CC BY
449
Для корреспонденции
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских
наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой
токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,
Устьинский проезд, д.2/14
Телефон: (495) 698-53-68
E-mail: v.shipelin@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0002-0015-8735
Шипелин В.А.1, Шумакова А.А.1, Мусаева А.Д.1, Трушина Э.Н.1, Мустафина О.К.1, Маркова Ю.М.1, Быкова И.Б.1, Масютин А.Г.2, Гмошинский И.В.1, Хотимченко С.А.1, 3
Токсиколого-гигиеническая характеристика бентонитовой наноглины, применяемой в пищевой промышленности
Peroral toxicological assessment of bentonite nanoclay used in the food industry
Shipelin V.A.1, Shumakova A.A.1, Musaeva A.D.1, Trushina E.N.1, Mustafina O.K.1, Markova Yu.M.1, Bykova I.B.1, Masyutin A.G.2, Gmoshinsky I.V.1, Khotimchenko S.A.1, 3
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», 119991, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian Federation
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Sechenov University), 119991 Moscow, Russian Federation
В настоящее время бентонитовая наноглина (НГ), получаемая из природного осадочного минерала бентонита и содержащая более 90% монтмориллонита, широко используется в пищевой промышленности в качестве технологических вспомогательных средств - адсорбентов при очистке растительных масел и производстве напитков. Глинистые минералы применяются также в качестве пищевых добавок и компонентов композитных упаковочных материалов.
Финансирование. Работа выполнена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 0529-2019-0057). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Шипелин В.А., Шумакова А.А., Мусаева А.Д., Трушина Э.Н., Мустафина ОК., Маркова Ю.М., Быкова И.Б., Масютин А.Г., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Токсиколого-гигиеническая характеристика бентонитовой наноглины, применяемой в пищевой промышленности // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 3. С. 71-85. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10031 Статья поступила в редакцию 27.04.2020. Принята в печать 18.05.2020.
Funding. The study was supported by the subsidy for the fulfillment of the State Assignment within the framework of the Fundamental Research Program (Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, project 0529-2019-0057). Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For citation: Shipelin V.A., Shumakova A.A., Musaeva A.D., Trushina E.N., Mustafina O.K., Markova Yu.M., Bykova I.B., Masyutin A.G., Gmoshinsky I.V., Khotimchenko S.A. Peroral toxicological assessment of bentonite nanoclay used in the food industry. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (3): 71-85. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10031 (in Russian) Received 27.04.2020. Accepted 18.05.2020.
В исследованиях in vitro различные формы НГ проявляли цитотоксичность в отношении ряда клеточных линий, а имеющиеся данные о пероральной токсичности НГ in vivo противоречивы.
Цель настоящего исследования - оценка острой пероральной токсичности НГ и ее токсиколого-гигиеническая характеристика в подостром 92-суточном эксперименте на крысах линии Вистар при ежедневном пероральном поступлении в дозах 1, 10 и 100 мг на 1 кг массы тела.
Материал и методы. Острую токсичность НГ оценивали на 8 самцах и 8 самках крыс с исходной массой тела 236+10 и 203±10 г соответственно. НГ вводили в виде водной дисперсии внутрижелудочно через зонд в дозе 5,0 г на 1 кг массы тела. По окончании эксперимента на 14-е сутки выполняли обзорное патологоанатомическое исследование органов грудной клетки и брюшной полости. Подострый эксперимент проведен на 64 крысах-самцах с исходной массой тела 117+7 г. У крыс оценивали уровень тревожности и функцию памяти, используя тест «Условный рефлекс пассивного избегания». На 90-е сутки изучали уровень экскреции креатинина и селена с суточной мочой. По окончании эксперимента у животных оценивали интегральные показатели, состояние барьерной функции желудочно-кишечного тракта, в крови исследовали гематологические и биохимические показатели, в печени определяли содержание небелковых тиолов и количество клеток в апоптозе, в содержимом слепой кишки изучали состояние культивируемых популяций микробиома. Результаты. Изучение острой токсичности НГ показало отсутствие гибели крыс и специфических патологических изменений во внутренних органах в дозе 5 г на 1 кг массы тела, что позволило отнести НГ к V классу опасности. Тем не менее в условиях 92-суточного эксперимента НГ оказывала некоторые неблагоприятные биологические воздействия на организм крыс. Так, уже при ее дозе 1 мг на 1 кг массы тела наблюдалось резкое угнетение роста симбиотической бифидофлоры, возрастание количества тромбоцитов, повышение содержания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и отношения ЛПНП/липопротеины высокой плотности (ЛПВП) вместе с наличием у животных гипертригли-церидемии. При дозе 10 мг на 1 кг массы тела было установлено увеличение массы селезенки и снижение коэффициента де Ритиса аспартат-/аланинаминотрансфераза (АСТ/АЛТ), при дозе 100 мг на 1 кг массы тела - сдвиги в лейкоцитарной формуле крови, избыточный рост энтерококков в слепой кишке, статистически значимо повышенная масса тела животных, снижение АСТ/АЛТ и уровня азотистых метаболитов сыворотки крови, косвенно свидетельствующего о торможении катаболических процессов. Вместе с тем наибольшая доза НГ блокировала кишечное всасывание белкового антигена - овальбумина.
Заключение. Проведенные исследования показали, что НГ проявляет различные токсические и нетоксические эффекты воздействия на организм в основном при дозе 100 мг на 1 кг массы тела, тем не менее ее максимальная недействующая доза (NOAEL) при ежедневном пероральном 92-дневном поступлении составляет, по-видимому, менее 1 мг на 1 кг массы тела.
Ключевые слова: наноглина, монтмориллонит, пероральная токсичность, класс опасности, максимальная недействующая доза, микробиом
Bentonite nanoclay (NC) manufactured from the natural sedimentary mineral bentonite contains more than 90% montmorillonite. Currently, it is widely used in food industry as processed aids - adsorbents for the purification of vegetable oils and beverages. Clay minerals have also applications as food additives and components in composite package materials. In vitro studies have shown that various forms of NC exerted cytotoxicity in many cell lines, whereas in vivo evidence of NC oral toxicity is contradictory. Therefore, this study aimed to assess the acute oral toxicity of NC and to evaluate its toxicological characteristics in a subacute 92-day experiment on Wistar rats with a daily oral administration in doses of 1, 10, and 100 mg/kg body weight (bw). Material and methods. The NC acute toxicity was evaluated in 8 male and 8 female rats with the initial bw 236+10 and 203 ± 10 g, respectively. NC was administered as an aqueous dispersion intragastric ally at a dose of 5 g/kg bw. On the 14th day (end of the experiment), an autopsy of the chest and abdominal organs was performed. The subacute experiment was carried out on 64 male rats with an average initial bw of 117+7 g. During the experiment the levels of anxiety and memory function were evaluated using the test "Conditional reflex of passive avoidance". On the 90th day of the experiment, diurnal urinary excretion of creatinine and selenium was evaluated. At the end of the experiment, the integral parameters, the state of the intestinal wall permeability were assessed. Hematological and biochemical parameters were examined in blood, the content of non-protein thiols and the number of cells in apoptosis were determined in liver, and the state of cultivated microbiome populations was studied in cecum. Results. The results of the determination of NC acute toxicity showed the absence of rat's mortality and specific pathological changes in the internal organs at a dose as large as 5000 mg/kg bw, which allowed attributing NC to the Vhazard class. Nevertheless, under the conditions of the 92-day experiment, NC caused some adverse biological effects on rat's organism. So, even at an NC dose of 1 mg/kg bw, there was a sharp inhibition of the symbiotic bifidobacterium growth, an increase in platelet count, in LDL and the LDL/HDL ratio, together with the presence of hypertriglyceridemia. At a dose of 10 mg/kg bw, an increase in spleen mass and a decrease in the de Ritis coefficient (AsAT/AlAT) were established. At a dose of 100 mg/kg bw there were shifts in the leukocyte blood count, an excessive enterococci growth in the cecum, significantly increased animal bw, along with the decrease of AsAT/AlAT and the level of serum nitrogen metabolites, indirectly indicating inhibition of catabolic processes. However, at the highest dose of NC, intestinal absorption of the protein antigen - ovalbumin, was apparently completely blocked.
Conclusion. The data obtained have shown that NC has potentially adverse effects on the rats mainly at a dose of 100 mg/kg bw, nevertheless, its NOAEL in the 92-day daily oral exposure experiment is probably less than 1 mg/kg bw. Keywords: nanoclay, montmorillonite, oral toxicity, hazard class, NOAEL, microbiome
Глины (филлосиликаты, слоистые алюмосиликаты) находят разнообразное применение в пищевой промышленности. Благодаря способности пластинок глины блокировать диффузию молекул газов, полимерные
композиты, содержащие органически модифицированные глины, применяются при производстве газобарьерных упаковочных материалов [1]. В значительных количествах глины используются в качестве техноло-
гических вспомогательных средств - адсорбентов при очистке растительных масел и производстве напитков [2, 3]. Такие виды глинистых минералов, как алюмосиликаты натрия, калия и кальция (Е554-Е556), бентонит (Е558) и каолин (Е559) относятся к числу разрешенных пищевых добавок1. Потребление в пищу так называемой съедобной глины широко распространено в ряде африканских стран [4] и рассматривается как средство профилактики энтеральных инфекций и афлатоксико-зов [5]. Существуют разработки по использованию глин в качестве носителей для пероральной доставки лекарственных средств [6] и витаминов [7].
В результате модификации катионными поверхностно-активными веществами и (или) интенсивной механической обработки (ультразвук) происходит расщепление (эксфолиация) объемных глинистых минералов на индивидуальные алюмосиликатные пластины толщиной <2 нм [8]. Такой вид продукции рассматривается как наноматериал, за которым закреплен термин «наноглина» (НГ). Поперечный диаметр нанопластин НГ может находиться как в нанодиапазоне (<100 нм), так и значительно превосходить его. Известна также модификация галуазитовой НГ, представленная нано-трубками [9].
По данным многочисленных исследований, различные формы НГ обладают цитотоксичностью в отношении большого числа линий как нормальных, так и трансформированных клеток животных и человека [10]. Имеются данные о наличии у НГ пероральной токсичности [11]. В отдельных работах показано наличие у них проок-сидантных свойств [12] и генотоксичности [13], а также неблагоприятное влияние на состав и функциональную активность кишечного микробиоценоза [14]. Это создает источник потенциального риска для здоровья человека при поступлении с пищей НГ или их остаточных количеств, мигрировавших из упаковки или технологических вспомогательных средств.
Цель настоящего исследования - выявление биологических эффектов и установление максимальной недействующей дозы для образца НГ, производимого российской промышленностью и рекомендованного к использованию в качестве технологического вспомогательного средства, в остром и подостром 92-суточном экспериментах на крысах при пероральном пути поступления.
Материал и методы
Используемый наноматериал
В работе использовали бентонитовую НГ «Монамет 1Н1®» (АО «МЕТАКЛЭЙ», Россия). Согласно спецификации производителя, НГ была получена путем химической и физико-химической обработки природного осадочного
минерала бентонита, содержит >90% монтмориллонита и <1% механических примесей (кремнезема, кварцевого песка и др.). Для приготовления дисперсий НГ использовали деионизованную воду из установки «Milli-Q» (Merck, Германия). Диспергирование осуществляли в течение 20 мин на погружном ультразвуковом (УЗ) процессоре с охлаждением, при средней мощности 2 Вт/см3. Приготовленную суспензию вводили внутри-желудочно и в рацион не более чем через 30 мин после УЗ-обработки.
Электронно-микроскопическое исследование водных дисперсий НГ выполняли на электронном микроскопе JEM-2100 (Jeol, Япония) с возможностью измерений методом энергодисперсионной микроспектрометрии (ЭДМС) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Характеристику размера частиц дисперсии НГ методом динамического рассеяния света осуществляли на приборе «Nanotrack Wave» (Microtrac Inc., США) с использованием пакета программ FLEX 11.0.0.1.
Дизайн биологического эксперимента
В исследованиях использовали крыс линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России». Работу выполняли в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики.
В эксперименте № 1 по изучению острой токсичности использовали 8 самцов и 8 самок крыс с исходной массой тела 236±10 и 203±10 г соответственно. После недельной адаптации к условиям вивария крысам вводили НГ в виде водной дисперсии концентрацией 10 мас. % внутриже-лудочно через зонд, двукратно с 2-часовым интервалом в суммарной дозе 5,0 г на 1 кг массы тела. Наблюдение за состоянием животных осуществляли в течение 6 ч после введения НГ и далее ежесуточно на протяжении 13 сут в соответствии с ГОСТ 32644 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности». Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки путем ингаляции CO2 и выполняли обзорное патологоанатомическое исследование органов грудной клетки и брюшной полости.
В эксперименте № 2 по изучению подострой токсичности использовали 4 группы по 16 самцов крыс исходной массой 80±10 г. После недельной адаптации крысы 1-4-й групп в течение последующих 92 сут получали полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93 с добавлением водной дисперсии НГ в расчетных дозах 0 (контроль); 1; 10 и 100 мг на 1 кг массы тела в условиях неограниченного доступа. Количество потребленного корма регистрировали ежедневно и при необходимости корректировали содержание НГ в рационе для поддержания ее стабильной дозы. Воду для питья получали в установке обратного осмоса «Milli-RO» (Waters, США).
1 ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств», приложение 2.
В ходе наблюдения ежедневно оценивали общее состояние животных; массу тела определяли с недельными интервалами. На 65, 66 и 86-е сутки опыта оценивали уровень тревожности и когнитивную функцию, используя тест «Условный рефлекс пассивного избега-
ния» (УРПИ) в соответствии с [15]. Сбор суточной мочи выполняли на 90-е сутки опыта, помещая животных в метаболические клетки.
Животных выводили из эксперимента на 93-и сутки после 16-часового голодания путем обескровливания
В/С
* Ф
Ив
500 нм
„ N
Г/D
. . ''i i'I^T . . 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Энергия, кэВ Energy, keV
Д/Е
кЭВ
Щм о -с
-О s I
и
со ТО со Í5
S со аз со СО
«
J .о eg -J.-g® - §
о^ ТО
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
10,000
о
га _
â з И
Г CD "ï^ ^
: i— -S¿
i üÜ -s
: 2 ^ . «О
! S О €
Ü ^ ■ S
а
10 100 Размер частиц, нм Particle size, nm
Е/F
Рис. 1. Характеристика препарата бентонитовой наноглины
А-Г - электронные микрофотографии частиц наноглины, осажденных на подложке из формвара, смонтированной на медной сетке, микроскоп JEM-2100 (Jeol, Япония), напряжение 80 кВ, увеличение х32 000 (А), х40 000 (Б-Г); Д - спектр ЭДМС от образца наноглины; E - распределение частиц наноглины по гидродинамическому диаметру по данным динамического рассеяния света.
Fig. 1. Characterization of the bentonite nanoclay preparation
A-D - electron micrographs of nanoclay particles deposited on a substrate from formwar mounted on a copper grid, JEM-2100 microscope (Jeol, Japan), voltage 80 kV, magnification x32 000 (A) x40 000 (B-D); E - EDX spectrum from a nanoclay sample; F - the distribution of bentonite nanoclay particles by the hydrodynamic diameter according to the DLS data.
А/А
Б/В
1000
cd
_Û съ
о ^ s ^
; ° S Ъ
съ
■в S3
о Q
100
10
0
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91
Сутки эксперимента/Day experiment —♦— 1-я группа/Р group 3-я группа/3" group 2-я группам group -*- 4-я группа/4й group
Рис. 2. Фактически потребленная доза бентонитовой наноглины (А) и средняя масса тела (Б) крыс 1-4-й групп на протяжении подо-строго эксперимента
Статистически значимое (p<0,05) отличие согласно критерию Манна-Уитни: * - от показателя 1-й группы (контроль); # - от показателя 2-й и 3-й групп.
Fig. 2. Actually consumed dose of bentonite nanoclay (a) and average body weight (b) of rats in groups 1-4 during the experiment
* - the difference with 1st group (control) is significant, p<0.05, Mann-Whitney test; # - the difference with 2nd group and 3rd is significant, p<0.05, Mann-Whitney test.
из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. За 3 ч до эвтаназии крысам вводили внутрижелу-дочно через зонд куриный овальбумин (ОВА) в дозе 2 г на 1 кг массы тела. На секции определяли массу внутренних органов (печень, почки, селезенка, сердце, легкие, тимус, надпочечники, головной мозг), отбирали кровь для исследования концентрации антигенного ОВА, гематологических и биохимических показателей, печень для определения содержания небелковых тиолов и количества клеток в апоптозе. Содержимое слепой кишки асептически собирали в стерильные бакпечатки для микробиологического исследования.
Содержание антигенного ОВА в сыворотке крови определяли с помощью твердофазного двухвалентного
иммуноферментного теста [16]. Всасывание ОВА в кровь (в процентах от введенной дозы) рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% массы тела, и с учетом величины гематокрита.
Гематологические показатели определяли в цельной крови стандартными методами на гематологическом анализаторе «Coulter AC TTM 5 diff OV» (Beckman Coulter, США) с набором реагентов (Beckman Coulter, Франция). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре «FC 500» (Beckman Coulter International S.A., Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннексином V и 7-аминоактино-мицином (7-AAD) [17].
Таблица 1. Результаты тестирования поведенческих реакций крыс в тесте «Условный рефлекс пассивного избегания» Table 1. Test results of rats' behavioral reactions in passive avoidance reaction test
Группа Group n Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight Латенция, с, M±m Latency, s, M±m Краткосрочная память,% Short-term memory, % Долгосрочная память, % Long-term memory, %
1-я 1st 16 0 32,9±9,8 88 69
2-я 2nd 16 1 42,8±11,0 94 81
3-я 3rd 16 10 27,6±2,7 75 75
4-я 4th 16 100 18,6±3,6 94 88
А/А
Б/В
0-
♦ t
г ♦
♦ %
♦ ♦
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
,
100 90
80706050403020 10 0
I ♦
♦ 5
♦ ♦
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
В/С
120
100
M
км ol
= E
а
e
* §
о С
80
60
40
20
♦ ♦
♦ ♦ ♦ ♦
♦ ♦
♦ ♦ ♦
10
100
Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
0
0
Рис. 3. Индивидуальные значения концентрации антигенного куриного овальбумина в крови крыс (А), удельной экскреции селена (Б), содержания восстановленных тиолов в печени (В)
• - различие с 1-й группой статистически значимо, р<0,05, критерий Манна-Уитни.
Fig. 3. Individual values of absorption of antigenic ovalbumin in rat blood (A), specific excretion of selenium (B), and content of reduced thiols in the liver (C)
• - the difference with 1st group is significant, p<0.05, Mann-Whitney test.
В сыворотке крови определяли биохимические показатели [(содержание глюкозы, холестерина общего и ли-попротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов, общего белка, альбуминов, мочевины, мочевой кислоты, активности трансаминаз - аланин- (АЛТ) и аспартат-аминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы)] по стандартным методикам на биохимическом анализаторе «Konelab 20i» (Финляндия); активность глутати-онпероксидазы - спектрофотометрическим методом, согласно [18], с незначительными модификациями. Содержание в печени восстановленного глутати-она определяли спектрофотометрическим методом с 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (реактив Эл-лмана) [20]. Содержание креатинина в моче определяли
спектрофотометрическим методом с пикриновой кислотой, селена - спектрофлуориметрическим методом с 2,3-диаминонафталином [20].
При оценке состояния микробиоты слепой кишки содержание бифидобактерий определяли на среде ГМК; лактобацилл - на MRS-агаре; энтеробактерий - на среде Эндо, цитратассимилирующих энтеробактерий - на ци-тратном агаре Симмонса, Staphylococcus spp. - на агаре Байрд-Паркера; Enterococcus spp. - на азидном агаре с канамицином и эскулином; Bacteroides spp. - на жел-чно-эскулиновом агаре для бактероидов; дрожжей и плесневых грибов - на среде Сабуро с хлорамфенико-лом (0,1 г/л). Инкубирование анаэробных микроорганизмов осуществляли с использованием пакетов для хими-
Таблица 2. Интегральные показатели (M±m) крыс на 93-и сутки эксперимента
Table 2. Integral indices (M±m) of rats on the 93rd day of the experiment
Показатель Indicator Группа Group P (ANOVA для 1-4-й групп) P (ANOVA for groups 1-4)
1-я(n=10) 1st (n=10) 2-я (n=10) 2nd (n=10) 3-я (n=10) 3'd (n=10) 4-я (n=10) 4th (n=10)
Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight 0 1 10 100 -
Масса тела, г Body weight, g 383±14 432±16 412±12 447±21* 0,042
Печень Liver re т ew ° ж 5 о м b 5 о 2,51±0,12 2,77±0,08 2,59±0,10 2,59±0,09 >0,1
Селезенка Spleen 0,18±0,01 0,19±0,03 0,27±0,01* 0,25±0,02* 0,002
Сердце Heart 0,28±0,01 0,29±0,01 0,30±0,01 0,29±0,01 >0,1
Почки Kidneys 0,50±0,01 0,51 ±0,01 0,53±0,02 0,51 ±0,02 >0,1
Надпочечники Adrenal glands 0,017±0,001 0,015±0,001 0,018±0,001 0,019±0,002 >0,1
Тимус Thymus 0,13±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01 0,13±0,01 >0,1
Легкие Lungs 0,46±0,02 0,51±0,06 0,47±0,02 0,46±0,02 >0,1
Головной мозг Brain 0,51 ±0,02 0,48±0,02 0,48±0,01 0,46±0,02* >0,1
Гонады Gonads 0,91 ±0,03 0,83±0,03 0,86±0,03 0,85±0,05 >0,1
П р и м е ч а н и е. Статистически значимое (p<0,05) отличие согласно критерию Манна-Уитни: * - от показателя 1-й группы (контроль). N o t e. * - p<0.05 compared with 1st group.
ческого связывания кислорода «Oxoid™ AnaeroGen™» (Thermo Scientific, США). Количество микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы содержимого слепой кишки.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета SPSS 20.0. Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки. Величины, не имеющие нормального распределения (содержание микроорганизмов), характеризовали медианой и интервалами изменения. Вероятность принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок устанавливали согласно критерию Манна-Уитни, Кра-скела-Уоллиса и ANOVA. Достоверность различий долевых показателей оценивали с использованием критерия х2.Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты
Характеристика наноматериала
Электронно-микроскопическое исследование препарата НГ (рис. 1) показало его морфологическую гетерогенность с наличием, по крайней мере, трех типов структур: 1) нанопластин очень малой (заведомо менее 10 нм) толщины и диаметром как более (см. рис. 1, А), так
и менее 100 нм (см. рис. 1, Б); 2) наночастиц формы, близкой к сферической, диаметром 50-100 нм (см. рис. 1, В, Г) и 3) стержневидных структур диаметром около 50 нм и аспектным соотношением 10:1 или более (см. рис. 1, Б, В, Г). Качественная оценка химического состава материала методом спектров ЭДМС показала характерные для комплексного природного алюмосиликата пики кремния, алюминия, калия, кислорода, хлора, а также следовые количества кобальта и меди (последняя, возможно, является артефактом, связанным с использованием при монтаже образца медных сеток) (см. рис. 1, Д). Исследование методом динамического рассеяния света выявило полимодальное распределение по гидродинамическому диаметру различных агрегатов частиц в водной суспензии образца с максимумами при 333, 937, 1740 и более 6000 нм (см. рис. 1, Е). Таким образом, исследованный образец может рассматриваться как гетерогенный наноматериал, содержащий алюмо-силикатные нанообъекты (наночастицы, нанопластины, нанотрубки/наностержни), что совпадает с характеристиками НГ, известными из литературы [8-10].
Оценка острой токсичности наноглины
В результате однократного введения НГ в дозе 5,0 г на 1 кг массы тела гибели крыс (как самцов, так и самок) не наблюдали. В первые 1-3 ч после введения у части
Таблица 3. Гематологические показатели (M±m) крыс на 93-и сутки эксперимента Table 3. Hematological parameters (M±m) of rats on the 93rd day of the experiment
Показатель Indicator Группа Group P (ANOVA для 1-4-й групп) P (ANOVA for groups 1-4)
1-я (n=9) 1st (n=9) 2-я (n=9) 2nd (n=9) 3-я (n=9) 3rd (n=9) 4-я (n=10) 4th (n=10)
Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight 0 1 10 100 -
Эритроциты, x1012 л-1 Erythrocytes (EC), x10i2 l-i 8,31±0,14 8,41 ±0,10 8,40±0,13 8,39±0,14 >0,1
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/l 151±3 150±3 148±1 152±2 >0,1
Гематокрит, % Hematocrit, % 44,8±0,9 44,5±0,7 44,2±0,5 45,6±0,5 >0,1
Средний объем эритроцита, мкм3 The average volume of EC, microns3 53,7±0,3 53,0±0,4 52,2±0,6* 54,3±0,7 0,054
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг The average hemoglobin content in EC, pg 18,1 ±0,2 17,8±0,2 17,6±0,2 18,2±0,2 >0,1
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л The average concentration of hemoglobin in EC, g/l 337±1 337±1 336±1 334±1 >0,1
Лейкоциты, x109 л-1 White blood cells, x1091-1 15,0±1,3 14,9±1,4 16,0±1,5 15,7±1,4 >0,1
Нейтрофилы, % Neutrophils, % 35,7±2,2 34,4±2,3 40,6±2,8 28,7±2,5 0,016
Эозинофилы, % Eosinophils, % 1,93±0,34 1,64±0,30 2,03±0,22 1,41±0,27 >0,1
Базофилы, % Basophils, % 0,24±0,03 0,34±0,04 0,26±0,05 0,43±0,06* 0,037
Лимфоциты, % Lymphocytes, % 54,9±2,3 58,1 ±1,8 53,8±3,5 62,8±2,6* 0,08
Моноциты, % Monocytes, % 7,10±0,56 5,73±0,67 5,98±0,43 6,71 ±0,32 >0,1
Тромбоциты, x109 л-1 Platelets, x1091-1 662±20 755±32* 657±24 658±22 0,023
Средний объем тромбоцита, мкм3 The average platelet volume, microns3 6,44±0,09 6,23±0,06 6,51 ±0,12 6,57±0,09 0,072
Тромбокрит, % Thrombocrit, % 0,43±0,02 0,47±0,02 0,43±0,02 0,43±0,01 >0,1
П р и м е ч а н и е. Статистически значимое (p<0,05) отличие согласно критерию Манна-Уитни: * - от показателя 1-й группы (контроль). N o t e. * - p<0.05 compared with 1st group.
животных обеих групп наблюдали снижение подвижности, учащенное и более глубокое, чем обычно, дыхание, что, по-видимому, было неспецифической реакцией, обусловленной большим объемом вводимой внутриже-лудочно жидкости и ее высокой вязкостью при данной концентрации НГ. Впоследствии на протяжении 13 сут все животные имели нормальный внешний вид, стул, аппетит, были подвижными, прибавляли в массе тела. Патологоанатомическое исследование на 14-е сутки не выявило специфических патологических изменений во внутренних органах, за исключением гранулема-тозных новообразований одного (в 2 случаях) и двух (в 1 случае) яичников у самок крыс, что в целом характерно для животных данной линии и возраста. Таким
образом, среднелетальную дозу (Ш50) для НГ в данном эксперименте количественно установить не представилось возможным; во всяком случае ее величина, превосходит 5 г на 1 кг массы тела, что позволяет отнести НГ к классу малоопасных веществ (V класс опасности)2.
Биологические эффекты наноглины при подостром пероральном введении
На протяжении эксперимента крысы всех четырех групп имели нормальный внешний вид, аппетит, двигательную активность, стул; летальность и заболеваемость не отмечены. Фактически потребленные дозы НГ в группах животных стабильно поддерживались на протяжении эксперимента (рис. 2, А). Вместе с тем
2 ГОСТ 32644. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности.
А/А
200 п
_ 180-
I
■ Ц160-|
s
140-
■ о
'120-
0
_L
АСТ/ASAT
J_L
J_L
*
I
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
Б/В
О ft
О ^
<*> <5 о -2 ^ to о- С cd сь
^ е
СО
-
со
CD LÛ
4,00-| 3,503,002,50/
_L
АСТ/АЛТ AsAT/AlAT
p<0,05
J_L
m
J_L
*
I
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
В/С
140-1 |S130-
° S
i Ü120-I
« is
Q- Ç I- съ
^ о
CD Cr
з-о
Мочевая кислота/Uric acid
Г/D
Креатинин/Creatinine
p<0,05 p<0,05
56 -|
11010090-
0^J—L
*
I
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
Ь54 ü52 I ^ 50
i'l 48 - ra
S.tS 46
I- a.
е n44 jo
42 0
z.
*
П
0 1 10 100 Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight
Рис. 4. Активность аспартатаминотрансферазы (А), отношение активности аспартат-/аланинаминотрансферазы (коэффициент де Ритиса) (Б), концентрация мочевой кислоты (В) и креатинина (Г) в сыворотке крови крыс
* - различие с 1-й группой (контроль) статистически значимо, p<0,05, критерий Манна-Уитни; горизонтальная скобка - распределение в группах неоднородно, p<0,05, ANOVA.
Fig. 4. AsAT activity (A), AsAT/AlAT activity ratio (de Ritis coefficient) (B), uric acid (C) and creatinine (D) level in rat serum
* - the difference with 1st group (control) is significant, p<0.05, Mann-Whitney test; horizontal bracket - the distribution in groups is heterogeneous, p<0.05, ANOVA.
уже с первых недель кормления крысы, получавшие НГ в максимальной дозе (100 мг на 1 кг массы тела), статистически значимо быстрее прибавляли в массе тела (рис. 2, Б), несмотря на практически идентичную пищевую и энергетическую ценность опытных рационов. Изучение показателей тревожности, краткосрочной и долгосрочной памяти в тесте УРПИ (табл. 1) показало, что у крыс 4-й группы, получавшей максимальную дозу НГ, отмечалось некоторое снижение времени латенции захода в темное отделение установки, что может указывать на повышение тревожности, однако данное различие было статистически незначимым (р>0,1). Достоверных различий в показателях краткосрочной и долгосрочной памяти также не выявлено.
Определение кишечного всасывания макромолекул ОВА (рис. 3, А) показало отсутствие различий по этому показателю в пределах групп крыс с 1-й по 3-ю; измеренные уровни антигенного ОВА были типичными для животных данного возраста. Однако в 4-й группе, полу-
чавшей НГ в максимальной дозе (100 мг на 1 кг массы тела), антигенный ОВА в крови не был выявлен в пределах чувствительности метода (-0,5 нг/мл) ни у одной из 10 протестированных крыс, что отвечает статистически значимому (p<0,001, U-критерий Манна-Уитни) снижению по сравнению с контролем.
Для интегральных показателей крыс при выведении из эксперимента (табл. 2) было характерно дозозависи-мое статистически значимое (p<0,002, ANOVA) повышение относительной массы селезенки, начиная с дозы НГ 10 мг на 1 кг массы тела.
У животных, получавших НГ в дозе 100 мг на 1 кг массы тела, также отмечалось статистически значимое возрастание абсолютной массы тела и небольшое, но статистически значимое снижение относительной массы головного мозга.
Анализ гематологических показателей (табл. 3) показал отсутствие влияния НГ на состояние эритроцитов, за исключением тенденции (p=0,054, ANOVA) к снижению
Таблица 4. Показатели микробиоценоза слепой кишки крыс на 93-и сутки эксперимента, Ме (min-max) Table 4. Indices of the cecum microbiocenosis in rats on the 93rd day of the experiment Me (min-max)
Показатель Indicator Группа Group P (ANOVA для 1-4-й групп) P (ANOVA for groups 1-4)
1-я (n=8) 1st (n=8) 2-я (n=8) 2nd (n=8) 3-я (n=8) 3rd (n=8) 4-я (n=8) 4th (n=8)
Доза бентонитовой наноглины, мг на 1 кг массы тела Dose of bentonite nanoclay, mg/kg body weight 0 1 10 100 -
КОЕ/г содержимого CFU/g of content
Анаэробы, сумма Anaerobes, amount 9,75 (8,83-10,0) 9,16 (8,64-10,1) 9,47 (8,30-9,90) 9,11 (8,70-10,0) >0,1
Аэробы, сумма Aerobes, amount 7,96 (7,30-8,94) 8,08 (7,81-8,85) 8,27 (6,30-8,88) 8,17 (8,00-9,40) >0,1
Бифидобактерии Bifidobacteria 8,00 (7,00-9,00) < 7,00* (<7,00-8,00) 7,00* (<7,00-8,00) 7,00 (<7,00-9,00) 0,016
Лактобациллы Lactobacilli 8,41 (7,08-9,26) 8,55 (7,08-9,20) 8,57 (8,00-9,58) 8,00 (7,60-8,78) >0,1
Бактероиды Bacteroids 9,30 (8,41-9,87) 9,23 (8,38-9,70) 9,27 (8,76-9,56) 9,03 (8,34-9,54) >0,1
Энтеробактерии Enterobacteria 7,13 (5,68-8,60) 6,08 (4,78-7,30) 5,80 (4,30-8,64) 6,14 (5,15-7,70) >0,1
Энтерококки Enterococci 5,78 (5,3-6,15) 5,72 (5,30-7,08) 5,69 (5,30-6,66) 6,22* (5,30-6,72) >0,1
Сумма цитратассимилирующих Amount of Citrate Assimilating 5,97 (<5,30-7,60) <5,30 (<5,30-6,48) 5,45 (<5,30-6,78) 5,47 (<5,30-8,36) >0,1
Стафилококки Staphylococci 6,12 (4,90-7,30) 6,06 (5,20-6,78) 6,25 (4,78-6,63) 5,99 (5,00-6,90) >0,1
Аэробы гемолитические Hemolytic aerobes 7,41 (<6,30-7,86) 7,88 (<6,30-8,85) 6,84 (<6,30-8,26) 7,88 (<6,30-8,38) 0,068
Анаэробы гемолитические Hemolytic anaerobes 9,34 (<7,30-9,90) 9,12 (7,90-9,60) 9,3 (8,30-9,60) 9,02 (<7,30-9,90) >0,1
Сульфитредуцирующие клостридии Sulphite-reducing clostridia 6,00 (<6,00-7,00) <6,00 (<6,00-8,00) 6,00 (<6,00-7,00) 6,00 (6,00-7,00) >0,1
Дрожжи Yeast 5,02 (<2,30-6,70) 5,39 (2,30-6,15) 5,37 (<2,30-6,46) 4,44 (<2,30-6,48) >0,1
Плесени Mold 2,75 (<2,30-5,72) 2,78 (2,30-5,38) 2,84 (2,60-4,15) 2,99 (2,30-5,11) >0,1
П р и м е ч а н и е. Статистически значимое (р<0,05) отличие согласно критерию Манна-Уитни: * - от показателя 1-й группы (контроль).
N o t e. * - the difference with 1st group was significantly p<0.05.
среднего объема клеток в 3-й группе. Различия в лейкоцитарной формуле крови были более существенными: в 4-й группе, при дозе НГ 100 мг на 1 кг массы тела достоверно возрастало количество лимфоцитов и базо-филов и снижалось - нейтрофилов (p<0,016, ANOVA). Небольшое по абсолютной величине, но статистически значимое возрастание количества тромбоцитов отмечалось только во 2-й группе при наименьшей дозе НГ.
Потребление крысами НГ не оказывало достоверного влияния на апоптоз клеток печени (данные не показаны). Количество живых клеток, клеток на ранней и поздней стадии апоптоза и мертвых клеток во всех 4 группах животных соответствовало ранее установленной вну-трилабораторной норме [17]. НГ также не оказывала влияния на содержание восстановленных тиолов в ткани печени (рис. 3, В). Оценка статуса селена по его удель-
ной (в расчете на содержание креатинина) экскреции с мочой (см. рис. 3, Б) показало аномальное возрастание этого показателя у 3 из 8 протестированных животных в 3-й группе (доза 10 мг на 1 кг массы тела). У остальных 5 животных этой группы экскреция не отличалась от контроля. Активность селен-зависимой глутатионперок-сидазы эритроцитов в данной группе крыс не изменялась по сравнению с контролем (1-я группа: 0,364±0,020; 2-я группа - 0,428±0,021; 3-я группа - 0,370±0,018; 4-я группа - 0,359±0,018 мкмоль/мин на мг белка; p>0,05 ANOVA по фактору «доза»). Можно заключить, что убедительных свидетельств нарушения статуса селена под действием НГ не получено.
Определение биохимических показателей плазмы крови крыс показало отсутствие влияния НГ в дозах до 100 мг на 1 кг массы тела включительно на уровни глюкозы, общего холестерина и холестерина ЛПВП,
общего белка, альбумина, глобулинов, активности АЛТ и щелочной фосфатазы (p>0,1, ANOVA во всех указанных случаях). Средний уровень триглицеридов в плазме крыс во 2-й группе при наименьшей дозе НГ составил 1,42±0,21 ммоль/л и был на 60% выше, чем в контроле (0,89±0,12 ммоль/л, p<0,05, U-критерий Манна-Уитни). Соответственно, в этой группе расчетное содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и отношение ЛПНП/ЛПВП было статистически значимо выше. В 3-й и в 4-й группах все показатели липидного обмена значимо от контроля не отличались. Активность АСТ во всех группах животных не выходила за пределы нормальных значений, но была достоверно снижена в сравнении с контролем при дозах НГ 10 и 100 мг на 1 кг массы тела (рис. 4, А). Для этих же двух групп было характерно достоверное снижение коэффициента де Ритиса (АСТ/АЛТ) [21] (рис. 4, Б) и уровня мочевой кислоты (рис. 4, В). Содержание креатинина было незначительно по абсолютной величине, но статистически значимо снижено во всех группах крыс, получавших НГ (рис. 4, Г); данный показатель не выходил за пределы интервала нормы. В совокупности полученные данные указывают на признаки угнетения катаболизма белка под действием НГ, по крайней мере при двух более высоких ее дозах.
Результаты анализа основных и транзиторных компонентов микробиома слепой кишки (табл. 4) показывают, что потребление НГ во всем изученном интервале доз приводит к угнетению роста бифидофлоры (p=0,016, критерий Краскела-Уоллиса). При наибольшей дозе (100 мг на 1 кг массы тела) также наблюдается повышенный рост энтерококков (статистически значимый) и гемолитических аэробных микроорганизмов (на уровне тенденции, p=0,068, критерий Краскела-Уоллиса).
Обсуждение
Как показало проведенное исследование, использованный образец бентонитовой НГ при пероральном введении крысам практически не обладает острой токсичностью (вещество V класса опасности), но способен оказывать ряд биологических воздействий на организм крыс при подостром 92-суточном введении, причем некоторые из этих воздействий могут быть охарактеризованы как неблагоприятные (токсические). Так, уже при дозе 1 мг на 1 кг массы тела наблюдается резкое угнетение роста полезной симбиотической бифидоф-лоры, что качественно совпадает с данными работы [14], в которой отмечалось снижение ее функциональной активности; при дозе 10 мг на 1 кг массы тела и более выявлено увеличение массы селезенки, при дозе 100 мг на 1 кг массы тела - сдвиги в лейкоцитарной формуле крови, избыточный рост энтерококков в слепой кишке. При этой же дозе НГ наблюдается более высокая масса тела животных, снижение коэффициента де Ритиса (АСТ/АЛТ), уровня азотистых метаболитов сыворотки крови, что может свидетельствовать о торможении ката-
болических процессов [22]. С другой стороны, при наибольшей из доз НГ практически полностью блокируется кишечное всасывание модельного белкового антигена -ОВА. Полученный результат согласуется с данными исследований, в которых была показана способность НГ снижать кишечную абсорбцию различных токсических веществ [5]. Подобные эффекты обычно связываются с наличием у глин сорбционных свойств. Однако для выяснения действительных причин влияния НГ на барьерную функцию кишки необходимо проведение дополнительных, в частности морфологических, исследований.
При минимальной дозе НГ отмечалось наличие у животных гипертриглицеридемии, что, однако, не получило подтверждения при более высоких дозах.
Основным ограничением в интерпретации полученных данных является гетерогенность образца НГ по морфологии частиц, что не позволяет связать выявленные эффекты с действием определенного типа представленных алюмосиликатных нанообъектов (на-ночастиц, нанопластин или нанотрубок). Однако использованный образец представляет собой коммерческий препарат НГ, применяемый на практике в качестве технологического вспомогательного средства, ввиду чего его токсиколого-гигиеническая характеристика релевантна задаче обеспечения безопасности потребляемой человеком пищевой продукции, полученной с помощью НГ.
В настоящее время в литературе отсутствует единое мнение о потенциальной опасности НГ при поступлении в организм. Так, E. Murphy и соавт. [23] установили, что 4 вида филлосиликатов (монтмориллонит, природный бентонит, каолинит, цеолит) вызывали гибель клеток эндотелия человека в концентрациях от 0,01 до 0,1 мг/мл. P. Li и соавт. [24] выявили цитотоксичность монтморилло-нитовой НГ для клеток яичника хомяка в концентрации 1 мг/мл. М. Baek и соавт. [25] получили аналогичные результаты на клетках кишечного эпителия. Нанопла-стинки глины были цитотоксичными для трансформированных клеток легочного эпителия A549 в исследовании N. Verma и соавт. [26]. Нанотрубки галлуазита вызывали гибель клеток HeLa и MCF-7 в концентрации свыше 0,075 мг/мл [9]. В результате «активации» бентонита путем его обработки серной кислотой наблюдалось повышение цитотоксичности для В-лимфобластов человека [27, 28]. Нанодиски глины диаметром менее 50 нм (лапонит) были токсичными для линии эмбриональных клеток почки человека HEK и трансформированной клеточной линии SiHa [29]. С другой стороны, имеются данные об отсутствии у нативного и органически модифицированного монтмориллонита цито- и генотоксич-ности in vitro [30].
В большинстве исследований НГ in vivo они не вызывали общетоксических и гистопатологических изменений как при однократном (в остром опыте) [31, 32], так и при многократном пероральном введении в экспериментах продолжительностью до 196 сут [33-35] на грызунах. М. Baek и соавт. [25] оценили LD50 немодифицирован-
ного монтмориллонита для мышей величиной более 1000 мг на 1 кг массы тела ввиду отсутствия возможности тестирования дозы 2000 мг на 1 кг массы тела из-за высокой плотности раствора. M. Wiles и соавт. [36] сообщали об отсутствии токсичности или очень низкой токсичности немодифицированной НГ для беременных самок крыс Спрег-Доули, причем также не была выявлена и эмбриотоксичность. Однако ранее в работе Patterson и Staszak (цит. по [10]) были выявлены эффекты репродуктивной токсичности, состоящие в анемии у матерей и снижении массы тела новорожденного потомства после экспонирования каолином в количестве 20% по массе корма. D. Kibanova и соавт. [12] сообщили о способности некоторых глин повышать содержание маркеров окислительного стресса в супернатантах мозга. S. Maisanaba и соавт. [35], однако, не подтвердили повышение уровня липоперекисей, изменения активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатион^-трансферазы в печени и почках крыс, экспонированных в течение 40 сут органомодифициро-ванным монтмориллонитом, хотя активность каталазы, содержание ее белка и экспрессия гена в почках увеличивались. EFSA [13] приводит данные о том, что у крыс, получавших бентонит в течение 15 сут, происходят хромосомные аберрации, в то время как A. Sharma и соавт. [37] не наблюдали разрывов цепей ДНК в толстой кишке, печени и почках крыс Вистар, получавших через зонд органически модифицированную НГ двукратно в дозе 250-1000 мг на 1 кг массы тела.
В проведенном нами исследовании также не было выявлено достоверных неблагоприятных воздействий НГ на антиоксидантный статус организма крыс по показателям статуса селена, содержания тканевых тиолов печени и активности глутатионпероксидазы эритроци-
тов. Однако наблюдавшиеся сдвиги в лейкоцитарной формуле и увеличение массы селезенки косвенно свидетельствуют о развитии иммунной реакции, что требует дальнейшей оценки состояния системы иммунитета с помощью более специфических методов, позволяющих определить уровни цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в крови животных и степень их продукции культивируемыми клетками селезенки ex vivo. Наиболее правдоподобным объяснением этих эффектов может быть влияние НГ на состав кишечного микробиоценоза, что согласуется с данными литературы о бактерицидном или бактериостатическом действии НГ [38, 39], а также с результатами работы [14].
Заключение
Таким образом, проведенные исследования показали, что образец бентонитовой НГ, производимой в промышленных масштабах и рекомендованной к использованию в качестве технологического вспомогательного средства, может проявлять различные биологические эффекты для крыс при подостром пероральном поступлении, в числе которых признаки угнетения катаболизма белка вместе с увеличением массы тела, развитие иммунной реакции и угнетение роста бифидофлоры. Перечисленные потенциально неблагоприятные эффекты воздействия НГ на организм, с наибольшей степенью вероятности, связаны с угнетающим влиянием нанома-териала на развитие симбиотической кишечной микрофлоры. Максимальная недействующая доза НГ при 92-суточном поступлении составляет для изученного набора показателей, по-видимому, менее 1 мг на 1 кг массы тела.
Сведения об авторах
Шипелин Владимир Александрович (Vladimir A. Shipelin) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: v.shipelin@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0015-8735
Шумакова Антонина Александровна (Antonina A. Shumakova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: antonina_sh@list.ru https://orcid.org/0000-0003-1373-4436
Мусаева Анна Дмитриевна (Anna A. Musaeva) - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: anya.evstratova@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3424-740X
Трушина Элеонора Николаевна (Eleonora N. Trushina) - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: trushina@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-0035-3629
Мустафина Оксана Константиновна (Oksana K. Mustafina) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: mustafina@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-7231-9377
Маркова Юлия Михайловна (Yulia M. Markova) - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: yulia.markova.ion@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-2631-6412
Быкова Ирина Борисовна (Irina B. Bykova) - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: bykova@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-7288-312X
Гмошинский Иван Всеволодович (Ivan V. Gmoshinsky) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Масютин Александр Георгиевич (Alexandr G. Masyutin) - научный сотрудник кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Москва, Российская Федерация) E-mail: squiggoth@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-8067-4261
Хотимченко Сергей Анатольевич (Sergey A. Khotimchenko) - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий, первый заместитель директора ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: hotimchenko@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-5340-9649
Литература
1. Tayeb A.H., Tajvidi M. Sustainable barrier system via self-assembly of colloidal montmorillonite and cross-linking resins on nanocel-lulose interfaces // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2019. Vol. 11, N 1. P. 1604-1615. DOI: 10.1021/acsami.8b16659.
2. Разговорова М.П., Селявин А.В., Разговоров П.Б. Применение глин различного состава для выделения примесей растительных масел // Успехи в химии и химической технологии. 2011. № 25. С. 119-121.
3. Abdel-Wahhab M.A., El-Nekeety A.A., Hathout A.S., Sabery B.A., Ibrahim M.I., Gado R.A. et al. Preparation and characterization of organo-modifled nano montmorillonite and evaluation of its ability to adsorb aflatoxins, fumonisins and zearalenone from aqueous solution // Nano Sci. Tech. Open Lib. 2015. Vol. 1, N 1. P. 27-34.
4. Abrahams P.W., Davies T.C., Solomon A.O., Trow A.J., Wragg J. Human geophagia, calabash chalk and undongo: mineral element nutritional implications // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 1. Article ID e53304. DOI: 10.1371/journal.pone.005330.
5. Afriyie-Gyawu E., Wang Z., Ankrah N.A., Xu L., Johnson N.M., Tang L. et al. NovaSil clay does not affect the concentrations of vitamins A and E and nutrient minerals in serum samples from Ghanaians at high risk for aflatoxicosis // Food Addit. Contam. Part A. 2008. Vol. 25. P. 872-884. DOI: 10.1080/02652030701854758.
6. Rodrigues L.A., Figueiras A., Veiga F., de Freitas R.M.., Nunes L.C., da Silva Filho E.C. et al. The systems containing clays and clay minerals from modifled drug release: a review // Colloids Surf. B Biointerfaces. 2013. Vol. 103. P. 642-651. DOI: 10.1016/ j.colsurfb.2012.10.068.
7. Akbari Alavijeh M., Sarvi M.N., Ramazani Afarani Z. Properties of adsorption of vitamin B12 on nanoclay as a versatile carrier // Food Chem. 2017. Vol. 219. P. 207-214. DOI: 10.1016/j.food-chem.2016.09.140.
8. Jorda- Beneyto M., Ortuno N., Devis A., Aucejo S., Puerto M., Gutierrez-Praena D. et al. Use of nanoclay platelets in food packaging materials: technical and cytotoxity approach // Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2014. Vol. 31, N 3. P. 354-364. DOI: 10.1080/19440049.2013.874045.
9. Vergaro V., Abdullayev E., Lvov Y.M., Zeitoun A., Cingolani R., Rinaldi R. et al. Cytocompatibility and uptake of halloysite clay nanotubes // Biomacromolecules. 2010. Vol. 11, N 3. P. 820-826. DOI: 10.1021/bm9014446.
10. Maisanaba S., Pichardo S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., Cam-ean A.M., Jos A. Toxicological evaluation of clay minerals and derived nanocomposites: a review // Environ. Res. 2015. Vol. 138. P. 233-254. DOI: 10.1016/j.envres.2014.12.024.
11. Moosavi M. Bentonite clay as a natural remedy: a brief review // Iran. J. Public Health. 2017. Vol. 46, N 9. P. 1176-1183. PMCID: PMC5632318.
12. Kibanova D., Nieto-Camacho A., Cervini-Silva J. Lipid peroxida-tion induced by expandable clay minerals // Environ. Sci. Technol. 2009. Vol. 43, N 19. P. 7550-7555. DOI: 10.1021/es9007917.
13. EFSA. European Food Safety Authority. Scientiflc opinion on the safety and efflcacy of a preparation of bentonite- and sepiolite (Toxfin Dry) as feed additive for all species // EFSA J. 2013. Vol. 11, N 4. P. 1-21. DOI: 10.2903/j.efsa.2013.3179.
14. Смирнова В.В., Тананова О.Н., Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Авреньева Л.И., Быкова И.Б. и др. Токсиколого-гигие-ническая характеристика наноструктурированной бентонитовой глины // Гигиена и санитария. 2012. № 3. С. 76-78.
15. Loskutova L.V., Dubrovina N.I., Markel' A.L. Comparative analysis of the persistence of a conditioned passive avoidance reflex in rats with different forms of inherited hypertension // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. Vol. 37, N 6. P. 577-582.
16. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow's milk proteins in breast milk // Clin. Allergy. 1984. Vol. 14, N 6. P. 533-535.
17. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.
18. Разыграев А.В. Метод определения глутатионперокси-дазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клинико-лабораторный консилиум. 2004. № 4. С. 19-22.
19. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82, N 1. P. 70-77. DOI: 10.1016/0003-9861(59)90090-6.
20. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена // Журнал аналитической химии. 1995. Т. 50, № 8. С. 492-497.
21. Botros M., Sikaris K.A. The de Ritis ratio: the test of time // Clin. Biochem. Rev. 2013. Vol. 34, N 3. P. 117-130.
22. Рослый И.М. Биохимические показатели в медицине и биологии. Москва : МИА, 2015. 616 с.
23. Murphy E.J., Roberts E., Horrocks L.A. Aluminum silicate toxicity in cell cultures // Neuroscience. 1993. Vol. 55, N 2. P. 597-605.
24. Li P.R., Wei J.C., Chiu Y.F., Su H.L. Peng F.C., Lin J.J. Evaluation on cytotoxicity and genotoxicity of the exfoliated silicate nano-clay // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2010. Vol. 2. P. 1608-1613. DOI: 10.1021/am1001162ro
25. Baek M., Lee J.-A., Choi S.-J. Toxicological effects of a cat-ionic clay, montmorillonite in vitro and in vivo // Mol. Cell. Toxicol. 2012. Vol. 8, N 1. P. 95-101. DOI: 10.1007/s13273-012-0012-xro.
26. Verma N.K., Moore E., Blau W., Volkov Y., Babu P.R. Cytotox-icity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis // J. Nanopart. Res. 2012. Vol. 14, N 9. P. 1137-1148. DOI: 10.1007/ s11051-012-1137-5.
27. Zhang M., Li X., Lu Y., Fang X., Chen Q., Xing M., He J. Studying the genotoxic effects induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro // Mutat. Res. 2011. Vol. 720. P. 62-66. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2010.12.009.
28. Zhang M., Lu Y., Li X., Chen Q., Lu L., Xing M. et al. Studying the cytotoxicity and oxidative stress induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro // Chem. Biol. Interact. 2010. Vol. 183, N 3. P. 390-396. DOI: 10.1016/ j.cbi.2009.11.023.
29. Rawat K., Agarwal S., Tyagi A., Verma A.K., Bohidar H.B. Aspect ratio dependent cytotoxicity and antimicrobial properties of nano-clay // Appl. Biochem. Biotechnol. 2014. Vol. 174, N 3. P. 936-944. DOI: 10.1007/s12010-014-0983-2.
30. SharmaA.K., Schmidt B., Frandsen H., Jacobsen N.R., Larsen E.H., Binderup M.L. Genotoxicity of unmodified and organo-modified montmorillonite // Mutat. Res. 2010. Vol. 700, N 1-2. P. 18-25. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2010.04.021.
31. Lee Y.H., Kuo T.F., Chen B.Y., Feng Y.K., Wen Y.R., Lin W.C. et al. Toxicity assessment of montmorillonite as a drug carrier for pharmaceutical applications: yeast and rats model // Biomed.
Eng. Appl. Basis Commun. 2005. Vol. 17. P. 72-78. DOI: 10.4015/ S1016237205000111.
32. Mascolo N., Summa V., Tateo F. In vivo experimental data on the mobility of hazardous chemical elements from clays // Appl. Clay Sci. 2004. Vol. 25, N 1-2. P. 23-28. DOI: 10.1016/ j.clay.2003.07.001.
33. Afriyie-Gyawu E., Mackie J., Dash B., Wiles M., Taylor J., Hueb-ner H. et al. Chronic toxicological evaluation of dietary NovaSil clay in Sprague-Dawley rats // Food Addit. Contam. 2005. Vol. 22, N 3. P. 259-269. DOI: 10.1080/02652030500110758.
34. Maisanaba S., Gutierrez-Praena D., Puerto M., Moyano R., Blanco A., Jorda M. et al. Effects of the subchronic exposure to organomodified clay for food packaging applications on Wistar rats // Appl. Clay Sci. 2014. Vol. 95. P. 37-40. DOI: 10.1016/j.clay.2014.04.006.
35. Maisanaba S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., Llana-Ruiz-Cabello M., Pichardo S., Mate A. et al. In vivo evaluation of activities and expression of antioxidant enzymes in Wistar rats exposed for 90 days to a modified clay // J. Toxicol. Environ. Health A. 2014. Vol. 77, N 8. P. 456-466. DOI: 10.1080/15287394.2013.876696.
36. Wiles M.W., Huebner H.J., Afriyie-Gyawu E., Taylor R.J., Bratton G.R., Phillips T.D. Toxicological evaluation and metal bio-availability in pregnant rats following exposure to clay minerals in the diet // J. Toxicol. Environ. Health A. 2004. Vol. 67, N 11. P. 863-874. DOI: 10.1080/15287390490425777.
37. Sharma A.K., Mortensen A., Schmidt B., Frandsen H., Hadrup N., Larsen E.H. et al. In vivo study ofgenotoxic and inflammatory effects of the organo-modified montmorillonite Cloisite 30B // Mutat. Res. 2014. Vol. 770. P. 66-71. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2014.04.023.
38. Williams L.B., Metge D.W., Eberl D.D., Harvey R.W., Turner A.G., Prapaipong P. et al. What makes a natural clay antibacterial? // Environ. Sci. Technol. 2011. Vol. 45, N 8. P. 3768-3773. DOI: 10.1021/ es1040688.
39. Williams L.B., Haydel S.E. Evaluation of the medicinal use of clay minerals as antibacterial agents // Int. Geol. Rev. 2010. Vol. 52, N 7-8. P. 745-770. DOI: 10.1080/00206811003679737.
References
Tayeb A.H., Tajvidi M. Sustainable barrier system via self-assembly 8. of colloidal montmorillonite and cross-linking resins on nanocel-lulose interfaces. ACS Appl Mater Interfaces. 2019; 11 (1): 1604-15. DOI: 10.1021/acsami.8b16659.
Razgovorova M.P., Selyavin A.V., Razgovorov P.B. The use of clays of various compositions for the separation of impurities of vegetable 9. oils. Uspekhi v khimii i khimicheskoy tekhnologii [Advances in Chemistry and Chemical Technology]. 2011; (25): 119-21. (in Russian) Abdel-Wahhab M.A., El-Nekeety A.A., Hathout A.S., Sabery B.A., Ibrahim M.I., Gado R.A., et al. Preparation and characterization 10. of organo-modified nano montmorillonite and evaluation of its ability to adsorb aflatoxins, fumonisins and zearalenone from aqueous solution. Nano Sci Tech Open Lib. 2015; 1 (1): 27-34. Abrahams P.W., Davies T.C., Solomon A.O., Trow A.J., Wragg 11. J. Human geophagia, calabash chalk and undongo: mineral element nutritional implications. PLoS One. 2013; 8 (1): e53304. 12. DOI: 10.1371/journal.pone.005330.
Afriyie-Gyawu E., Wang Z., Ankrah N.A., Xu L., Johnson N.M., Tang L., et al. NovaSil clay does not affect the concentrations 13. of vitamins A and E and nutrient minerals in serum samples from Ghanaians at high risk for aflatoxicosis. Food Addit Contam Part A. 2008; 25: 872-84. DOI: 10.1080/02652030701854758. Rodrigues L.A., Figueiras A., Veiga F., de Freitas R.M.., Nunes L.C., 14. da Silva Filho E.C., et al. The systems containing clays and clay minerals from modified drug release: a review. Colloids Surf B Biointerfaces. 2013; 103: 642-51. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2012.10.068. Akbari Alavijeh M., Sarvi M.N., Ramazani Afarani Z. Properties 15. of adsorption of vitamin B12 on nanoclay as a versatile carrier. Food Chem. 2017; 219: 207-14. DOI: 10.1016/j.foodchem.2016.09. 140.
Jorda- Beneyto M., Ortuno N., Devis A., Aucejo S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., et al. Use of nanoclay platelets in food packaging materials: technical and cytotoxity approach. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2014; 31 (3): 354-64. DOI: 10.1080/19440049.2013.874045. Vergaro V., Abdullayev E., Lvov Y.M., Zeitoun A., Cingolani R., Rinaldi R., et al. Cytocompatibility and uptake of halloysite clay nanotubes. Biomacromolecules. 2010; 11 (3): 820-6. DOI: 10.1021/ bm9014446.
Maisanaba S., Pichardo S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., Cam-ean A.M., Jos A. Toxicological evaluation of clay minerals and derived nanocomposites: a review. Environ Res. 2015; 138: 233-54. DOI: 10.1016/j.envres.2014.12.024.
Moosavi M. Bentonite clay as a natural remedy: a brief review. Iran J Public Health. 2017; 46 (9): 1176-83. PMCID: PMC5632318. Kibanova D., Nieto-Camacho A., Cervini-Silva J. Lipid peroxida-tion induced by expandable clay minerals. Environ Sci Technol. 2009; 43 (19): 7550-5. DOI: 10.1021/es9007917. EFSA. European Food Safety Authority. Scientific opinion on the safety and efficacy of a preparation of bentonite- and sepiolite (Toxfin Dry) as feed additive for all species. EFSA J. 2013; 11 (4): 1-21. DOI: 10.2903/j.efsa.2013.3179.
Smirnova V.V., Tananova O.N., Shumakova A.A., Trushina E.N., Avrenyeva L.I., Bykova I.B., et al. Toxicological and hygienic characteristics of nanostructured bentonite clay. Gigiyena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2012; (3): 76-8. (in Russian) Loskutova L.V., Dubrovina N.I., Markel' A.L. Comparative analysis of the persistence of a conditioned passive avoidance reflex in rats with different forms of inherited hypertension. Neurosci Behav Physiol. 2007; 37 (6): 577-82.
1.
2.
3
4
6.
7
16. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow's milk proteins in breast milk. Clin Allergy. 1984; 14 (6): 533-5.
17. Raspopov R.V., Trushina E.N., Gmoshinskiy I.V., Khotimchenko S.A. Bioavailability of iron oxide nanoparticles when used in food. The results of experiments on rats. Voprosy pitaniya [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (3): 25-30. (in Russian)
18. Razygraev A.V. Method for the determination of glutathione peroxidase activity using hydrogen peroxide and 5.5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid). Kliniko-laboratornyy konsilium [Clinical Laboratory Consultation]. 2004; (4): 19-22. (in Russian)
19. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959; 82 (1): 70-7. DOI: 10.1016/0003-9861(59)90090-6.
20. Golubkina N.A. Fluorimetric method for determining selenium. Zhurnal analiticheskoy khimii [Journal of Analytical Chemistry]. 1995; 50 (8): 492-7. (in Russian)
21. Botros M., Sikaris K.A. The de Ritis ratio: the test of time. Clin Biochem Rev. 2013; 34 (3): 117-30.
22. Roslyy I.M. Biochemical indicators in medicine and biology. Moscow: MIA, 2015: 616 p. (in Russian)
23. Murphy E.J., Roberts E., Horrocks L.A. Aluminum silicate toxicity in cell cultures. Neuroscience. 1993; 55 (2): 597-605.
24. Li P.R., Wei J.C., Chiu Y.F., Su H.L. Peng F.C., Lin J.J. Evaluation on cytotoxicity and genotoxicity of the exfoliated silicate nanoclay. ACS Appl Mater Interfaces. 2010; 2: 1608-13. DOI: 10.1021/ am1001162ro
25. Baek M., Lee J.-A., Choi S.-J. Toxicological effects of a cationic clay, montmorillonite in vitro and in vivo. Mol Cell Toxicol. 2012; 8 (1): 95-101. DOI: 10.1007/s13273-012-0012-xro
26. Verma N.K., Moore E., Blau W., Volkov Y., Babu P.R. Cytotox-icity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. J Nanopart Res. 2012; 14 (9): 1137-48. DOI: 10.1007/s11051-012-1137-5.
27. Zhang M., Li X., Lu Y., Fang X., Chen Q., Xing M., He J. Studying the genotoxic effects induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro. Mutat Res. 2011; 720: 62-6. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2010.12.009.
28. Zhang M., Lu Y., Li X., Chen Q., Lu L., Xing M., et al. Studying the cytotoxicity and oxidative stress induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro. Chem Biol Interact. 2010; 183 (3): 390-6. DOI: 10.1016/j.cbi.2009. 11.023.
29. Rawat K., Agarwal S., Tyagi A., Verma A.K., Bohidar H.B. Aspect ratio dependent cytotoxicity and antimicrobial properties of nano-clay. Appl Biochem Biotechnol. 2014; 174 (3): 936-44. DOI: 10.1007/ s12010-014-0983-2.
30. Sharma A.K., Schmidt B., Frandsen H., Jacobsen N.R., Larsen E.H., Binderup M.L. Genotoxicity of unmodified and organo-modified montmorillonite. Mutat Res. 2010; 700 (1-2): 18-25. DOI: 10.1016/ j.mrgentox.2010.04.021.
31. Lee Y.H., Kuo T.F., Chen B.Y., Feng Y.K., Wen Y.R., Lin W.C., et al. Toxicity assessment of montmorillonite as a drug carrier for pharmaceutical applications: yeast and rats model. Biomed Eng Appl Basis Commun. 2005; 17: 72-8. DOI: 10.4015/S1016237205000111.
32. Mascolo N., Summa V., Tateo F. In vivo experimental data on the mobility of hazardous chemical elements from clays. Appl Clay Sci. 2004; 25 (1-2): 23-8. DOI: 10.1016/j.clay.2003.07.001.
33. Afriyie-Gyawu E., Mackie J., Dash B., Wiles M., Taylor J., Hueb-ner H., et al. Chronic toxicological evaluation of dietary NovaSil clay in Sprague-Dawley rats. Food Addit Contam. 2005; 22 (3): 259-69. DOI: 10.1080/02652030500110758.
34. Maisanaba S., Gutiérrez-Praena D., Puerto M., Moyano R., Blanco A., Jorda M., et al. Effects of the subchronic exposure to organomodified clay for food packaging applications on Wistar rats. Appl Clay Sci. 2014; 95: 37-40. DOI: 10.1016/j.clay.2014.04.006.
35. Maisanaba S., Puerto M., Gutiérrez-Praena D., Llana-Ruiz-Cabello M., Pichardo S., Mate A., et al. In vivo evaluation of activities and expression of antioxidant enzymes in Wistar rats exposed for 90 days to a modified clay. J Toxicol Environ Health A. 2014; 77 (8): 456-66. DOI: 10.1080/15287394.2013.876696.
36. Wiles M.W., Huebner H.J., Afriyie-Gyawu E., Taylor R.J., Bratton G.R., Phillips T.D. Toxicological evaluation and metal bio-availability in pregnant rats following exposure to clay minerals in the diet. J Toxicol Environ Health A. 2004; 67 (11): 863-74. DOI: 10.1080/15287390490425777.
37. Sharma A.K., Mortensen A., Schmidt B., Frandsen H., Hadrup N., Larsen E.H., et al. In vivo study of genotoxic and inflammatory effects ofthe organo-modified montmorillonite Cloisite 30B. Mutat. Res. 2014; 770: 66-71. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2014.04.023.
38. Williams L.B., Metge D.W., Eberl D.D., Harvey R.W., Turner A.G., Prapaipong P., et al. What makes a natural clay antibacterial? Environ Sci Technol. 2011; 45 (8): 3768-73. DOI: 10.1021/es1040688.
39. Williams L.B., Haydel S.E. Evaluation of the medicinal use of clay minerals as antibacterial agents. Int Geol Rev. 2010; 52 (7-8): 745-70. DOI: 10.1080/00206811003679737.
