Цитокины в лабораторной диагностике Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

в помощь ПРАКТИКУЮЩЕМУ ВРАЧУ

Цитокины в лабораторной

*

диагностике

A.C. Симбирцев, A.A. Тотолян

ОБШИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЦИТОКИНАХ

Цитокины - эндогенные полипептидные и белковые медиаторы межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное развитие, некоторые нормальные физиологические функции организма, защитные реакции при внедрении патогенов и развитии опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при патологии. Известно более 200 индивидуальных веществ, принадлежащих к семейству цитокинов: интерфероны, интерлейкины с исторически сложившимися порядковыми номерами, ростовые и ко-лониестимулирующие факторы, хемокины, медиаторы из группы фактора некроза опухолей, трансформирующие ростовые факторы и некоторые другие молекулы.

УЧЕНИЕ О ЦИТОКИНАХ

Современное учение о цитокинах имеет 4 независимых источника.

Первый и наиболее важный источник - учение о лим-фокинах. Это направление активно развивалось в середине 1960-х гг., когда было показано, что белки, продуцируемые лимфоцитами, регулируют рост и функцию различных лейкоцитов. Начало учению о лимфокинах было положено исследованиями, демонстрирующими способность супернатантов, полученных от сенсибилизированных лимфоцитов после их стимуляции специфическим антигеном, угнетать миграцию нормальных макрофагов. Фактор, ответственный за это, был назван фактором угнетения миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor). В дальнейшем был введен термин «лимфокин», означающий растворимые клеточные факторы, которые продуцируются сенсибилизированными лимфоцитами во время их взаимодействия со специфическим антигеном, они ответственны за развитие клеточно-опосредованных иммунологических реакций. Примером классического лимфокина может быть интерлейкин-2 (IL-2), играющий центральную роль в регуляции роста и функции Т-клеток. Затем было показано, что лимфоциты могут продуцировать один или несколько митогенных факторов для других

лимфоцитов. Так, митоген-активированные мононуклеа-ры человека продуцируют фактор, поддерживающий рост Т-лимфоцитов. Этот фактор в настоящее время известен как IL-2. Однако вскоре выяснилось, что моноциты также являются источником белков (монокинов), которые могут модулировать функции лейкоцитов. Первый цитокин моноцитарно-макрофагального происхождения - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor - TNF). Кроме прямого цитотоксического эффекта по отношению к некоторым опухолевым клеткам in vitro TNF обладает множеством других биологических эффектов в отношении различных лейкоцитов и тканевых клеток. Среди первых цитокинов моноцитарного происхождения был описан фактор активации лимфоцитов (lymphocyte activating factor), известный в настоящее время как интерлейкин-1 (IL-1). Другие исследователи описали этот же фактор под такими названиями, как митогенный белок, лейкоцитарный пироген, эндогенный пироген, фактор, активирующий В-клетки, эндогенный медиатор лейкоцитов и др.

Второй источник - учение об интерферонах. Интерферон впервые был описан как фактор, который продуцируется вирус-индуцированными клетками, способными вызывать клеточную резистентность к вирусным инфекциям. Затем был открыт вирус-ингибирующий белок (interferon gamma - IFN-y), продуцируемый митоген-активированными Т-лимфоцитами. IFN-y, продуцируемый Т-клетками и естественными киллерами, по структуре полностью отличается от большого семейства IFN-a/ß, продуцируемого множеством различных клеток: моноцитами, естественными киллерами, В-лимфоцитами, различными негемопоэтическими клетками. Интерфероны были определены как факторы роста и дифференцировки клеток иммунной системы и клеток других систем организма человека. В результате граница между лимфокинами/ монокинами и интерферонами стала размытой, сегодня понятно, что интерфероны - это цитокины.

Третьим источником являются факторы роста гемо-поэтических клеток (колониестимулирующие факторы; colony-stimulationg factors - CSF). Их основной функцией является пролиферация и дифференцировка гемопоэти-ческих клеток, а название отражает способность формировать гранулоцитарные или моноцитарные колонии. Эти факторы также регулируют некоторые функции зрелых

* Клиническая лабораторная диагностика: Национальное руководство в 2 т. Т. II / Под ред. проф. В.В. Долгова, проф. В.В. Меньшикова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. С. 193-217.

А.С. Симбирцев, Арег А. Тотолян цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

клеток, что размывает границы между ними и лимфоки-нами/монокинами.

Наконец четвертым источником являются факторы роста негемопоэтических клеток: фактор роста, продуцируемый тромбоцитами (platelet-derived growth factor - PDGF), эпидермальный (epidermal growth factor - EGF) и фибро-бластный (fibroblast growth factor - FGF) факторы роста, а также трансформирующий фактор роста (transforming growth factor р - TGFp).

Как упоминалось выше, лимфокинами называют продукты сенсибилизированных лимфоцитов при воздействии на них специфического антигена. Однако в связи с тем, что со временем способность продуцировать аналогичные факторы была обнаружена и у других типов клеток, термин «лимфокины» было предложено заменить на «цитокины». Кроме того, в 1979 г. на Втором международном совещании по лимфокинам был утвержден термин «интерлейкины» для растворимых белков, обеспечивающих взаимодействие между различными популяциями лейкоцитов. В качестве первого шага на Совещании были приняты IL-1 и IL-2, которые ранее имели множество различных названий. Несмотря на то что множество цитокинов относятся к семейству интерлейкинов, часть факторов сохраняют свои старые названия, отражающие лишь одну из функций этих плейотропных агентов: CSF, IFN, TNF и т.д. Таким образом, цитокины - регуляторные белки, секретируе-мые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию воспалительной реакции. Цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, отличающих их от других классов регуляторных молекул, среди них важнейшими считаются следующие: характерные биохимические свойства (цитокины представляют собой белки или полипептиды с молекулярной массой от 5 до 50 кДа), проявление биологической активности в пикограммовых концентрациях, отсутствие тканевой и антигенной специфичности, плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем все 3 системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ

цитокинов

■ В основном цитокины - простые белки или глико-протеины с молекулярной массой до 30 кДа; лишь некоторые цитокины являются олигомерами с высокой молекулярной массой.

■ Продукция цитокинов регулируется различными индукторами на уровне транскрипции или трансляции.

■ Продукция цитокинов кратковременна, а их радиус действия обычно короткий (типичное действие ау-токринное или паракринное, но не эндокринное).

■ Цитокины реализуют свои эффекты через специфические высокоаффинные рецепторы с ^=109-1012 М.

■ Фенотипически действие цитокинов приводит к повышению (или снижению) скорости клеточной пролиферации, изменению клеточной дифферен-цировки и проявлению различных функций соматических клеток.

■ Хотя набор биологических эффектов различных цитокинов может различаться, мишенями для большинства цитокинов являются гемопоэтические клетки.

В табл. 1 представлены отличительные признаки гормонов и цитокинов.

Таблица 1. Отличительные признаки гормонов и цитокинов

характеристика гормоны цитокины

Клетки-продуценты Специализированные Различные типы клеток

Эффекты Характерные для каждого гормона Структурно различные цитокины обладают сходными биологическими эффектами

Клетки-мишени Строго определенные Для одного цитокина различные типы клеток

Радиус действия Большой (эндокринный тип действия) Короткий (аутокринный или паракринный тип действия)

Как следует из вышесказанного, цитокины и гормоны имеют много общего, однако между ними есть существенные отличия. Классические гормоны продуцируются специализированными клетками: например, инсулин продуцируется р-клетками поджелудочной железы, гормон роста - гипофизом, паратгормон - паращитовидными железами и т.д. Цитокины, наоборот, выделяются менее специализированными клетками. Кроме того, различные типы клеток могут синтезировать один и тот же цитокин. Например, К-1 продуцируют моноциты, макрофаги, ме-зангиальные клетки, естественные киллеры ^К-клетки), Т- и В-лимфоциты, нейтрофилы, эндотелиальные и мышечные клетки, фибробласты, астроциты, клетки микро-глии. Однако существуют исключения: К-2, К-5 и лимфо-токсин продуцируются исключительно Т-лимфоцитами. Одно из основных отличий цитокинов от гормонов - наличие у цитокинов, имеющих структурное сходство, принципиально различных биологических эффектов (например, TNF-a и TNF-p, К-1р и ^-1р). Кроме того, один и тот же цитокин проявляет многообразные биологические эффекты по отношению к различным клеткам-мишеням (табл. 2).

Несмотря на некоторые различия, цитокины, факторы роста и гормоны формируют большое семейство внеклеточных сигнальных молекул со сходным механизмом действия. Так, рецепторы для некоторых цитокинов и гор-

таблица 2. Основные характеристики действия цитокинов

характеристика Комментарии

Плейотропность Большинство цитокинов имеет много клеток-мишеней

Избыточность эффектов Один цитокин имеет множество биологических эффектов

Синергизм/ антагонизм Одновременное влияние на клетки двух или нескольких цитокинов может привести к качественно различным эффектам

Цитокиновый каскад Цитокины могут повысить (или снизить) продукцию других цитокинов

Модуляция рецепторов Цитокины могут повысить (или снизить) экспрессию рецепторов для других цитокинов

монов (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор -GM-CSF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор - G-CSF, эритропоэтин, пролактин, гормон роста) имеют сходную структуру. Также структурная гомология была описана для рецепторов к PDGF и макрофагально-му колониестимулирующему фактору (M-CSF). Более того, сходные механизмы обеспечивают передачу сигнала от рецепторов (к гормонам, факторам роста, цитокинам) к клеточному ядру и приводят к сходным биологическим эффектам.

Роль цитокинов в регуляции функций организма может быть разделена на 4 основные составляющие:

■ регуляция эмбриогенеза, закладки и развития органов, в том числе органов иммунной системы;

■ регуляция отдельных нормальных физиологических функций;

■ регуляция защитных реакций организма на местном и системном уровнях;

■ регуляция процессов регенерации тканей.

Экспрессия генов отдельных цитокинов происходит

стадиоспецифически, на определенных этапах эмбрионального развития. Факторы стволовых клеток, трансформирующие ростовые факторы, цитокины семейства TNF и хемокины регулируют дифференцировку и миграцию различных клеток и закладку органов иммунной системы. После этого синтез некоторых цитокинов может не возобновляться, тогда как другие продолжают регулировать нормальные физиологические процессы или участвуют в развитии защитных реакций.

Несмотря на то что большинство цитокинов являются типичными индуцибельными медиаторами и в постна-тальном периоде не синтезируются клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа, некоторые из этих веществ не подпадают под это правило. В результате конститутивной экспрессии генов часть из них синтезируется постоянно и циркулирует в достаточно больших количествах, регулируя пролиферацию и дифференцировку отдельных типов клеток в течение всей жизни. Примером такого типа физиологической регуляции функций цито-кинами может быть постоянно высокий уровень эритро-поэтина и некоторых CSF для обеспечения гемопоэза.

Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различ-

ных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. На тканевом уровне цитокины ответственны сначала за развитие воспаления, а затем за регенерацию тканей. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза. Попадание цитокинов в циркуляцию, безусловно, означает, что местная защита не справилась с патогеном, требуется включение системной воспалительной реакции для предотвращения его распространения и развития сепсиса.

Регуляция защитных реакций организма цитокина-ми происходит не только в рамках иммунной системы, но и на уровне целостного организма, где цитокины осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию единой защитной реакции.

Цитокины играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Не менее важное значение цитокины имеют в формировании и развитии реакций специфического иммунитета, прежде всего связанных с регуляцией пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов. Сейчас не вызывает сомнения разделение популяции Т-лимфоцитов на 2 принципиально разных класса: Т-хелперы и цитотоксические Т-лимфоциты. Благодаря дальнейшим исследованиям функций активированных антигеном Т-лимфоцитов хелперов выяснилось, что эта популяция клеток также неоднородна и может быть разделена на подклассы по функциональной активности. Эта активность связана главным образом с синтезируемыми цитокинами. Оказалось, что Т-хелперы различаются между собой именно набором продуцируемых цитоки-нов. Активация Th5, секретирующих IL-2 и IFN-y, ведет к стимуляции главным образом функций Т-лимфоцитов и макрофагов и развитию клеточного типа ответа, тогда как синтез Т| IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13 стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета. Защита организма от внутриклеточных патогенов происходит с помощью формирования клеточного иммунитета, зависимого от Thj, тогда как внеклеточные патогены нейтрализуются и выводятся из организма благодаря гуморальному иммунитету, поддерживаемому Th2.

Направление антигензависимой дифференцировки Т-лимфоцита хелпера зависит от присутствия в межклеточном пространстве цитокинов, синтезируемых главным образом антигенпредставляющими клетками и определяющими путь дифференцировки активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов в разные типы Th-клонов. У человека описаны, по крайней мере, 3 типа Th-клонов, из них клоны T| и Th2 почти полностью соответствуют аналогичным клонам Т-лимфоцитов мышей. Дифференцировка T| индуцируется IL-12, который синтезируется макрофагами и дендритными клетками после взаимодействия молекулярных структур патогенов с толл-подобными рецепторами (toil-tike receptors) данных клеток. IL-12 взаимодействует со своими специфическими рецепторами на Th0 и запускает активацию сигнального

пути с участием транскрипционного фактора T-bet, являющегося основной внутриклеточной молекулой для диф-ференцировки Thr

Th2 дифференцируются главным образом под действием IL-4, который может синтезироваться базофилами и тучными клетками в ответ на проникновение в ткани аллергенов, а также под действием тимического стромаль-ного лимфопоэтина (ТСЛП), синтезируемого эпителиальными клетками в коже и легких и активирующего функции миелоидных дендритных клеток (ДК), в свою очередь активирующих Th2. Интересно, что сам IL-4, синтезируемый Th2, является основным фактором при дифференцировке стимулированных антигеном наивных CD4+ (CD - cluster of differentiation) Т-клеток в Th2.

Изучение активации Т-лимфоцитов хелперов человека привело к появлению более сложной схемы развития Th-клонов. Выяснилось, что IL-23, еще один цитокин семейства IL-12, ответственен за дифференцировку особого типа Th-клонов, продуцирующих IL-17 и получивших название Th17. Вместе с IL-23 в дифференцировке Th17 принимают участие IL-6, IL-1a и IL-ip. Цитокины семейства IL-17 стимулируют синтез ряда провоспалительных цитокинов макрофагами и за счет этого усиливают воспалительную реакцию, изначально вызванную патогеном.

В последнее время описаны также клоны Th человека, дифференцирующиеся под действием третьего члена семейства IL-12 - IL-27 и синтезирующие преимущественно IL-10. Значение дифференцировки этих клонов при встрече с антигеном может заключаться в негативной регуляции активации клонов Th1, Th2 и Th17 и в подавлении воспалительной реакции любого типа. Кроме того, существуют клоны Th, относящиеся к естественно встречающимся регуляторным Т-лимфоцитам, экспрес-сирующим поверхностные маркеры CD4, CD25 и транскрипционный фактор FoxP3. Дифференцировка этого типа Th, по-видимому, происходит в тимусе под влиянием ТСЛП, секретируемого клетками эпителия медуллярной зоны тимуса, а также IL-2, синтезируемого как в тимусе, так и на периферии, хотя окончательная ясность в схеме дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов отсутствует.

методы оценки

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ

Изучение системы цитокинов как in vivo, так и in vitro проводится в зависимости от конкретных задач, стоящих перед лабораторией, и включает следующие основные подходы.

■ Генетический анализ на предмет отсутствия мутаций в генах цитокинов, их рецепторов и белков внутриклеточных сигнальных систем запуска синтеза и передачи сигнала.

■ Анализ полиморфизма генов цитокинов.

■ Изучение экспрессии генов цитокинов.

■ Изучение уровня продукции цитокинов клетками в культуре.

■ Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях.

■ Изучение синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток.

■ Изучение синтеза цитокинов в тканях.

Все перечисленные методы могут быть разделены на 3 основные группы, появившиеся в следующем порядке по мере развития исследований системы цитокинов и развития методологических подходов в целом:

1) методы оценки биологической активности цитокинов;

2) иммунохимические методы;

3) молекулярно-биологические методы.

Биологические методы

Первые эксперименты, приведшие к открытию и начальной характеристике цитокинов, были связаны с изучением их биологической активности. Так, на основании изучения противовирусной активности в культурах зараженных вирусами фибробластов был открыт интерферон. Несомненно, биологические методы измерения уровня цитокинов очень ценны для исследователей. Эти методы отличаются достаточно высокой чувствительностью и с биологической точки зрения более правильны, поскольку измеряют только биологически активные формы цитокинов, а следовательно, наиболее адекватно отражают работу системы цитокинов in vivo. В связи с этим уже в первые годы изучения цитокинов были разработаны несколько тестов с использованием первичных культур клеток для оценки разнообразных биологических функций. Однако определение биологической активности цитокинов с использованием первичных культур клеток не соответствовало одному из главных требований - стандартизации методик анализа. Именно поэтому вскоре для биологического тестирования многих цитокинов были получены длительно культивируемые трансформированные линии клеток, отвечавших на действие цитокинов изменением пролиферации, дифференцировки или функциональной активности (табл. 3). Тем не менее во всех случаях стандартизация обеспечивается сравнением биологического действия изучаемого ци-токина с международными стандартными образцами, выпускаемыми Международной лабораторией биологических стандартов ВОЗ в Национальном институте биологической стандартизации и контроля (Великобритания), которая выпускает и рассылает по запросу охарактеризованные по биологической активности стандартные образцы цито-кинов человека.

Как следует из табл. 3, большинство используемых в биологических тестах клеточных линий не обладают строгой специфичностью в отношении одного цитокина, а могут отвечать на действие еще некоторых медиаторов, что существенно снижает специфичность определения биологической активности цитокинов в культуральных средах и биологических жидкостях, где обычно одновременно содержится несколько десятков цитокинов. В то же время эти клеточные линии могут быть идеальным инструментом для оценки биологической активности ре-комбинантных цитокинов. Во многих лабораториях про-

изводят искусственные клеточные линии, отвечающие на отдельные цитокины, путем трансфекции клеток генами рецепторов данных цитокинов. Трансфецированные клетки приобретают способность специфически отвечать на действие низких концентраций нужных цитокинов. Однако многие клетки экспрессируют рецепторы большого числа цитокинов, поэтому метод не в состоянии обеспечить абсолютную специфичность тестирования.

Клеточные линии, используемые для оценки уровня цитокинов человека, имеют различное происхождение. Большинство таких линий получены от пациентов с лейкемией либо при лабораторно индуцированной лейкемии. Некоторые цитокины человека не являются видо-специфичными, и для их изучения можно использовать клеточные линии мышиного происхождения. Уровень цитокинов в образцах оценивается в основном по их способности стимулировать или ингибировать пролиферацию клеток. Существует несколько способов измерения пролиферации клеток:

1) подсчет клеток;

2) оценка синтеза ДНК по включению радиоактивно меченного тимидина. Альтернативой радиоизотопным методам служат методы оценки клеточного метаболизма как индикатора пролиферации, основанные на восстановлении различных солей тетразолия.

Кроме измерения пролиферативной активности для оценки уровня некоторых цитокинов, таких, как TNF, используют методы, основанные на цитотоксической активности цитокинов. Здесь с помощью витальных красителей оценивают цитотоксический эффект по отношению к некоторым клеточным линиям. Для оценки интерферонового статуса используют методы, основанные на антивирусной активности интерферонов. При этом используются различные клетки-мишени, зараженные вирусом, на которых оце-

нивается антивирусная активность интерферонов путем визуальной оценки жизнеспособности клеток или с помощью витальных красителей. Для оценки биологической активности хемокинов, в частности IL-8, применяют методы хемотаксиса, где определяют их способность привлекать клетки, измеряя при этом количество клеток, мигрировавших через мембрану Бойдена, либо длину пробега клеток в агаре.

В целом все методы оценки биологической активности цитокинов in vitro могут быть объединены в 5 основных групп.

1. Оценка пролиферативной активности клеток (стимуляция или подавление).

2. Оценка цитотоксичности.

3. Определение экспрессии мембранных рецепторов, синтеза других цитокинов.

4. Оценка влияния на функциональную активность клеток, что всегда зависит от типа клеток и изучаемого цитокина, например оценка хемотаксиса либо оценка завершенности фагоцитоза.

5. Оценка противоинфекционного действия, как в случае интерферона. Несмотря на очевидные достоинства, биологические методы имеют и ряд существенных недостатков:

■ они трудоемки и сложны в исполнении;

■ требуют значительно больше времени до получения конечного результата;

■ требуют особых стерильных условий и оборудования для постановки;

■ менее специфичны, чем иммунохимические методы.

Иммунохимические методы

Биологическая оценка активности цитокинов обладает целым рядом ограничений в области специфичности, воспроизводимости и точности (табл. 4). В связи с этим

цитокины Клеточные линии тканевое происхождение способ оценки активности Другие цитокины, активные в данном тесте

IL-1 Первичные культуры Тимоциты мыши Пролиферация IL-2, IL-6; IL-4, TNF, видоспецифично

D10S Лимфома Пролиферация IL-2

IL-2 CTLL-2 Лимфома Пролиферация IL-15, TGFß

IL-3 TF-1 Костный мозг Пролиферация IL-4, -5, -9, -13, GM-CSF

IL-4 CTLL-2 Лимфома Пролиферация, видоспецифично IL-15, TGFß

IL-6 B9 Миелома Пролиферация IL-11, IL-13

IL-7 2E8 Лимфома Пролиферация -

IL-8 Первичные культуры Нейтрофилы Миграция Некоторые СХС хемокины

IL-12 KIT-225 Т-лимфома Пролиферация IL-2, 4, 7, 15, 21

IL-18 KG-1 Миелолейкемия Синтез IFN-y IL-12, IL-21

TNF L929 Фибробласты Цитотоксичность Лимфотоксин

GM-CSF TF-1 Эритролейкемия Пролиферация IL-3, -4, -5, -9, -13, ЭПО

IFN-a Первичные культуры Фибробласты пуповины человека Антивирусная активность Другие типы IFN,

А-549, 2D9, Daudi Карцинома легких, глиобластома, лимфома Антивирусная активность, продукция белка МхА видоспецифично

IFN-y А-549 Карцинома легких Антивирусная активность Другие типы IFN, видоспецифично

WiDr Карцинома толстой кишки Подавление пролиферации

таблица 3. Клеточные линии и первичные культуры клеток для оценки биологической активности цитокинов (Meager, 2006, с дополнениями)

таблица 4. Сравнительный анализ методов определения цитокинов

характеристика Биологические методы иммунохимические методы

Что выявляет Только биологически активные молекулы Число доступных эпитопов (биологически активные и неактивные молекулы)

Специфичность Недостаточная (биологические активности различных цитокинов интерферируют); необходимо подтверждать с помощью нейтрализующих антител Очень высокая

Интерференция Специфические и неспецифические нативные ингибиторы цитокинов, антицитокиновые антитела Белки сыворотки крови, компоненты комплемента, антицитокиновые антитела, ревматоидный фактор

Чувствительность Высокая Очень высокая

Точность Низкая (CV может достигать 100%) Высокая (СТ в пределах 5-10%)

Длительность 1-4 дня Несколько часов

определение уровней цитокинов в различных биологических средах чаще всего проводят с использованием иммунохимических методов, основанных на применении поликлональных, а в настоящее время главным образом моноклональных антител, специфически взаимодействующих с молекулами цитокинов.

Иммунохимические методы чрезвычайно разнообразны и представлены следующими видами методик количественного определения концентрации растворимых цитокинов в различных биологических жидкостях.

■ Иммуноферментный анализ в различных модификациях (ИФА; Enzymelinked Immunosorbent Assay -ELISA).

■ Радиоиммунный анализ (РИА). Чувствительность метода достаточно высока, но в последние годы радиоиммунологические методы используются все реже и заменяются ИФА, чтобы избежать работы с изотопами и уйти от использования дорогостоящих счетчиков радиоактивности.

■ Мультиплексный иммунный анализ (МИА), позволяющий с помощью моноклональных антител одновременно определять до 100 белков с использованием флюоресцентных и других меток, в том числе с применением технологии микрочастиц или микрошариков, покрытых антителами, а также микрочипов (Bioplex, Multiplex analysis, Biochip Array Technology). В этом варианте несколько цитокинов анализируют с использованием одного биочипа одновременно, что существенно экономит время и реагенты, однако стоимость оборудования для проведения такого анализа пока еще слишком высока.

■ Цитофлюориметрические методы для анализа экспрессии поверхностных молекул клеток (мембранных форм цитокинов и рецепторов цитокинов) и определения цитокинов в цитоплазме клеток.

■ Метод оценки продукции цитокинов единичными клетками в культуре (ELISPOT).

■ Иммуноцитохимия и иммуногистохимия для оценки содержания цитокинов в цитоплазме клеток на мазках и на срезах тканей.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Наибольшее распространение получили иммунофер-ментные диагностические тест-системы, позволяющие проводить количественный анализ содержания цитоки-

нов в любых биологических жидкостях и обладающие достаточно высокой чувствительностью для определения уровней цитокинов у человека и животных. Принцип работы большинства современных тест-систем заключается в использовании «сэндвич»-варианта твердофазного ИФА (см. рисунок). Для реализации этого варианта используют 2 моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к определяемому цитоки-ну. Первое из этих антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок) 96-луночно-го пластикового микропланшета стандартного формата для постановки ИФА. На первом этапе анализа исследуемый образец вносится в лунки, где происходит специфическое связывание определяемого антигена (цитокина) моноклональными антителами, сорбированными на поверхности лунок. После этого производится отмывка всего не связавшегося с антителами материала буфером с детергентом. Этот важный этап позволяет удалить все неспецифически связывающиеся молекулы, но не влияет на специфическое высокоаффинное взаимодействие антител с определяемым цитокином. На второй стадии анализа связавшийся цитокин взаимодействует со вторыми антителами, конъюгированными с биотином. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству цитокина в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу, взаимодействующую с биотином на вторых антителах. После этого в лунки вносят особый субстрат для фермента пероксидазы, меняющий цвет под действием фермента, например тетраметилбен-зидин, в результате чего происходит ферментативная реакция и окрашивание раствора в лунках. Возможно также использование наборов из трех антител, когда вторые антитела (например, поликлональные кроличьи антитела к цитокину) на последнем этапе взаимодействуют с антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом. В результате образуется «сэндвич» из двух или трех антител и молекулы антигена между ними.

Количественную оценку концентрации цитокина в пробах проводят, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного образца цитокина. Иммуноферментные методы высокоспецифичны, быстры (время постановки ИФА не превышает 5 ч) и относительно просты в исполнении. Порог чувствительности для та-

a-animal IgG

Твердая Флюоресцентно- Нормальная Ложноположительная Угнетение

фаза ИФА меченная микрочастица для МИА

реакция

реакция

реакции

Базовые принципы «сэндвич»-анализа на твердой фазе: А - слева ИФА, справа микрочастицы; В - слева нормальная реакция, посередине - ложноположительная реакция вследствие интерференции с ревматоидным фактором ^М, справа угнетение реакции путем блокирования сайтов связывания иммуноглобулинами животных

ких тест-систем достигает 0,5 пкг/мл. В настоящее время в России широко доступны коммерческие варианты имму-ноферментных систем для определения широкого спектра цитокинов.

Большинство иммуноферментных тест-систем адаптированы для работы с любыми биологическими жидкостями. Для измерения уровней цитокинов на системном уровне используют сыворотку или плазму крови. Несмотря на короткий (минуты) период жизни и индуцибельный тип синтеза большинства цитокинов, в сыворотках крови здоровых доноров иногда определяются незначительные уровни цитокинов. Обычно их концентрации находятся на пределе чувствительности иммуноферментного метода, но при различных заболеваниях, связанных с острой или хронической продукцией цитокинов, сывороточные уровни цитокинов становятся значительно выше. Однако, поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в интересующих исследователя тканях после экстракции тканевых протеинов in vitro или в биологических жидкостях. При развитии воспаления, аллергии или аутоиммунных процессов значимые уровни цитокинов могут быть определены в слезной жидкости, жидкости десневых карманов, смывах из полостей, моче, спинномозговой жидкости и даже в конденсате выдыхаемого воздуха.

Анализ данных определения цитокинов показывает, что благодаря использованию различных реагентов в ИФА и различиям в протоколах исследования в разных лабораториях могут получаться не вполне сопоставимые результаты, даже если при этом используют одни и те же международные стандарты. Подобные различия можно объяснить использованием в тест-системах разных пар антител. Используемые в ИФА тест-системах антитела могут связываться с одними и теми же цитокиновыми молекулами, однако антитела могут не распознавать фрагменты цитокиновых молекул или их формы-предшественники. Для создания антител обычно используют рекомбинант-ные формы цитокинов, которые могут отличаться от естественных форм. Это может приводить к различиям в аффинитете связывания определяемых молекул с разными антителами. И хотя, как считается, ИФА является «золотым стандартом» для определения цитокинов, в настоя-

щее время возможность определения таких сигнальных молекул с помощью этого метода ограничена. Это прежде всего касается одновременного исследования уровней большого числа цитокинов для более полной характеристики цитокиновой регуляции различных биологических процессов в норме и при патологии.

Таким образом, основными достоинствами ИФА являются:

■ высокая специфичность;

■ высокая чувствительность (низкий предел детекции);

■ хорошая воспроизводимость;

■ относительно низкая себестоимость анализа;

■ достаточно большой срок годности наборов.

К основным недостаткам ИФА следует отнести:

■ возможность исследования только одного параметра;

■ достаточно большой объем исследуемого образца (100-200 мкл и в дублях - 200-400 мкл);

■ относительно продолжительную процедуру выполнения анализа (протокол опыта включает достаточно большое число этапов инкубации, отмывок, при этом ручной труд способствует повышению вероятности погрешностей в постановке ИФА тест-систем);

■ сложности, связанные с динамическим рядом определения параметров (калибровочные кривые) и интерпретацией данных, превышающих разрешающую способность калибровочного графика.

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ иммунный АНАЛИЗ

Для оценки уровней цитокинов в различных биологических жидкостях наиболее распространенными методами мультиплексного иммунного анализа (МИА) являются мультиплексные методы, в основе которых лежит «сэндвич»-метод в разных комбинациях - FAST Quant, Search Light и xMAP. Каждый из этих методов имеет некоторые различия по ряду параметров: определение доступных аналитов, возможность использования новых аналитов, динамический ряд оценки, чувствительность

метода, стоимость оборудования, цена расходных материалов.

Все эти критерии следует учитывать при выборе метода исследования уровней цитокинов. Поскольку результаты определения биологически активных веществ в каждом методе могут существенно различаться, считается, что проводить статистический анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецелесообразно. Для каждого отдельного исследования следует выбирать только одну какую-нибудь технологию, для того чтобы полученные данные и выводы были репрезентативными и соответствовали требованиям доказательной медицины.

Измерение уровня одного какого-либо цитокина для характеристики различных процессов, протекающих в организме, абсолютно недостаточно, так как не позволяет получить более или менее объективную информацию о комплексных биологических взаимодействиях на клеточном уровне как в норме, так и при патологии. В этой связи совершенно очевидно, что роль повышения или снижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных взаимодействиях необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других цитокинов, присутствующих в этом же исследуемом биологическом образце.

В табл. 5 приведен сравнительный анализ характеристик МИА и ИФА методов определения цитокинов.

ОГРАНИЧЕНИЯ И КРИТИЧЕСКИЕ МОМЕНТЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ЦИТОКИНОВ С помошью ОСНОВНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Сбор и хранение биопроб

В зависимости от задач клинической лабораторной диагностики цитокины определяют в различных биологических жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной и амниотической жидкости, в экссудатах, жидкости

бронхоальвеолярного лаважа, смывах, мокроте и др.). Особое внимание следует уделять условиям сбора и хранения биологических образцов, поскольку на этом этапе возможны грубые ошибки, которые в дальнейшем могут привести к неправильным результатам оценки и, соответственно, неверной интерпретации полученных данных. При повторных циклах размораживания-замораживания биопроб в результате действия протеиназ молекулы цитокинов подвержены разрушению. При неправильном сборе биологического материала в условиях ex vivo не исключена возможность освобождения цитокинов из клеток либо связывания их с клеточными рецепторами, что может повлиять на полученные результаты. Если центрифугирование крови для получения сыворотки не выполнить за короткий срок, на результаты оценки цитокинов может существенно повлиять способность тромбоцитов, как во время процесса свертывания крови, так и при центрифугировании, освобождать целый ряд цитокинов и хе-мокинов, включая IL-1, IL-6, CXCL8/IL8, CCL5/RANTES.

При анализе цереброспинальной, амниотической, синовиальной, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, а также супернатантов клеток, перед замораживанием образцов необходимо избавиться от клеток. Связывание цитокинов с их растворимыми рецепторами также может повлиять на полученные результаты оценки уровней цитокинов в биопробах и не отразить истинную концентрацию цитокинов в анализируемых образцах. Этот эффект может происходить при специфическом связывании IL-1 и IL-6 с их растворимыми рецепторами. Не исключена возможность связывания цитокинов, например IL-1, IL-6, TNF-a аутоантителами, что также может приводить к получению неверных, искаженных результатов.

Гетерофильные антитела

При анализе уровней цитокинов в сыворотке и плазме крови наибольшее число ложноположительных результатов можно объяснить присутствием в этих биологических жидкостях гетерофильных антител. Эти антитела вырабатываются против неизвестных, недостаточно полно

сравниваемые параметры ифа миа

Чувствительность Высокая - <10 пг/мл Высокая - несколько пг/мл

Определение Количественное Количественное

Специфичность Высокая Высокая

Выявление Биологически активных и неактивных молекул Биологически активных и неактивных молекул

Время проведения анализа Относительно небольшое (день) Более быстрый анализ (часы)

Коэффициент вариации 5-10% 10-15%

Интерференция Отсутствует Отсутствует

Протокол исследования Относительно простой Простой

Объем образца Относительно большой (100-200 мкл на 1 определение) Небольшой (50 мкл на все определения -до 100 параметров)

Стимуляция детекции Отсутствует Присутствует

Срок хранения тест-системы Небольшой Более продолжительный

Разрешающая способность Определение 1 цитокина в одной биопробе Одновременное определение до 100 цитокинов в 1 биопробе

таблица 5. Сравнительные характеристики ИФА и МИА методов определения цитокинов

охарактеризованных антигенов и обычно обладают низкой авидностью. Такие низкоавидные антитела могут взаимодействовать с различными иммуноглобулинами, присутствуют у 40% здоровых лиц, а при различных аутоиммунных заболеваниях (например, у больных ревматоидным артритом) их количество существенно возрастает. Гетерофильные антитела могут включать антитела IgG, IgM и IgE, они присутствуют в сыворотке и плазме крови, а также в других биологических жидкостях, в которых обычно проводится определение уровней цитокинов с помощью «сэндвич»-методов, используемых как в ИФА, так и в МИА-технологиях. Поскольку эти гетерофильные антитела могут связываться с компонентами иммуноана-литических систем, перекрестное связывание может приводить к ложноположительным результатам, реже - к ин-гибиции связывания (см. рисунок).

Для того чтобы исключить интерференцию с гетерофильными антителами, в настоящее время разработан ряд подходов. Поскольку гетерофильные антитела могут связываться с антителами разных видов животных, можно проводить преинкубацию образца со смесью сывороток разных видов животных и лишь после этого ставить методы оценки уровней цитокинов. Выбор сывороток животных зависит от используемых в тест-системах антител (антитела мыши, кролика, овцы и других животных). Однако при таком подходе возможны и другие осложнения: в смеси сывороток крови животных разных видов антитела могут взаимодействовать друг с другом, что может приводить к неэффективному связыванию с гетерофильными антителами человека в исследуемых образцах. Таким образом, этот подход имеет ограничения. У больных ревматоидным артритом или у детей с ювенильным идио-патическим артритом в сыворотке крови в больших количествах могут присутствовать IgM- и IgG-аутоантитела, в частности ревматоидный фактор. Существуют методы, позволяющие снизить уровни ревматоидного фактора в исследуемых образцах крови таких больных. Для этого используют протеин L. В противоположность протеину А или протеину G этот протеин обладает способностью к высокоаффинному связыванию с IgM и IgG и меньшей аффинностью связывания с IgA.

Гетерофильные антитела также могут взаимодействовать с компонентами супернатантов клеток - с компонентами сыворотки крупного рогатого скота или аутологич-ной сыворотки человека, так как эти сыворотки обычно добавляют в культуральную среду, что способствует росту и дифференцировке культивируемых клеток.

Общее содержание белка и рН

Время достижения равновесия на разных этапах анализа зависит от концентрации белков, например более низкое содержание белка может приводить к более высокой интенсивности люминесценции. Если определение цитокинов проводится в биологических жидкостях с высоким содержанием белка (например, в цереброспинальной жидкости, амниотической, синовиальной и др.), стандартные кривые необходимо строить с использованием буфера с сопоставимым содержанием белка. Кроме кон-

центрации белка рН исследуемых образцов также может влиять на результаты анализа уровней цитокинов. Например, низкие уровни рН мочи могут приводить к конфор-мации молекул цитокинов, причем некоторые молекулы менее устойчивы к таким изменениям среды (например, структура молекулы TNF-a подвергается конформации при низких рН), в то время как молекулы других цитокинов (например, IFN-y) остаются достаточно устойчивыми в широком диапазоне рН - от 4,8 до 9,5.

Перекрестное связывание

Существует определенная степень гомологии между молекулами антител и цитокиновыми молекулами, поэтому можно предположить, что при проведении анализа антитела могут распознавать не только молекулы цитокинов, но и другие белковые молекулы, присутствующие в биопробе. Причем при мультиплексном анализе, в котором используют очень большое число всевозможных антител, вероятность такого перекрестного связывания значительно выше, чем при ИФА.

Стандартные кривые и вычисления результатов

Среди прочих факторов, влияющих на точность количественной оценки уровней цитокинов, важную роль играют используемые стандартные образцы и, соответственно, стандартные кривые. Обычно такие кривые состоят из серии определений с известными количествами рекомбинантных цитокинов (от 3 до 12 определений). В ИФА часто используют модель линейной регрессии. Если уровни исследуемых цитокинов находятся в пределах линейного ряда стандартной кривой, такая модель линейной регрессии приемлема для вычисления результатов. Однако если полученные данные выходят за пределы линейной части стандартной кривой, образцы следует разбавлять и анализировать повторно, учитывая их разведение.

Предел детекции в МИА ниже, чем в ИФА, даже если в обеих технологиях используются одни и те же пары антител, а динамический ряд измерения шире. Более широкий динамический ряд определений (3-4-логарифми-ческая шкала) в МИА позволяет минимизировать число биологических проб, для которых необходимо проводить повторное определение уровней цитокинов (в ИФА обычно используют 1-2-логарифмическую шкалу). Поскольку ряд определений в стандартной кривой достаточно широк, линейная модель не всегда приемлема, и поэтому для вычисления уровней цитокинов в биопробах чаще используется нелинейная регрессионная модель.

Определение цитокинов в клинической практике

Определение цитокинов в различных биологических жидкостях обычно используют для оценки активности воспаления, определения степени поляризации иммунного ответа, оценки эффективности проводимой терапии и прогноза заболевания. В ряде случаев уровни отдельных цитокинов могут коррелировать с тяжестью течения заболевания и прогнозом. Классическим примером может служить уровень IL-6 в плазме крови больных с тяже-

лыми травмами: высокие уровни IL-6 являются предикторами развития полиорганной недостаточности. Другим примером может служить определение высоких уровней IL-8 в цереброспинальной жидкости больных с лептоме-нингиальными метастазами солидных опухолей как предиктора скорой гибели больного.

Однако при большинстве заболеваний определения одного какого-либо цитокина обычно недостаточно для диагностики или оценки прогноза заболевания. Для оценки состояния иммунной системы у таких больных необходимо определять достаточно большой спектр цитокинов, позволяющий оценить особенности цитоки-новой регуляции в каждом конкретном компартменте.

Благодаря сложным механизмам регуляции синтеза цитокинов изменение экспрессии одного какого-либо цитокина обычно приводит к изменениям уровней других цитокинов. Причем скорость синтеза цитокинов может быть различной и зависеть от целого ряда физиологических характеристик организма благодаря тесной кооперации трех основных адаптационных систем: нервной, эндокринной и иммунной. В этой связи определение различных цитокинов в биологических образцах лучше проводить одновременно, в мультиплексном режиме оценки, чтобы избежать возможных ошибок в интерпретации полученных данных.

Определение продукции цитокинов клетками

Определение продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro как при стимуляции, так и без нее является альтернативой определения плазматического уровня цитокинов. Мононуклеары периферической крови служат в качестве удобной модели для оценки продукции цитокинов в основном из-за их доступности. При активации in vitro такими агентами, как фитогемаг-глютинин (ФГА) или бактериальный липополисахарид (ЛПС), мононуклеары периферической крови секрети-руют в культуральную среду целый спектр провоспали-тельных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNF и др. Измерение уровня цитокинов в биологических жидкостях позволяет оценить уровень цитокинов, синтезированных клетками организма, в норме или при развитии патологии. Определение уровня цитокинов в супернатантах мононуклеаров периферической крови обеспечивает надежную оценку способности клеток продуцировать цитокины. Этот тест можно считать одним из важнейших методов оценки функционального состояния клеток иммунной системы. Он стоит в одном ряду с оценкой бластной трансформации лимфоцитов или определением фагоцитарной активности клеток.

Определение синтеза цитокинов изолированными клетками в культуре может быть легко стандартизовано, так как в тесте используют стандартные препараты индукторов синтеза цитокинов, культуральные среды и другие реагенты, а сама оценка уровня цитокинов в культураль-ной среде может быть проведена как биологическими методами, так и стандартизованными иммуноферментными тест-системами, а также их комбинациями. Более того, в супернатантах клеток, стимулированных одним либо

двумя стандартными индукторами, может быть измерен одновременно целый ряд разнообразных цитокинов, позволяющих не только оценить общий уровень синтеза цитокинов индивидуума, но и определить цитокиновые профили, например поляризацию Т-хелперных клонов по характерному профилю синтезируемых цитокинов, соотношение синтеза агонистов и антагонистов и т.д. Кроме того, в культуре клеток можно оценить синтез цитокинов в ответ на специфический антиген, что может иметь неоценимое значение в диагностике силы и развития иммунного ответа при ряде инфекционных заболеваний, вакцинации, аллергической сенсибилизации и других патологических состояниях. В культуре имеется возможность определения продукции цитокинов у предварительно криоконсервированных клеток, полученных либо от разных доноров, либо в разное время и собранных вместе для более удобного, экономичного и надежного серийного мониторинга при клинических испытаниях.

Методика определения синтеза цитокинов изолированными клетками достаточно проста и заключается в следующем. Свежую венозную кровь, взятую в емкость с гепарином (20 МЕ/мл), тщательно перемешивают и разводят в 5 раз средой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глу-тамина и 80 мкг/мл гентамицина, обычно к 0,6 мл крови добавляют 2,4 мл среды RPMI 1640. В качестве индуктора синтеза группы провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), IL-10, IFN-a и хемокинов могут быть использованы препараты ЛПС в концентрации 1-10 мкг/мл, например отечественный ЛПС-содержащий препарат продигиозан. В качестве индукторов синтеза IL-2, IL-4, IFN-y и других Т-клеточных цитокинов может быть использован ФГА-М (Sigma) в конечной концентрации 50 мкг/мл. ФГА является универсальным индуктором и может быть использован также для индукции синтеза провоспалительных цитокинов. В 96-луночный планшет для культивирования клеток («COSTAR» или аналогичный) вносят индуктор по 100 мкл на лунку, в контрольные лунки (для оценки спонтанной продукции) вносят по 100 мкл среды RPMI 1640, затем во все лунки добавляют по 100 мкл разведенной, как описано выше, крови. Культивирование проводят при 37 °С в 5% СО2 в течение 24 ч, после чего осторожно отбирают супернатанты и проводят исследование содержания цитокинов в биологическом или иммуно-ферментном тесте. У больных подсчитывают количество лейкоцитов и формулу крови по стандартным методикам. Полученные данные о концентрациях цитокинов в супернатантах пересчитывают на 1 млн лейкоцитов либо мононуклеаров, лимфоцитов или других интересующих клеток в 1 мл с учетом произведенных разведений крови. При необходимости супернатанты могут храниться при -20 °С до 6 мес при однократном замораживании.

Многие провоспалительные цитокины в норме не должны циркулировать в крови. Тем не менее описаны случаи увеличения уровней провоспалительных цитокинов, в частности IL-1, в плазме крови при стрессовых ситуациях и тяжелой физической нагрузке. По-видимому, присутствие невысоких уровней этих цитокинов в плазме крови здоровых доноров можно объяснить следующими

причинами. Во-первых, они могут появляться в циркуляции в результате некоторых нормальных физиологических процессов жизнедеятельности организма либо под влиянием стрессорных факторов неинфекционной природы. Во-вторых, в ряде случаев данные уровни цитокинов могут быть проявлением вялотекущих скрытых воспалительных процессов, а также иммунопатологических состояний, включая ранние стадии аутоиммунных и аллергических заболеваний еще до появления клинических проявлений. Наконец, ряд цитокинов в плазме крови могут быть связаны с белками-переносчиками и различными ингибиторами. При этом цитокины могут не обладать биологической активностью, но выявляться иммунохими-чески с помощью специфических антител.

Определение уровней цитокинов в сыворотке крови имеет ряд сложностей из-за наличия неспецифических факторов связывания, которыми являются различные сывороточные белки. Цитокины IL-1, IL-2 и другие могут взаимодействовать с а2-макроглобулином, образуя комплексы, которые могут маскировать иммунореактив-ность цитокинов. Наряду с неспецифическим связыванием существует и специфическое. Уровни цитокинов, измеренные иммуноферментным методом, могут быть неинформативными из-за присутствия растворимых рецепторов для цитокинов. В этих случаях специфическое взаимодействие цитокина с рецептором ведет к кажущемуся исчезновению его из крови. Циркулирующие ауто-антитела к цитокинам являются другими специфическими ингибиторами, присутствующими в сыворотке некоторых индивидуумов, например у лиц, получавших цитокиновую терапию.

Уровни цитокинов в плазме периферической крови отражают текущее состояние работы иммунной системы и развития защитных реакций, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo. Определение уровней продукции цитокинов изолированными клетками in vitro показывает их функциональное состояние. Спонтанная продукция цитокинов в культуре свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo в результате развития воспаления или иммунопатологических процессов. В то же время активация клеток может произойти вследствие манипуляций в процессе выделения. Иногда это происходит из-за несоблюдения стерильности при заборе крови или использовании культуральных сред и растворов реагентов, загрязненных ЛПС. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток, что очень важно для оценки иммунологической реактивности. Сниженная индуцированная продукция цитокинов in vitro может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Именно поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов в циркуляции либо продукции лейкоцитами важны с точки зрения характеристики работы иммунной системы.

Преимущество метода индукции синтеза цитоки-нов в культурах цельной крови имеет ряд преимуществ по сравнению с индукцией цитокинов в культурах клеток, выделенных на градиенте плотности. В первую очередь это простота и связанная с этим более высокая степень

стандартизации процедуры. Во-вторых, стимуляция клеток происходит в присутствии собственной плазмы и лучше отвечает задаче наиболее полного воспроизведения условий синтеза цитокинов в организме. Тем не менее в ряде случаев разделение клеток на фракции позволяет более точно определить продукцию цитокинов определенными популяциями лимфоцитов, моноцитов или гра-нулоцитов.

В этой связи одним из наиболее перспективных современных методов анализа продукции цитокинов изолированными клетками является метод ELISPOT, представляющий своеобразный гибрид метода индукции синтеза цитокинов в культуре и обычного ИФА. Суть метода заключается в том, что выделенные клетки культивируют в присутствии индуктора синтеза цитокинов в микропланшетах, дно которых покрыто антителами к интересующему цитокину, как это делается на первом этапе ИФА. В процессе культивирования клетки, находящиеся на дне планшета, синтезируют цитокины, которые тут же связываются с сорбированными на пластике антителами. Таким образом, оказывается, что цитокин соединяется с сорбированными антителами в тех местах, где его синтезировали клетки. Дальнейшие этапы анализа проводятся так же, как в стандартном варианте ИФА, с той лишь разницей, что при постановке ELISPOT используется нерастворимый цветной субстрат ферментативной реакции, выпадающий в осадок там, где цитокин связался с сорбированными антителами. В результате на дне планшета образуются окрашенные пятна, соответствующие местам, где происходил синтез цитокинов клетками. Отсюда и произошло название метода - ELISPOT как комбинация метода ELISA с конечным формированием окрашенного пятна (spot). Пятна видны даже под малым увеличением микроскопа, их количество относительно исходного числа клеток и разный размер позволяют оценить интенсивность синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток. В настоящее время разработаны варианты метода с использованием субстратов разных цветов для оценки синтеза 2-3 цитокинов одновременно и созданы приборы для автоматического подсчета и анализа размеров пятен, что очень важно для стандартизации метода ELISPOT.

Наиболее точную характеристику отдельных клеток, продуцирующих цитокины, дает метод цитоплазматиче-ского окрашивания цитокинов в варианте цитофлюори-метрического анализа. Мембранные формы цитокинов и рецепторы цитокинов легко определяют на поверхности клеток с помощью меченных флюорохромами антител в обычном варианте цитофлуориметрии аналогично другим поверхностным молекулам клеток. Для выявления цитоплазматических цитокинов требуется достичь состояния проницаемости или пермебиализация мембран для обеспечения проникновения антител в клетки. Для этой цели используется сапонин в сочетании с бло-каторами обратного транспорта (брефелдин А или мо-нензин) для предотвращения экскреции антител из цитоплазмы клеток. Метод выгодно отличается от метода ELISPOT возможностью дополнительной характеристики клеток по размеру и экспрессии мембранных маркеров,

что позволяет проводить более точную идентификацию цитокин-продуцирующих клеток.

Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные белки, а некоторые цитокины могут существовать в виде мембранной формы. В обоих случаях экстраклеточные домены цитокинов и их рецепторов представляют собой поверхностные антигенные детерминанты различ-

ных клеток человека. Мембранные рецепторы и мембранные формы цитокинов, распознаваемые соответствующими моноклональными антителами, включены в единую классификацию поверхностных молекул клеток (CD), они получили свои порядковые номера (табл. 6). Это позволяет изучать количество и типы клеток, экспрессирующих рецепторы и мембранные формы цитокинов, с помощью

таблица 6. Рецепторы и мембранные формы цитокинов, включенные в CD-классификацию поверхностных молекул лейкоцитов человека

рецепторы и мембранные формы цитокинов соответствующие CD антигены Экспрессирующие клетки

рецепторы цитокинов, регулирующих созревание и функции т-лимфоцитов

IL-2 Ra CD25 Активированные лимфоциты

IL-2 Rß CD122 Т-лимфоциты, NK-клетки

IL-2 Ry CD132 Т-, В-лимфоциты, NK-клетки

IL-4/IL-13 Ra CD124 Т-, В-лимфоциты, другие типы клеток

IL-13 Rai ОТ213а1 В-лимфоциты, моноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки

IL-13 Ra2 ОТ213а2 В-лимфоциты, моноциты

IL-5 Ra CD125 Эозинофилы,базофилы

IL-7 Ra CD127 Предшественники Т- и В-лимфоцитов

IL-6 Ra CD126 В-лимфоциты, плазматические клетки

LIF R CD118 Эпителиальные клетки

gp130 CD130 Многие типы клеток

IL-10 R CDw210 Т-, В-лимфоциты, NK-клетки, моноциты

IL-12 Rßi CD212 Активированные Т-лимфоциты и NK-клетки

IL-17 R CD217 Многие типы клеток

рецепторы цитокинов, стимулирующих кроветворение

G-CSF R CD114 Гранулоциты, моноциты и их предшественники

М-CSF R CD115 Моноциты, тканевые макрофаги

GM-CSF Ra CD116 Моноциты, нейтрофилы, эозинофилы

Фактор стволовых клеток R (c-kit) CD117 Предшественники гемопоэза

Flt3 CD135 Предшественники гемопоэза

IL-3 Ra CD123 Предшественники гемопоэза, гранулоциты, мегакариоциты, моноциты

IL-3,5, GM-CSF Rß CD131 Миелоидные клетки

рецепторы цитокинов семейства IL-1 и ФрФ

IL-1 RI CD121a Т-лимфоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки

IL-1 RII CD121b В-лимфоциты, моноциты, макрофаги

IL-18 Ra CD218a Лимфоциты, нейтрофилы, ДК

IL-18 Rß CD218b Лимфоциты, нейтрофилы, ДК

ФРФ R1 CD331 Фибробласты, эпителиальные клетки

ФРФ R2 CD332 Фибробласты, эпителиальные клетки

ФРФ R3 CD333 Фибробласты, эпителиальные клетки

ФРФ R4 CD334 Фибробласты, эпителиальные клетки

цитокины и рецепторы семейства TNF

TNF RI CD120a Моноциты, гранулоциты

TNF RII CD120b Моноциты, гранулоциты, лимфоциты

Fas CD95 Апоптотические клетки

Fas AuraHfl CD178 Активированные Т-лимфоциты

0X40 CD134 Активированные Т-лимфоциты

0X40 AuraHfl CD252 Активированные В-лимфоциты, ДК, эндотелиальные клетки

4-1BB CD137 Т-лимфоциты

CD30 AuraHA CD153 Активированные Т-лимфоциты

CD40 AuraHA CD154 Активированные Т-лимфоциты, базофилы, тучные клетки

TRAIL CD253 Активированные Т-, В-лимфоциты, моноциты

TRAIL R1 CD261 Лейкоциты, опухолевые клетки

TRAIL R2 CD262 Многие типы клеток

TRAIL R3 CD263 Многие типы клеток

TRAIL R4 CD264 Многие типы клеток

Окончание табл. 6

I рецепторы и мембранные формы цитокинов соответствующие CD антигены Экспрессирующие клетки

TRANCE, RANKL CD254 Активированные Т-лимфоциты, остеобласты, стромальные клетки

RANK, TRANCE-R CD265 Многие типы клеток

APRIL CD256 Миелоидные клетки

BlyS, BAFF CD257 Миелоидные клетки

LIGHT CD258 Активированные Т-лимфоциты, незрелые ДК

TWEAK-R CD266 HUVEC

BAFF-R CD268 Т-, В-лимфоциты

рецепторы хемокинов

CCR1 CD191 Т-лимфоциты, моноциты, стволовые клетки

CCR2 CD192 Моноциты, Т-, В-лимфоциты, базофилы, эндотелиальные клетки

CCR3 CD193 Эозинофилы, базофилы, Т-лимфоциты, ДК

CCR4 CD194 Т-лимфоциты, базофилы, моноциты, тромбоциты

CCR5 CD195 Моноциты, Т-лимфоциты

CCR6 CD196 Т-, В-лимфоциты, ДК

CCR7 CD197 Т-лимфоциты

CCR8 CDw198 Т-лимфоциты, моноциты

CCR9 CDw199 Т-лимфоциты

CXCR1 CD181 Нейтрофилы, Т-лимфоциты

CXCR2 CD182 Моноциты, гранулоциты, Т-лимфоциты

CXCR3 CD183 Активированные Т-лимфоциты и NK-клетки

CXCR4 CD184 Моноциты, Т-, В-лимфоциты, эндотелиальные клетки, ДК

CXCR5 CD185 Т-, В-лимфоциты

CXCR6 CD186 Т-лимфоциты

цитофлюориметрии, а также использовать клеточные сортеры для выделения клеток, имеющих на мембранах определенные типы цитокинов или их рецепторов.

Несмотря на то что определение уровня цитокинов в сыворотке или плазме проще в исполнении, определение уровня цитокинов в тканях может дать дополнительную информацию о состоянии местного иммунитета. Так как цитокины - это локальные медиаторы, методы определения уровня цитокинов в месте воспаления или органного повреждения и репарации могут быть более биологически значимыми, чем определение их уровня в периферической крови. Однако все эти методы требуют получения биопсии ткани и являются трудоемкими. Простейший подход - это диссоциация ткани и приготовление тканевого экстракта, который затем тестируется методом ИФА. Однако этот метод не дает информации о том, какие клетки продуцируют цитокины и где они локализованы в ткани. Кроме того, для корректной интерпретации результатов требуется нормальная ткань в качестве контроля.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД

Широко распространенными методами детекции цитокинов в тканях являются иммуногистохимические методы с использованием специфических поли- или монокло-нальных антител к цитокинам. С помощью этих методов цитокины могут быть обнаружены в цитоплазме клеток -в мазках клеточных суспензий, приготовленных разны-

ми способами на предметных стеклах в виде обычного гематологического мазка, с помощью цитоцентрифуги, способом тонкой капли и другими методами. Кусочки тканей, полученные с помощью биопсии или во время операции, обычно глубоко замораживают в жидком азоте, а затем готовят срезы толщиной 4-6 мкм в криостате при температуре -20 °С. Приготовленные и высушенные мазки или срезы тканей фиксируют этанолом, метанолом или параформальдегидом (4% раствор в натрий-фосфатном буфере, рН 7,2-7,4) 20 мин при +4 °С, затем отмывают в PBS (рН 7,2-7,4) в течение 10 мин, высушивают и хранят при +4 °С до проведения реакции.

Чаще всего изучение локализации цитокинов в клетках проводят методом непрямой иммуногистохимии с использованием специфических антител к цитокинам, а на втором этапе - антивидовых антител, меченных флю-орохромами для люминесцентной микроскопии или ферментами для световой микроскопии. Важно, что в случае флюоресцентных меток антитела к цитокинам могут быть использованы для их выявления с помощью цитофлюо-риметра, причем в данном варианте возможно выявление как цитоплазматических цитокинов, так и их мембранных форм. В случае ферментов используют биотинилирован-ные антивидовые антитела, а на последнем этапе комплексы стрептавидин-пероксидаза либо стрептавидин-щелочная фосфатаза. При проведении цветной реакции применяют нерастворимые субстраты, выпадающие в осадок в месте взаимодействия антител с цитокинами, т.е. в месте локализации цитокинов в клетках. В случае световой микроскопии препараты могут быть докраше-

ны гематоксилином и некоторыми другими красителями, что позволяет достаточно хорошо различать структуру ткани. Кроме того, существуют методы иммуногистохими-ческого выявления отдельных цитокинов на парафиновых срезах, дающих наиболее полное сохранение морфологической структуры исследуемых тканей.

Молекулярно-биологические методы изучения цитокинов

Определение экспрессии генов цитокинов в клетках-продуцентах по накоплению мРНК - еще один подход к оценке их синтеза. Появление мРНК в клетках или тканях обычно детектируется путем гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами, длина которых варьирует от нескольких нуклеотидов до целой кДНК, соответствующей гену искомого цитокина. Эти зонды содержат радиоактивные, флюоресцентные или ферментные метки, в зависимости от метки применяют соответствующий метод для выявления тканевой локализации мРНК. При использовании метода гибридизации in situ на свежих криосрезах тканей или мазках клеток для выявления локализации мРНК цитокинов могут использовать комплементарные РНК зонды для РНК - РНК-гибридизации. Метод позволяет определять количество и тип клеток, экспрессирующих цитокины. Недостатком метода является тот факт, что в ряде случаев наличие мРНК совсем необязательно отражает присутствие соответствующего полипептида цитокина в клетке: процессы транскрипции и трансляции могут регулироваться независимо. Накопление большого количества мРНК может не сопровождаться последовательным синтезом белка. Если мРНК не транслируется, что часто бывает при ряде патологических состояний, искомый цитокин отсутствует. Кроме того, возможно появление различных изоформ мРНК в результате альтернативного сплайсинга. Таким образом, для получения более полной информации о содержании цитокинов в тканях необходимо, видимо, использовать комбинацию методов, позволяющих оценить как экспрессию мРНК, так и синтез данного цитокина в клетке.

Новейшим количественным методом для определения цитокиновой мРНК является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). Этот метод отличается очень высокой чувствительностью и специфичностью, как и все тесты, основанные на методике ПЦР. В настоящее время разработаны многие модификации метода, такие как ПЦР в реальном времени (real-time PCR), микрочипы (microarray), позволяющие анализировать одновременно несколько сотен генов, и другие. Гибридизация с олигонуклеотидными зондами, комплементарными участкам единичных нуклеотидных замен в генах цитокинов, с использованием амплификации методом ПЦР применяется и для анализа аллельного полиморфизма. Одной из последних разработок является использование аптамеров - олигонуклеотидов, полученных по технологии SELEX, для количественной оценки уровней цитокинов. Существует модификация ИФА, где вместо антител в качестве распознающих цитокины молекул используются аптамеры.

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

Врожденные нарушения цитокиновой регуляции

Мутации генов цитокинов и регуляторных молекул в большинстве случаев приводят к снижению функциональной активности цитокинов и нарушению развития защитных реакций организма. Наследственные нарушения в системе цитокиновой регуляции затрагивают многие ключевые медиаторы и их рецепторы, приводя к тяжелым клиническим проявлениям разнообразных видов иммунодефицитных состояний. В то же время отдельные мутации могут приводить к повышенному синтезу цитокинов либо нарушению регуляторных взаимодействий в цитокиновой сети и возникновению связанных с этим аутоиммунных, аутовоспалительных и лимфопролифера-тивных состояний.

Одним из ярких примеров цитокин-зависимого первичного иммунодефицита служит наследственный дефект гена у-цепи рецептора IL-2. Отдельные субъединицы ре-цепторного комплекса IL-2 являются общими для IL-2 и некоторых других цитокинов. Так, у-цепь служит общей субъединицей рецепторов для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21. У человека мутации в гене у-цепи рецептора IL-2 (делеции аминокислотных остатков 62 и 81) связаны с развитием сцепленного с Х-хромосомой синдрома тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД). Это заболевание характеризуется отсутствием или значительным падением содержания Т-лимфоцитов и резко сниженными показателями клеточного и гуморального иммунитета.

Клинически ТКИД является гетерогенной группой заболеваний, связанных с нарушением функционирования Т-лимфоцитов, сочетающегося с различными вариантами дефицита В-лимфоцитов, NK-клеток и других типов лейкоцитов. Кроме ТКИД, развивающегося как следствие дефекта у-цепи рецептора IL-2, известны как минимум еще 2 варианта этого заболевания, вызванных дефектами генов JAK3 и a-субъединицы рецептора IL-7. Клинические симптомы ТКИД, связанного с дефицитом киназы JAK3, не отличимы от проявлений иммунодефицита, связанного с дефектом у-цепи. Это объясняется участием киназы JAK3 в проведении внутриклеточного активаци-онного сигнала от у-цепи рецепторного комплекса IL-2. По сути два описанных генетических дефекта нарушают один и тот же путь активации лимфоцитов на разных уровнях, что, естественно, приводит к одинаковым функциональным нарушениям и клиническим проявлениям иммунодефицитных состояний. Дефицит a-субъединицы рецептора IL-7 приводит к несколько иной картине ТКИД. У больных с этим генетическим дефектом наблюдалось снижение количества Т-лимфоцитов, но отмечены нормальные уровни В-лимфоцитов и NK-клеток. В данном случае нарушения касаются проявлений функциональной активности только одного цитокина, IL-7, стимулирующего созревание предшественников лимфоцитов. Однако отсутствие зрелых Т-клеток оказывается достаточной причиной для развития тяжелых проявлений ТКИД. У детей с клиническими проявлениями ТКИД дифференциальная

диагностика дефектов в системе цитокинов молекулярно-биологическими методами может иметь важное значение для правильной постановки диагноза.

Нарушения в системе IL-12, IL-23, IFN-y и их рецепторов составляют другое врожденное нарушение цито-киновой регуляции, связанное с дефектом врожденного иммунитета. В результате взаимодействия с патогенами макрофаги и дендритные клетки начинают синтезировать несколько разных групп цитокинов, включая цитокины семейства IL-12 (IL-12, IL-23, IL-27), нужные для запуска дифференцировки незрелых Т-лимфоцитов. Синтез IL-12 параллельно с представлением антигена стимулирует дифференцировку Т-клеток в направлении Т-лимфоцитов хелперов 1-го типа, приводящую к началу экспрессии генов цитокинов, среди которых одним из главных регуляторов клеточного иммунитета является IFN-y. Нетрудно представить, что любые сбои в функционировании этой последовательной системы развития защитных реакций могут привести к серьезным нарушениям иммунитета, в первую очередь связанным с защитой от микобактерий. В приведенном пути регуляции начальных этапов развития защитных реакций известны 5 различных генетических дефектов, затрагивающих цитокины, их рецепторы и молекулы сигнальных путей активации клеток. Это ген субъединицы р40, являющейся одной из двух субъединиц гетеродимерных цитокинов IL-12 и IL-23, ген p-1-цепи рецептора IL-12, служащей общей субъединицей рецепторов для IL-12 и IL-23, гены субъединиц 1 и 2 рецептора IFN-y и ген внутриклеточной сигнальной молекулы STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1), участвующей в передаче сигнала от рецепторов IFN-y.

Описаны более 50 пациентов с полным рецессивным вариантом дефицита рецептора IL-12, приводящего к отсутствию нормальной экспрессии этой рецепторной субъединицы, резкому снижению ответа на IL-12 и IL-23 и продукции IFN-y. Клинически это проявлялось повышенной восприимчивостью к инфекциям, вызываемым микобактериями и сальмонеллами, и частично могло быть компенсировано назначением препаратов IFN-y. Нарушения продукции IFN-y со сходными клиническими проявлениями наблюдались у детей с дефектами гена субъединицы р40 IL-12/IL-23, этот иммунодефицит дозозависимо корректировался назначением рекомбинантного IL-12. При правильной оценке цитокиновой недостаточности и адекватной терапии клинический прогноз у детей с такими дефектами достаточно благоприятный, особенно в случаях вторичных инфекций, протекающих менее тяжело. Наследственные иммунодефицитные состояния, связанные с дефектами генов рецепторов IFN-y, подразделяются на полные дефициты рецепторов, которые приводят к полному отсутствию ответа на этот цитокин, частичные рецессивные и частичные доминантные дефициты рецепторов, возникающие в результате различных мутаций и делеций генов рецепторов 1 и 2 к IFN-y. Тяжесть клинических проявлений иммунодефицита во всех этих случаях различна, однако всегда связана с развитием инфекций, вызванных микобактериями, реже сальмонеллами или Listeria monocytogenes.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ КАК ВАРИАНТ РАЗВИТИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ НАРУШЕНИЙ ЦИТОКИНОВОЙ РЕГУЛЯЦИИ

Мутации в генах цитокинов приводят к серьезным нарушениям иммунитета. У человека подобные мутации встречаются достаточно редко, что может свидетельствовать о важнейшей роли цитокинов в осуществлении защитных реакций. Тем не менее накапливается все больше данных о выявлении функционального полиморфизма генов цитокинов, связанного с заменами единичных нукле-отидов (полиморфизм вследствие различия единичных нуклеотидов; single nucleotide polymorphism - SNP), вызывающих количественные изменения функционирования соответствующих генов, в отличие от мутаций, полностью выключающих функции кодируемых ими белков. SNP являются наследственными генетическими изменениями. Накапливается все больше данных о том, что эти изменения могут оказывать достаточно серьезное влияние на протекание защитных реакций. В отличие от мутаций в генах цитокинов SNP не удаляются естественным отбором, а большей частью сохраняются в популяции, что делает их важными диагностическими маркерами, которые могут быть определены с использованием молекулярно-биологических методов. В последнее десятилетие опубликовано огромное количество данных о выявлении полиморфизма генов цитокинов человека, их рецепторов и регуляторных молекул. Часть выявленных аллельных вариантов генов обусловливает снижение либо увеличение проявлений биологической активности кодируемых белков, что позволяет говорить именно о функциональном полиморфизме. Связь обнаруженных изменений с конкретной патологией у человека можно проиллюстрировать следующим примером.

Для гена TNF описано несколько различных SNP, 2 из них связаны с разнонаправленными изменениями уровня продукции биологически активного TNF. Это ну-клеотидные замены в положениях -308 (G^-A) и -238 (G^A) в нетранслируемой области гена в зоне промоу-терных участков. Наличие полиморфного аллеля ( - 308А) приводит к увеличению эффективности транскрипции гена и увеличению продукции TNF в 2-5 раз по сравнению с нормальным вариантом. Связь функционального полиморфизма гена TNF с развитием патологии прослеживается при изучении распределения аллелей этого гена среди африканцев, болеющих малярией. При обследовании более 1000 человек оказалось, что полиморфный аллель (-308А), связанный с повышенной продукцией TNF, в 4 раза чаще встречается у больных с наиболее тяжело протекающей церебральной формой малярии c более сильным развитием системного воспалительного ответа и в 7-8 раз чаще у больных с развившимися впоследствии тяжелыми нарушениями нервной системы. Более широкое изучение распределения аллелей гена TNF среди жителей эндемичных по малярии регионов Африки привело к поразительным результатам, показавшим,

что среди африканцев частота носительства данного полиморфного аллеля составляет лишь 5%, тогда как среди белых европейского происхождения она достигает 30%. Данные говорят в пользу того, что высокопродуцирующий аллель гена TNF в случае заболевания малярией приводит к повышенному синтезу TNF и более выраженному развитию системной воспалительной реакции, чаще приводящей к гибели заболевших или к тяжелым осложнениям. По-видимому, в данном случае имеет место результат давления определенного патогена на популяцию за счет механизма естественного отбора, происходит это за счет существования наследственных вариантов гена одного из главных провоспалительных цитокинов. Естественно, что диагностическое определение наличия указанного полиморфного аллеля гена TNF может дать очень важную информацию для прогноза и своевременного назначения адекватной терапии больных с инфекционными заболеваниями и гнойно-воспалительной патологией.

Функциональный полиморфизм генов цитокинов обусловливает индивидуальные наследственные колебания уровня их продукции, которые влияют на развитие и исход инфекционных заболеваний и иммунопатологических процессов. Именно поэтому полиморфизм генов цитокинов может считаться вариантом наследственных иммунодефицитных состояний. Безусловно, обнаружение SNP свидетельствует лишь о предрасположенности индивидуумов к тому или иному заболеванию, однако их определение позволяет прогнозировать риск развития патологии и подбирать адекватную терапию. Подобные изменения в перспективе должны заноситься в генетический паспорт индивидуума.

Изменения цитокинов при сепсисе

Клинические проявления сепсиса связаны с развитием системного воспалительного ответа организма на инфекцию. Это послужило основой для введения термина «синдром системного воспалительного ответа» (systemic inflammatory response syndrome), применимого к обозначению воспалительного ответа на уровне организма при различных состояниях, включая сепсис с бактериемией, а также состояниях без определяемой бактериемии, например травме и острых воспалительных заболеваниях отдельных органов (острый панкреатит).

Синтез большинства цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, возрастает при развитии сепсиса и коррелирует с уровнями других лабораторных тестов (С-реактивный белок и др.), тяжестью клинических проявлений и исходом заболевания. Лабораторные данные определения уровней цитокинов свидетельствуют, чем выше были уровни цитокинов при поступлении больных с диагнозом «сепсис» в отделение интенсивной терапии, тем выше оказался уровень смертности, причем это относилось как к группе провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-6, IL-8), так и к антивоспалительным цитокинам, таким как IL-10 и рецепторный антагонист интер-лейкина-1 (РАИЛ). По-видимому, в начале развития сепсиса происходят активация различных типов лейкоцитов и других синтезирующих цитокины клеток и индукция

или увеличение уровня экспрессии генов нескольких цитокинов без избирательной активации синтеза только провоспалительных медиаторов или только цитокинов, ограничивающих развитие воспаления.

Тем не менее именно провоспалительные цитоки-ны обусловливают развитие патологических изменений при сепсисе. В высоких концентрациях они способны вызывать нейроэндокринные изменения, нарушения терморегуляции, активацию эндотелия, приводящую к увеличению выхода жидкости в ткани, расширению сосудов и падению артериального давления (коллапс), диссемини-рованному внутрисосудистому свертыванию крови, полиорганной недостаточности и гибели больного. Среди провоспалительных цитокинов более всего перечисленные патологические изменения способен вызывать TNF, часто называемый медиатором смерти. Уровень IL-1ß также повышен в плазме крови больных сепсисом, однако это обнаружено не во всех исследованиях. Самые высокие уровни IL-1ß выявлены у больных с менингококковым сепсисом. У них концентрации IL-1ß коррелируют с выраженностью бактериемии, тяжестью клинических проявлений и развитием септического шока. Другой представитель семейства IL-1 - IL-18 - также повышается у больных с сепсисом, его уровень коррелирует с клиническими проявлениями сепсиса. Наиболее высокая степень корреляции с клинической картиной сепсиса получена при исследованиях уровней IL-6 и IL-10. Именно концентрация в плазме крови IL-6 соответствовала клинической картине сепсиса по шкале тяжести состояния критических больных (APACHE II) и могла быть критерием для прогнозирования исхода заболевания. Уровень этого цитокина также коррелирует с другими маркерами септического процесса: С-реактивным белком, компонентом комплемента С3а, лактатом и TNF.

Если в кровотоке количество цитокинов повышается, их продукция изолированными лейкоцитами больных сепсисом снижена по сравнению с уровнем продукции тех же медиаторов лейкоцитами здоровых доноров. Это касается провоспалительных цитокинов и хемоки-нов, а также цитокинов Т-лимфоцитов хелперов и 1-го, и 2-го типов: IL-2, IFNy, IL-5, IL-10, т.е. сниженной оказывается продукция большинства цитокинов. Вероятно, это связано с общими явлениями анергии после интенсивного синтеза, так как такое падение продукции цитокинов описано не только при бактериальном сепсисе, но и после травм и массивных ожогов, когда в первые дни после ожога происходит очень интенсивный синтез этих веществ в ответ на травму («цитокиновый шторм»), а затем наступает резкое падение уровней их продукции. Эти данные ставят вопрос об источнике повышенного уровня цитокинов в плазме крови больных сепсисом, так как период существования большинства цитокинов в циркуляции обычно очень короткий (например, период полужизни IL-1 в плазме крови составляет всего 7,5 мин), а повышенные уровни цитокинов у больных сохраняются несколько суток.

Важно, что антивоспалительные цитокины (IL-10, РАИЛ и TGF-ß) и растворимые рецепторы TNF и IL-6 тоже синтезируются в повышенных количествах при сепсисе.

Средние уровни IL-10 и РАИЛ выше при септическом шоке по сравнению с сепсисом и выше у умерших больных по сравнению с выжившими. Наиболее высокие уровни IL-10 выявляют у больных с неблагоприятным течением сепсиса и плохим прогнозом, причем чем выше соотношение уровней IL-10 и TNF, тем хуже прогноз. Данные о гиперпродукции антивоспалительных цитокинов у больных сепсисом привели к появлению понятия «синдром компенсаторного антивоспалительного ответа» (compensatory anti-inflammatory response syndrome - CARS). Считают, что CARS развивается вслед за системной воспалительной реакцией, выполняя функции ограничения гиперпродук-

ции воспалительных цитокинов и системного воспаления, но у некоторых больных это может приводить к имму-носупрессии. Экспериментальные данные не полностью подтверждают эту гипотезу, так как провоспалительные и антивоспалительные цитокины у большинства больных синтезируются одновременно, а их функции трудно оценивать однозначно. Цитокины в низких концентрациях необходимы для правильного формирования местного воспаления, более высокие дозы вызывают развитие системной воспалительной реакции, но патологически высокие концентрации приводят к состоянию септического шока и гибели организма.