CC BY
55
УДК (612.017.1:57.7.27):616-006
Е.В. Якушенко, Ю.А. Лопатникова, Е.А. Храпов, Е.Н. Воронина, М.Л. Филипенко, Ю.Н. Козлова, Н.М. Пустошилова,
А.В. Шурлыгина, С.В. Сенников, В.А. Козлов
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск ООО «Центр инженерной иммунологии», Новосибирск
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск
В работе представлены данные по получению рекомбинантного ИЛ-18 человека в клетках Е. coli, исследованию его биологической активности in vitro и противоопухолевой активности in vivo. Показано, что полученный рекомбинантный ИЛ-18 стимулирует продукцию ИФНу и ФНОа мононуклеарами периферической крови и оксида азота в смешанной культуре лимфоцитов человека. Изучение противоопухолевой активности внутривенного введения рИЛ-18 в эксперименте на мышах показало статистически достоверное снижение веса опухоли (меланома В16) и увеличение продолжительности жизни экспериментальных животных.
Ключевые слова: интерлейкин-18, иммунитет, ИФНу, ФНОа, меланома
Интерлейкин-18 (ИЛ-18 или ИФНу-инду-цирующий фактор) является провоспалитель-ным цитокином и стимулирует продукцию таких факторов воспаления, как ИЛ-ip, ИФНу, ИЛ-8, ФНОа, неоптерин [9]; увеличивает экспрессию апоптогена FasL, молекул адгезии; активирует НК-клетки и цитотоксические лимфоциты, способствует дифференцировке Т хелперов 0 (ТхО) в Тх1, тем самым создавая условия для активации клеточного иммунного ответа. Эти свойства ИЛ-18 позволяют исследовать и использовать его в качестве противоопухолевого фактора. К настоящему времени многими авторами продемонстрирована противоопухолевая активность ИЛ-18 в различных моделях. Основными клетками-эффекторами противоопухолевой защиты являются макрофаги, продуцирующие ИЛ-18 , а также Т-, НК и дендритные клетки. Показано, что ИЛ-18 в синергизме с ИЛ-12 подавляют рост глиомных клеточных линий мыши VM-glioma и 203G in vitro, причем этот эффект связан с ИФНу и N0, продуцирующимися Т- и НК-клетками [3]. Еще одним из механизмов противоопухолевой защиты, активизирующимся при введении ИЛ-18, является аиоптоз, опосредованный увеличением экспрессии Fas ligand НК-клетками [4]. Кроме того, показана антиангиогенная активность ИЛ-18. Так, имплантация A/J мышам матригеля (0,5 мл) с SCK.18 сопровождается менее интенсивной васкуляризацией этой области по сравнению с контрольной группой (матригель + SCK). Этот
эффект ИЛ-18 также связан с продукцией ИФНу, который стимулирует выработку IP-10 (интерфе-рон-индуцирующий протеин) и MIG (монокин, индуцированный ИФН), угнетающих ангиогенез [8]. Есть данные о влиянии ИЛ-18 на формирование иммунологической памяти. Показано, что ИЛ-18 не влияет на рост клеток MethA саркомы в эксперименте in vitro. При этом, спленоциты мышей, выживших после введения им клеток MethA саркомы и ИЛ-18, обладают цитотоксической активностью по отношению к этим опухолевым клеткам in vitro [7].
Цель настоящего исследования — получение рекомбинантного интерлейкина-18 и изучение его биологической и противоопухолевой активности.
Методика исследования
Рекомбинантный ИЛ-18 человека выделяли из клеток Е. coli BL 21(DE3), трансформированных плазмидой рЕТ 23b+lL-18, содержащей синтетический ген зрелого белка ИЛ-18 по схеме: 1) разрушение бактериальных клеток ультразвуком и выделение тел включения, содержащих ИЛ-18; 2) отмывка тел включения от примесей буфером, 50 мМ трис-НС1, pH 7,5, содержащим 1мМ ЭДТА, 1 М NaCl, 2 М мочевину, 2% Тритон Х-100; 3) экстракция белка из тел включения 7 М мочевиной; 4) очистка белка ионообменной хроматографией на ДЭАЕ-целлюлозе DE52 и SP-сефарозе FF в присутствии мочевины; 5) ренату -рация рекомбинантного ИЛ-18 человека путем
4-кратного разбавления раствора белка в мочевине буфером и последующего диализа против буфера 50 мМ трис-НС1, pH 7,5. Полученный рчИЛ-18 хранили аликвотами при температуре минус 18 °С.
В работе использовали мышей самцов линии C57BL6 в возрасте 2-4 месяца. Мыши получены из питомника лабораторных животных СО РАМН (пос. Нижняя Ельцовка г. Новосибирска) и НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу М3 СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Для исследования противоопухолевой активности полученного рекомбинантного ИЛ-18 использована перевиваемая клеточная линия В16 (меланома). Клетки в количестве 2><105 вводили подкожно в области спины. Рекомбинантный ИЛ-18 (1 мкг/мышь) вводили внутривенно (для оценки веса опухоли и выживаемости) или подкожно в место роста опухоли (для гистологического исследования), начиная со 2-го дня после переноса клеток В16 один, два или три раза через день.
Для экспериментов in vitro использована периферическая кровь от 14 условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови человека осуществляли согласно [2]. Для получения кондиционной среды МНК (1хЮ6кл/мл) культивировали 24 ч или 48 ч в полной среде при 37 °С во влажной атмосфере с 5% С02. Уровень продукции NO в кондиционных средах определяли колориметрическим методом с помощью реагента Грейсса [11]. Определение количественного содержания цитокинов производили электрохемилюминесцентным методом. Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили как описано ранее [10]. В качестве специфических антител в реакции были использованы поликлональные кроличьи антитела против рекомбинантного человеческого IL-18, а также моно- и поликлональные антитела против ИФНу и ФНОа (R&D Systems, UK). Для построения калибровочных кривых были использованы рекомбинантные цитокины: ФНОа, (R&D Systems, США) и ИФНу (Thomae-Biberach/Riss, Германия). Для гистологического исследования ткань меланомы фиксировали в 10% формалине, срезы ткани заключали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином.
Полученные данные обработаны статистически с применением непараметрического критерия Манн-Уитни и теста log-rank.
Результаты
Полученный белок рчИЛ-18 состоит из 158 аминокислот, молекулярный вес 18,4 kD. Электрофоретическая чистота (12,5 % полиакриламидный гель в полностью денатурирующих условиях) выделенного препарата рчИЛ-18 составляет не менее 97%.
Для определения количественного содержания и возможного перекрестного связывания полученный белок рИЛ-18 тестировался электрохемилюминесцентным методом [10]. Было установлено, что исследуемый белок связывается со специфическими антителами, калибруется при разведении при ЭХЛ-анализе и при использовании антител к другим цитокинам перекрестного связывания не обнаруживает (Данные не представлены).
Изначально ИЛ-18 был идентифицирован как ИФНу-индуцирующий фактор, однако это было показано у мышей на фоне эндотоксемии, вызванной введением Propionibacterium acnes и Л ПС [6]. В более поздних работах этих и других авторов было показано, что ИЛ-18 в данном случае выступает в роли костимулятора, хотя и способен самостоятельно стимулировать не очень высокие значения ИФНу [5]. В нашем эксперименте показано, что рчИЛ-18 способен самостоятельно без дополнительной стимуляции увеличивать продукцию ИФНу МНК ПК до 11727,9±1745,4 пг/мл по сравнению со спонтанной продукцией 8240,22± 1091,5 пг/мл. При совместной стимуляции ИЛ-18 и КонА (10 мкг/мл) продукция ИФНу увеличивается до 20161,7±3289,18 пг/мл (Рис. 1).
Показано, что многие провоспалительные свойства ИЛ-18 опосредуются через повышенную экспрессию гена и продукцию ФНОа [9]. При изучении влияния рчИЛ-18 на продукцию ФНОа было показано, что использование стимуляции рчИЛ-18 ведет к повышению продукции ФНОа с 116±20,8 пг/мл до 366±89,3 иг/мл, при совместной стимуляции ИЛ-18 и КонА (5 мкг/ мл) уровень продукции ФНОа увеличивается до 2106±983 пг/мл (Рис. 1).
Известно, что ИФНу стимулирует выработку оксида азота [1]. и, поскольку, ИЛ-18 является ИФНу-индуцирующим фактором, правомерно ожидать усиления продукции этого оксида после стимуляции ИЛ-18. В наших экспериментах было показано, что исследуемый рчИЛ-18 стимулирует выработку NO in vitro клетками смешанной культуры лимфоцитов человека со спонтанного уровня 2,09±0,17 мМ/л до 4,87±0,93 мМ/л.
При изучении противоопухолевой активности полученного рекомбинантного ИЛ-18 показано, что в/в введение мышам рИЛ-18 приводит к снижению веса солидной опухоли (меланома
15000-
10000 -
5000 ■
спонтанная ИЛ-18 (40нг/мл) спонтанная
КонА (5мкг/мл) КонА+ИЛ-18 КонА (10мкг/мл) КонА+ИЛ-18
Рис. I. Эффект рчИЛ-18 на продукцию ИФНу (48 часов) и ФНОа (24 часа) в культуре МНК ПК человека.
Представлены результаты измерения уровня цитокинов (\ftSD) для 14 культур МНК. полученных от здоровых доноров.
Примечание: Стрелками обозначены статистически достоверные различия между группами (р<0,05)
25000 20000 -
ИФНг
В16), причем чем больше была кратность введения рчИЛ-18, тем меньше был вес опухоли. Так, при однократном введении рИЛ-18 средний вес-опухоли составил 2,54±0.31 г, при двукратном - 2,12±0,49 г, при трехкратном 1,93±0,25 г. При этом вес опухоли в интактной группе мышей составлял 3,46±0,36 г. (Рис. 2).
Продолжительность жизни экспериментальных животных при 1-, 2- и 3-кратном введе-нпи статистически достоверно увеличивалась (55,56±2,77 диен, 59,14±3,26 дней, 49,33±2,39 дней соответственно) по сравнению с контрольной группой (37,44±! .62 дня). Достоверных отличий между разной кратностью введений рИЛ-18 не обнаружено (Рис. 3).
Гистологическое исследование солидной опухоли после 3-кратного внутривенного или 3-кратного подкожного введения рИЛ-18 показало, что исследуемый препарат подавляет митотическую активность опухолевых клеток и усиливает дегенеративные процессы (ннкнозы, некроз), уменьшает васкуляризацию опухоли и повышает ее инфильтрацию лимфоцитами, макрофагами н плазматическими клетками. При подкожном введении препарата опухоли эффекты выражены более значительно.
Таким образом, получен рекомбинантный человеческий белок интерлейкина-18. Этот белок связывается со специфическими антителами, калибруется при разведении при ЭХ Л анализе. В системе in vivo установлено, что рИЛ-18 обладает противоопухолевой активностью, снижая вес перевиваемой солидной опухоли (меланома В16) и увеличивая продолжительность жизни экспериментальных животных. Показанная проти-
ФНОа
1 701 4 60-
50
40-
30-
20-
10
п
Контроль 1-кратное 2-кратное 3-кратное
(п=9) введение введение введение
ИЛ-18 (п=9) ИЛ-18 (п=9) ИЛ-18 (п=9)
Рис. 3. Влияние введения рчИЛ-18 на
продолжительность жизни мышей после
инокуляции опухолевых клеток меланомы В16.
Примечание: * р<0,()5 по сравнению с контролем
воопухолевая активность полученного рекомбинантного белка ИЛ-18 может быть связана с его способностью стимулировать продукцию ИФНу, ФНОа и оксида азота, которые, как известно, лежат в основе и запускают некоторые механизмы противоопухолевой защиты организма.
Интактная 1-кратное ^-кратное 3-кратное
<п=181 введение введение введение
' ' ИЛ-18 (п=17) ИЛ-18 (п=12) ИЛ-18 (п=14)
Рис. 2. Влияние введения рчИЛ-18 на вес солидной опухоли (меланома В16) на 23-й день после инокуляции опухолевых клеток.
Примечание: * р<(),03 по сравнению с контролем
PREPARATION OF RECOMBINANT INTERLEUKIN-18 AND STUDY OF ITS ANTITUMORAL ACTIVITY
E.V. Yakushenko, J.A. Lopatnikova, E.A. Khrapov, E.N. Voronina, M.L. Filipenko, J.N. Kozlova,
N.M. Pustoshilova, A.V. Shurligina, S.V. Sennikov, V.A. Kozlov
In present work are submitted the data on preparation of recombinant human interleukin-18 in E. coli cells, research by its biological activity in vitro and antitumoral activity in vivo. Is shown, received recombinant protein of IL-18 stimulates production of IFNy and TNFy by mononuclear cells and nitric oxide in the mixed culture of lymphocytes of the human. The study of antitumoral activity of i.v. introduction of rIL-18 in experiment on mice has shown downstroke of weight of a tumor (melanoma B16) and augmentation of duration of life of experimental animals.
Литература
1. Amano F. Improved detection of nitric oxide radical (NO.) production in an activated macrophage culture with a radical scavenger, carboxy PTIO and Griess reagent / F. Amano, T. Noda // FEBS Lett. - 1995. - Vol. 368. -№ 3. - P. 425-428.
2. Boyum A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytes from human blood. General sedimentation properties of white blood cells in a lg gravity field/ A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 1968. -Vol. 97.-P. 51-76.
3. Cytotoxicity in glioma cells due to interleukin-12 and interleukin- 18-stimulated macrophages mediated by interferon-gamma-regulated nitric oxide / T. Kito, E. Ku-roda, A. Yokota , U. Yamashita //J. Neurosurg. — 2003.
- Vol. 98 (2). - P. 385-392.
4. Differential antitumor effects of administration of
recombinant IL-18 or recombinant 1L-12 are mediated primarily by Fas-Fas ligand- and perforin-induced tumor apoptosis, respectively / W. Hashimoto, T. Osaki, H. Okamura, et al. //J. Immunol. — 1999. — Vol. 163 (2).-P. 583-589.
5. Differential capacities of CD4+, CD8+, and CD4-CD8- T cell subsets to express IL-18 receptor and product IFN-gamma in response to IL-18 / M. Tomura, S. Mamo, J. Mu, et al. //J. Immunol. — 1998. — Vol. 160. — №8.
- P. 3759-3765'
6. Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production / K. Nakamura, H. Okamura, M. Wada, et al. // Infect. Immun. — 1989. — Vol. 57.
- № 2. - P. 590-595.
7. In vivo antitumor effects of murine interferon-gam-ma-inducing factor/interleukin-18 in mice bearing syngeneic Meth A sarcoma malignant ascites / M,J. Micallef, K. Yoshida, S. Kawai, et al. // Cancer Immunol. Immunother,
- 1997.-Vol. 43(6).-P. 361-367.
8. Interleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis / C.M. Coughlin, K.E. Salhany, M. Wysoc-ka, et al. // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101 (6). -P. 1441-1452.
9. Interleukin-18 (IFNgamma-inducing factor) induces IL-8 and IL-lbeta via TNFalpha production from non-CD14+ human blood mononuclear cells / A.J. Puren, G. Fantuzzi, Y. Gu , et al. //J. Clin. Invest. — 1998. — Vol. 101.-№3.-P. 711-721.
10. Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochemiiuminescence method / S.V. Sennikov, S.V. Krysov, T.V. Injelevskaya, et al. // J. Immunol. Methods. - 2003. - Vol. 275. - № 1-2. - P. 81-88.
11. Regulation by IFN-beta of inducible nitric oxide synthase and interleukin- 12/p40 in murine macrophages cultured in the presence of Chlamydia pneumoniae antigens / S.Y. Yao, A. Ljunggren-Rose, C.W. Stratton, et al. //J. Interferon Cytokine Res. — 2001. — Vol. 21. — №3.
- P.137-146.
