CC BY
93
[гиена и санитария 3/2012
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 613.298-092.9
B. В. Смирнова, О. Н. Тананова, А. А. Шумакова, Э. Н. Трушина, Л. И. Авреньева, И. Б. Быкова, Л. П. Минаева,
C. Х. Сото, Н. В. Лашнева, И. В. Гмошинский, С. А. Хотимченко
ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАНОСТРУКТУРИРОВАННОЙ БЕНТОНИТОВОЙ ГЛИНЫ
Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт питания РАМН, Москва
Внутрижелудочное введение крысам в течение 28 дней наноглины приводит к снижению относительной массы печени, активности конъюгирующих ферментов печени и антагонистической активности бифидофлоры, гиперпродукции дрожжевой микрофлоры толстой кишки. Полученные данные позволяют заключить, что наноглины, присутствие которых возможно в пищевых продуктах, должны стать объектом гигиенического нормирования.
Ключевые слова: глина, наночастицы, крысы, токсичность
V. V. Smirnova, O. N. Tananova, A. A. Shumakova, E. N. Trushina, L. I. Avrenyeva, I. B. Bykova, L. P. Minaeva, S. Kh. Soto,
N. VLashneva, I. V Gmoshinsky, S. A. Khotimchenko - TOXICOLOGICAL AND SANITARY CHARACTERIZATION OF BENTONITE NANOCLAY
Research Institute of Nutrition, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Intragastric administration of nanoclay to rats during 28 days led to reductions in the relative weight of the liver, the activity of its conjugating enzymes, the antagonistic activity of bifidoflora, and the hyperproduction of colonic yeast microflora. The findings lead to the conclusion that nanoclays that may be present in foods must be the object of sanitary regulation.
Key words: clay, nanoparticles, rats, toxicity
Бентонитовая глина - природный минерал из группы монтмориллонитов приблизительного состава (Ca,
Mg)O • A12O3 • 3SiO2 • 1,5H2O в наноструктурированной форме (далее — наноглина) представлена частицами диаметром около 1000—2000 нм и толщиной не более 2—3 нм. Такая структура наноглины позволяет использовать ее в качестве наполнителя полимерных композитов, обладающих рядом полезных свойств.
В частности, применение наноглины в составе упаковочных материалов пищевого назначения придает им газобарьерные свойства, т. е. резко замедляет процессы диффузии газов как из атмосферы в упакованный продукт, так и в обратном направлении [1, 5, 6]. Введение в полимерные композиты частиц наноглины возможно, как правило, после гидрофобизации их поверхности поверхностно-активными веществами. Наряду с газобарьерными, частицы наноглины обладают выраженными адсорбционными и ионообменными свойствами.
Миграция частиц наноглины из упаковочного материала в пищевой продукт создает потенциальный источник экспонирования организма человека этим наноматериалом. Сведения о возможных биологических эффектах наноглин, полученные в модельных системах in vitro, противоречивы [7—9]. В задачи нашей работы входило изучение некоторых токсикологических характеристик наноглины при внутрижелудочном введении крысам в подостром эксперименте в течение 4 нед.
Смирнова В. В. — аспирант (nvasi1ika@yandex.ru); Тананова О. Н. — мл. науч. сотр. (otananova@yandex.ru); ШумаковаА. А. — мл. науч. сотр. (antonina_sh@1ist.ru); Трушина Э. Н. — ст. науч. сотр., канд. мед. наук (trushina@ion.ru); Быкова И. Б. — науч. сотр. (bikova@ion.ru); Минаева Л. П. — ст. науч. сотр., канд. тех. наук (1iuminaeva-ion@mai1.ru); Авреньева Л. И. — ст. науч. сотр., канд. мед. наук (avrenyeva@ion.ru); Сото С. Х. — ст. науч. сотр., канд. мед. наук (isotoc@mai1.ru); Хотимченко С. А. — нач. лаб., д-р мед. наук, проф. (hotimchenko@ion.ru); Гмошинский И. В. — вед. науч. сотр., д-р биохим. наук (gmosh@ion.ru); Лашнева Н. В. — ст. науч. сотр. (1ashneva@ion.ru)
Материалы и методы
В работе использован препарат наноглины «Nanoc1ay Nanomer PGV hydrohpy1ic bentonite nanoc1ay», производства фирмы «Sigma-A1drich» (Германия).
Дизайн эксперимента соответствовал МУ 1.2.2520—09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» [3]. Исследование проведено на 45 крысах-самцах линии Вистар исходной массой 111 ± 2 г (M ± m), полученных из питомника РАМН «Столбовая». Крыс содержали группами по 3—4 животных в пластмассовых клетках и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом на основе казеина [3]. Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали.
Животные были разделены на 3 группы по 15 крыс в каждой. 1-я группа (контроль) получала на протяжении всего эксперимента ежедневно внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные 2-й группы получали дисперсию наноглины в дистиллированной воде, обработанную ультразвуком (5 мин, 44 кГц, 40 Вт) в дозе 1 мг на 1 кг массы тела, а крысы 3-й группы — в дозе 100 мг на 1 кг массы тела. Общая продолжительность введения препаратов составила 28 дней. При проведении эксперимента были использованы методы отбора биологических образцов, исследования интегральных, биохимических, физиологических, гематологических и микробиологических показателей, применявшиеся ранее [2, 4]. Статистическую обработку данных выполняли согласно непараметрическому критерию Манна—Уитни с использованием программы SPSS 17.0. Различия признавали достоверными приp < 0,05.
Результаты и обсуждение
Как показало еженедельное взвешивание животных, крысы всех групп прибавляли в массе тела с одинаковой скоростью на протяжении всего эксперимента. Приросты массы тела животных 1—3-й групп составили за 28 дней в среднем 150,9 ± 4,6, 157,3 ± 3,1 и 159,5
76
Относительная масса органов крыс 1-3-й групп
Таблица 1
Группа Число животных Масса органов, % от массы тела (M ± т)
сердце легкое надпочечники тимус печень почки селезенка семенники
1-я 9 0,39 ± 0,01 0,63 ± 0,02 0,032 ± 0,001 0,21 ± 0,01 3,53 ± 0,05 0,71 ± 0,02 0,70 ± 0,05 1,06 ± 0,05
2-я 9 0,42 ± 0,01 0,67 ± 0,02 0,032 ± 0,001 0,26 ± 0,02 3,14 ± 0,06 0,72 ± 0,02 0,68 ± 0,08 1,19 ± 0,03
3-я 9 0,43 ± 0,02 0,71 ± 0,04 0,029 ± 0,002 0,23 ± 0,02 3,16 ± 0,10 0,71 ± 0,02 0,72 ± 0,06 1,22 ± 0,03
р* Группы 1 и 2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05
Группы 1 и 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05
Группы 2 и 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Примечание. * - здесь и в табл. 2, 3: достоверность различия при попарном сравнении групп, непараметрический критерий Манна-Уитни.
± 8,1% (M ± т) от исходного значения и достоверно не различались. Животные хорошо переносили введение препарата наноглины; летальности не было выявлено.
Как следует из данных табл. 1, у крыс обеих групп, получавших наноглину, отмечалось достоверное снижение относительной массы печени и повышение массы гонад в сравнении с контролем. Во 2-й группе было также выявлено повышение относительной массы тимуса. Для остальных органов влияние введения наноглины на относительную массу не выявлено.
Анализ показателей, характеризующих систему ферментов I стадии микросомальной детоксикации ксенобиотиков (общее содержание цитохромов Р-450, Ь5, активность монооксигеназ изоформ CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1), не выявил различий между животными трех групп (данные не представлены). Однако активности конъюгирующих ферментов II стадии детоксикации ксенобиотиков не намного по абсолютной величине, но достоверно снижались с увеличением дозы наноглины. Так, активность глутатионтрансферазы составила в 3-й группе 0,62 ± 0,02 мкмоль/мин на 1 мг белка против 0,71 ± 0,02 мкмоль/мин на 1 мг белка в контроле (снижение на 16%; p < 0,05), а активность УДФ-глюкуронозилтрансферазы 17,7 ± 0,8 мкмоль/мин на 1 мг белка против 23,3 ± 2,2 мкмоль/мин на 1 мг белка в контроле (снижение на 26%; p < 0,05). Этот результат показывает, что даже при относительно непродолжительном (4 нед) экспонировании животных наноглиной в высокой дозе процессы конъюгации ксенобиотиков в их печени могут до известной степени тормозиться. При низкой дозе наноглины (2-я группа) никаких различий с контролем в активностях вышеперечисленных ферментов выявлено не было.
Оценка доли неседиментируемой активности лизо-сомальных ферментов печени (арилсульфатазы А и В, Р-глюкуронидаза, Р-галактозидаза) не выявила различий между животными трех групп, что указывает об отсутствии влияния на стабильность лизосомальных мембран.
Показатели перекисного окисления липидов у крыс 1-3-й групп
Однако определение общей активности этих ферментов выявило нарастание уровня суммарных арилсульфатаз в 3-й группе (4,63 ± 0,31 мкмоль/мин на 1 мг белка) в сравнении с контролем (3,91 ± 0,08 мкмоль/мин на 1 мг белка; p < 0,01). Следует отметить, что и это изменение было незначительным по абсолютной величине (16%).
Как следует из данных табл. 2, введение наноглины животным не только не приводило у них к возрастанию показателей интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), но и вызывало во 2-й группе снижение уровня диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в плазме крови (последнее на уровне тенденции). Этому соответствовало достоверное возрастание у этих животных активности глутатионпероксидазы эритроцитов, но не других ферментов антиоксидантной защиты. Наблюдавшийся эффект не был дозозависимым и не наблюдался при высокой дозе наноглины у животных 3-й группы. Таким образом, можно предполагать, что введение в ЖКТ животных наноглины, во всяком случае, не сопровождается усилением ПОЛ. Размер пула небелковых тиолов, характеризующих состояние окислительно-восстановительного гомеостаза печени, составил у животных 1-3-й групп соответственно 28,5 ± 3,7, 26,9 ± 2,7 и 28,1 ± 1,1 мкмоль и не различался достоверно у животных трех групп.
Как следует из данных табл. 3, введение наноглины животным приводит к определенным сдвигам в биохимических показателях крови. Отмечается дозозависимое снижение во 2-й и 3-й группах активности алани-наминотрансферазы, концентрации мочевины. Во 2-й группе выявлено также небольшое снижение концентрации глюкозы крови и активности щелочной фосфатазы. Все указанные изменения невелики по абсолютной величине, находятся в пределах вариабельности нормальных значений и не могут быть интерпретированы как неблагоприятные. Полученные результаты позволяют, в частности, предполагать, что введение
Таблица 2
Группа Число крыс Показатели
содержание диеновых конъюгатов ПНЖК в плазме, нмоль/мл содержание малонового диальдегида в плазме, нмоль/мл активность глутати-онпероксидазы эритроцитов, мкмоль/ мл в 1 мин активность глутатионредуктазы эритроцитов, мкмоль/мл в 1 мин активность супе-роксиддисмутазы эритроцитов, усл. ед/мл активность каталазы эритроцитов, ед/мл
1-я 6 3,43 ± 0,09 6,25 ± 0,08 17,8 ± 1,8 1,31 ± 0,12 1507± 46 345 ± 9
2-я 6 3,07 ± 0,08 5,85 ± 0,19 26,8 ± 2,8 1,79 ± 0,34 1507±25 286 ± 41
3-я 6 3,54 ± 0,29 6,21 ± 0,21 20,9 ± 2,1 1,22 ± 0,14 1423 ± 26 299 ± 17
р* Группы 1 и 2 < 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Группы 1 и 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Группы 2 и 3 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
77
[гиена и санитария 3/2012
Таблица 3
Биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных
Груп- па Число крыс Средние биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных
АЛТ, ед/л АСТ, ед/л альбумин, г/л белок общий, г/л глюкоза, ммоль/л креатинин, мкмоль/л мочевая кислота, мкмоль/л мочевина, мкмоль/л щелочная фосфатаза, ед/л
1-я 15 58,3 ± 2,7 166,2 ± 7,0 30,9 ± 0,3 61,1 ± 0,7 7,17 ± 0,22 30,1 ± 0,8 112,1 ± 6,6 7,9 ± 0,2 267 ± 10
2-я 15 50,6 ± 2,2 158,0 ± 5,7 31,0 ± 0,3 62,8 ± 0,8 5,89 ± 0,28 28,8 ± 0,4 144,4 ± 6,5 5,4 ± 0,2 221 ± 7
3-я 15 49,0 ± 2,8 154,7 ± 6,2 30,0 ± 0,4 62,6 ± 0,8 6,71 ± 0,54 29,4 ± 0,6 125,3 ± 8,0 5,9 ± 0,5 240 ± 17
p* Г руппы 1 и 2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05
Г руппы 1 и 3 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05
Г руппы 2 и 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
наноглины животным не оказывает токсического действия на печень и не сказывается неблагоприятным образом на состоянии азотистого и углеводного обмена.
Анализ гематологических показателей животных выявил возрастание в группах, получавших наноглину, концентрации гемоглобина и величины гематокрита, а также снижение содержания гемоглобина в эритроците. Выявленные эффекты были небольшими по абсолютной величине, находились в пределах вариабельности нормальных значений и проявлялись практически в равной степени во 2-й и 3-й группах, т. е. не были дозозависимыми (данные не представлены). У животных 2-й группы отмечено увеличение на 10% содержания тромбоцитов (р < 0,05). Каких-либо изменений в лейкоцитарной формуле крови у животных опытных групп не установлено.
Исследование апоптоза гепатоцитов путем цитофлю-ориметрического учета клеток, окрашенных двумя видами флюоресцентных красителей, - аннексином V(AnV), маркирующим фосфатидилсерин клеточной мембраны на «ранних» стадиях апоптоза, и 7-AAD, окрашивающим двухцепочечную ДНК на поздних стадиях апоптоза и в мертвых клетках, выявило высокую долю (> 95%) живых [AnV(-)7-AAD(-)] клеток у животных всех групп. Содержание клеток на ранних стадиях апоптоза [AnV(+)7-AAD(-)] не превышало 4,7% и не различалось достоверно между крысами опытных и контрольной групп. Клетки на поздних стадиях апоптоза [AnV(+)7-AAD(+)] и мертвые клетки [AnV(-)7-AAD(+)] у животных всех трех групп практически отсутствовали. Этим подтверждается выявленное на основе данных биохимических тестов отсутствие токсического действия наноглины на ткань печени.
Определение иммуноферментным методом величины всасывания антигенного овальбумина куриного яйца (ОВА) в кровь после внутрижелудочного зондового введения показало, что у животных всех трех групп средняя величина этого показателя находится в пределах значений, характерных для крыс данного возраста, и достоверно не различается между группами. Таким образом, частицы наноглины, поступающие в тонкую кишку, по-видимому, не оказывают существенного влияния на ее барьерную функцию в отношении всасывания макромолекул.
Содержание основных (бифидобактерии, лактобациллы, энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, стрептококки) и транзиторных (гемолитические стрептококки, клостридии, дрожжи, цитратассимилирующие энтеробактерии, плесени, St. aureus) популяций кишечного микробиоценоза, а также общее количество аэробных и анаэробных микроорганизмов в содержимом слепой кишки животных всех трех групп находилось в пределах физиологической нормы для данного вида животных и не различалось достоверно между отдельными группами. Единственное исключение составил показатель содержа-
ния дрожжей, который достоверно (р < 0,05) и дозозависимо возрастал во 2-й и 3-й группах (4,44 ± 0,72 и 5,44 ± 0,52 lg КОЕ/г соответственно) по сравнению с контролем (2,30 ± 0,01 lg КОЕ/г). Еще одним изменением, которое могло быть соотнесено с потреблением наноглины, явилось ослабление антагонистической кислотообразующей активности нормальной бифидофлоры, которое составило (в единицах рН) 4,72 ± 0,05 во 2-й группе и 4,95 ± 0,06 в 3-й группе против 4,48 ± 0,11 в контроле (р < 0,05 в обоих случаях). Таким образом, поступление наноглины в кишечник крыс может оказывать определенное воздействие на состояние кишечного микробиоценоза.
Оценивая в целом результаты эксперимента, следует отметить, что внутрижелудочное введение крысам на протяжении 4 нед наноглины, особенно в высокой дозе, приводит к определенным изменениям, некоторые из которых (снижение активности конъюгирующих ферментов печени и антагонистической активности бифидоф-лоры, гиперпродукция популяции дрожжей в толстой кишке) могут быть интерпретированы как неблагоприятные. Каких-либо других данных о токсическом действии наноглины на организм животных выявлено не было, что может быть связано с недостаточно большим периодом введения препаратов. Тем не менее полученные данные позволяют заключить, что наноглины, присутствие которых возможно в пищевых продуктах, должны стать объектом гигиенического нормирования на основании данных длительных экспериментов.
Настоящая работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки России в рамках Федеральной целевой программы “Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы ”.
Литер атура
1. Невзорова В. В., Гмошинский И. В., Хотимченко С. А. // Вопр. пит. — 2009. - Т. 78, № 4. — С. 54-60.
2. Распопов Р. В., Верников В. М., Шумакова А. А. и др. // Вопр. пит. — 2010. — Т. 79, № 4. — С. 21—30.
3. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: Метод. указания МУ 1.2.2520-09. — М., 2009.
4. Шевелева С. А., Кузнецова Г. Г., Батищева С. Ю. и др. // Вопр. пит. — 2010. — Т. 79, № 5. — С. 29—34.
5. Avella M., De Vlieger J. J., Errico M. E. et al. // Food Chem. -2005. — Vol. 93, N 3. — P. 467—474.
6. Chaudhry Q., Scotter M., Blackburn J. et al. // Food Addit. Contamin. — 2008. — Vol. 25, N.3. — P. 241-258.
7. Choi S. J., Oh J. M., Choy J. H. Toxicological effects of inorganic nanoparticles on human lung cancer A549 cells// J. Inorg. Biochem. — 2009. — Vol. 103, N 3. — P. 463—471.
8. Petushkov A., Intra J., Graham J. B. et al. // Chem. Res. Toxicol. -2009. — Vol. 22, N 7. — P 1359—1368.
9. Styan K. E., Martin D. J., Poole-Warren L. A. // J. Biomed. Mate. Res. A. — 2008. — Vol. 8, N 3. — P. 571—582.
Поступила 17.06.11
78
