов введения интер-лейкина-2. После отмены препарата количество тромбоцитов быстро возвращалось к норме и доходило до цифр выше исходных.
Исследование иммунологического фенотипа лимфоцитов с помощью панели моноклональных антител (МКА) показало, что после введения интерлейкина-2 (ИЛ-2) падает процент Т-лимфо-цитов, который к норме не возвращается. Последующие инъекции ИЛ-2 не влияют на процент Т-клеток.
Введение ИЛ-2 вызывает появление на поверхности клеток молекул, ответственных за прикрепление клеток (интегринов). Так, после каждой инъекции ИЛ-2 резко возрастает экспрессия ЬРА-1 —антигена, определяемого МКА ИКО-11.
Экспрессия СРЗ-рецептора, ответственного за прикрепление комплекса антиген — антитело, резко повысилась после первого введения ИЛ-2 у
2 больных и при последующих инъекциях не изменилась, однако у одной больной на 4-й день упала ниже необходимого уровня.
ИЛ-2 вызывал активацию лимфоцитов, которую зарегистрировали у двух из трех больных по реакции МКА ИКО-1. После каждой инъекции ИЛ-2 процент антигенположительных клеток повышался.
Однако введение ИЛ-2 существенным образом не повлияло на процент цитотоксических (супрес-
сорных) клеток (ОКТ8+). Процент К-клеток повышался после инъекций ИЛ-2 только у одного из трех больных.
Исследование маркеров предшественников Т-клеток (ИКО-20, ИКО-40) показало, что после их подъема после первой инъекции наступает истощение, которое усиливается при каждой последующей инъекции. Через 1 нед после начала лечения происходит истощение в крови Т-лимфо-цитов. По-видимому, они оседают в лимфоидных органах. В крови отсутствуют предшественники Т-лимфоцитов. Целесообразно увеличить интервал между введением ИЛ-2, для того чтобы не вызывать быстрого истощения циркулирующих Т-лимфоцитов.
Через 3—4 дня после инъекции ИЛ-2 целесообразно вводить Т-активин для активации предшественников.
Культивирование мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных раком почки, с меланомой и доноров в присутствии в среде 1 тыс. ед/мл РИЛ-2 приводит к генерации ЛАК-клеток, цитотоксичность которых достигает максимума через 48 ч после стимуляции и достоверно не различается в группах больных и доноров против панели опухолевых клеток-мишеней Мел-1, Hela и Molt 4 (р>0,01). Высокий уровень активности ЛАК доноров сохраняется через 72 ч культивирования, в то время как у больных меланомой происходит снижение цитотоксичности.
Оценка количества ЛАК-клеток, полученных после культивирования в роллерных бутылях в течение 48 ч„ показала, что выход стимулированных РИЛ-2’ лимфоцитов составляет 59,2± ±2,9 % от исходного. Эти данные соответствуют результатам Muul и соавт. [3], которые получали 64,9±5,0 % клеток через 72—96 ч культивирования в аналогичных условиях при использовании РИЛ-2 фирмы «Cetus» со специфической активностью 3—4ХЮ6/мг.
Курс ЛАК-терапии состоял из циклов, включающих 3 цитофереза (понедельник — вторник — среда) и 3 последующих введения активированных клеток и 75 тыс. ед РИЛ-2 (среда — четверг—пятница). Периодичность циклов определялась субъективным и клиническим состоянием больного. Проведение курса сопровождалось оценкой цитотоксической активности ЛАК и МНК периферической крови больного против панели перевиваемых опухолевых клеток-мишеней. Полученные данные свидетельствуют о высокой способности генерировать ЛАК у всех наблюдаемых больных.. Результаты оценки активности МНК не позволяют сделать общего вывода, так как схемы лечения различались у отдельных больных продолжительностью интервалов между циклами и их количеством. Однако у всех больных отмечались изменения уровня цитотоксичности МНК в курсе иммунотерапии, связанные, по-видимому, как с иммуномодулирующим воздействием ЛАК и РИЛ-2, так и с количественными изменениями клеточного состава периферической крови.
Выводы. 1. Рекомбинантный интерлейкин-2 рижского производства требует дальнейшего экспериментального и клинического изучения.
2. При струйном введении доза 600 тыс. МЕ и выше дает неприемлемый уровень токсичности
с грубыми нарушениями функций сердечно-со-судистой системы, печени, почек, органов кроветворения и иммуносистемы.
3. Стабильный клинический эффект от применения одного интерлейкина-2 рижского производства не был получен.
4. Инфузионное введение РИЛ-2, по предварительным данным, допустимо в дозах не выше 600 тыс. МЕ/сут.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rosenberg S. A., Lotze М. Т., Muul L. М. et. al. // New Eng. J. Med.— 1987,— Vol. 316, N 15.— P. 889—897.
2. Boyum A. //Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.— 1968.— Vol. 97,— P. 77.
3. Muul L. М., Nason-Burchenal K-, Cartes C. S. et al. // J. Immunol. Meth.— 1987.— Vol. 101.— P. 171—181.
Поступила 18.12.89
FIRST EXPERIENCE OF USING SOVIET MADE RECOMBINANT INTERLEUKIN-2 (RIL-2)
N. N. Trapeznikov, V. V. Yavorskiy, A. B. Syrkin, V. L. Kassyl,
S. Yu. Bykovskaya, L. N. Buachidze, L. V. Demidov, Z. G. Ka-dagidze, E. A. Cheremushkin, E. V. Saveljeva, N. I. Pe-revodchikova, V. A. Gorbunova, L. S. Bassalyk, E. A. So-lovjeva, V. G. Kondratjev, О. M. Dronova, T. A. Kupriyanova, Z. V. Pavlova
17 patients have been taken into this study. 15 of them had disseminated malignant melanoma. 1 had advanced colon cancer and another one multiple metastases of renal cancer in distant lymph nodes. 15 patients with malignant melanoma have been divided into three subgroups according to treatment: 1) 3 patients received high dose of RIL-2 (6X105—
1,2X10® units) i. v. bolus injections twice a day X 3—5 days. After two days rest lymphokine-activated killer cells (LAK) have been prepared and given within 3 days. This regimen was highly toxic, whereas effect of treatment wasn’t sufficient. I patient had partial remission (PR) lasted 2 weeks only. 2) 7 patients received low doses of RIL-2 (7,5X 104 units) with LAK cells concomitantly. Toxicity of this LAK-therapy was from moderate to severe. 2 PRs have been achieved. 3) 5 patients received RIL-2 at doses of 3,5—6ХЮ5 units by means of 5 days infusion. Toxicity was mild but partial remission was only seen in one case. This study made it possible to determine patients tolerance to RIL-2. Bolus injections of 6X Ю5;—1,2X Ю6 units of RIL-2 were highly toxic, whereas 3,5X105—6ХЮ5 units of RIL-2 given in infusion have been well tolerated.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 616-006.34.04-085.28
Я. Я. Переводчикова, Л. А. Еремина, В. А. Горбунова, А. Т. Амирасланов, Л. В. Манзюк, П. А. Синюков,
Е. Е. Ковалевский, А. Я. Феденко, А. С. Сингин,
Л. К. Молдованова
ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКИХ ДОЗ МЕТОТРЕКСАТА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОСТЕОГЕННОЙ САРКОМЫ
НИИ клинической онкологии
Остеогенная саркома является основной нозологической формой в ряду первичных злокачественных опухолей скелета. Заболевание характеризуется крайне агрессивным течением и быстрым гематогенным метастазированием в легкие. Частота последнего достигает 80—95 %, а средние сроки диссеминации не превышают 8—12 мес. Короткий интервал между лечением первичной опухоли и появлением признаков генерализации предполагает наличие субклинических метастазов уже при первых симптомах заболевания. Множественная реализация последних в легких и отсутствие
