CC BY
14
Нов1тн1 досягнення
БОЛ к с;у( тлвы. ПОЭВОВОЧ1 шк
The Role of Bone Biopsy in Bone Diseases —
Analytical Methods — A Clinical Evaluation of 152 Consecutive
Cases over a Period of 12 Years
Роль oioncii в д1агностиц| захворювань меток: анал1тичн1 методи (кл1н1чн8 досл1дж8ння 152 послщовних випадкlв протягом 12 ромв)
RESCH H., TRUBRICH A., BITTIGHOFER CH., KOCIJAN R., PIRKER TH., PATSCH J., MUSCHITZ CH.
Medical University, Vienna, Department II Rheumatology/Osteology & Gastroenterology KH Barmherzige Schwestern (St. Vincent Hospital), Academic Teaching Hospital of the Medical University Vienna, Austria
H. RESH
Introduction and background
Osteoporosis has been characterised and defined as a systemic metabolic bone disease causing a deterioration of skeletal tissue and mechanical competences [1—3]. The advanced understanding of osteoporosis, however, has changed markedly during the last years. The impact of the classic histopathology has been replaced by a structural, mechanical, genetic and material related understanding. From the clinical standpoint, non-invasive diagnostic procedures have become established and seem to make it very easy to get a correct clinical diagnosis [4—7].
Bone biopsy has been restricted so far to untypical, unclear and complicated cases in evidence-based guidelines on diagnosis and treatment of osteoporosis [8, 9]. However, with respect to the tremendous progress in structural and genetical analysis of bone tissue and on the other hand with respect to the progress in the development of new pharmacotherapy, the indication for the assessment of bone tissue has switched to younger patients, even children, males and patients with a substantial discrepancy in the clinical exploration. There is a permanent controversial discussion about performing bone biopsies, the way of preparing and conserving the sample and their correct interpretation to differentiate between low-turnover and high-turnover osteoporosis and different architectural patterns in the cortical and trabecular area with impact on therapeutic decisions [10—14]. In this context, our report gives a description of the science network, the clinical procedure and the impact of the role and re-
Вступ
Остеопороз характеризувався та визначався як систем-не захворювання юстково! тканини, що викликае пошко-дження скелета та порушення його мехашчних властивос-тей [1—3]. Проте за останш роки визначення остеопорозу суттево змшилося. На противагу класичнш пстопатофь зюлогп прийшли структурний, мехашчний, генетичний i тканинний аналiз. 1з клШчно! точки зору, неагресивш дiа-гностичш процедури широко використовуваш та з першо-го погляду дозволяють дуже легко поставити правильний клШчний дiагноз [4—7].
Рашше призначення бшпсп юстки було обмеже-ним, вона виконувалася лише в нетипових, неч^ких та складних кл^чних випадках, зпдно з рекомен-дащями щодо дiагнозу та лжування остеопорозу [8, 9]. Проте у зв'язку iз прогресом у вивченш юстково! тканини на структурному та генетичному рiвнях, а з шшого боку, iз прогресом медикаментозного лжуван-ня i розвитком нового напрямку лжування, показан-ня до призначення юстково! бюпсп розширилися, i сьогодш вона дозволена для молодих людей, i нав^ь для д^ей, чоловтв i пацiентiв, як мають значнi вщ-хилення при клМчних дослiдженнях. На сьогоднi залишаються дискусiйними питання щодо методики виконання юстково! бiопсi'i, шляху подготовки та збереження зразкiв i !х правильно! iнтерпретацi'i, стосовно дiагнозу остеопорозу з високою та низькою швидюстю ремоделювання, а також щодо впливу те-рапii' на архiтектонiку кортикально! та трабекулярно! кiстковоi' тканини [10—14]. У цьому контекст в данш статтi подано методику проведення процедури бюпсп, !! наукове обГрунтування та роль й доцшьносп бiопсii' юстки в медичному центрi, який займаеться вивчен-
levance of bone biopsy in a medical center, which is responsible for different clinical tasks; basic and clinical research, students training and clinical routine in the management of skeletal diseases (Fig. 1). Subject of the manuscript is a descriptive analysis on frequency and indications for bone biopsy, quality of the specimens, histopathologi-cal diagnosis, and the possibilities of analysis on the different bone levels depicting consequences for therapeutic strategy for the patients.
Patients
In the time period between April 1995 and December 2010, a total of 152 transiliac bone biopsies were performed at the II. Medical Department of Rheumatology/Osteology of the St. Vincent Hospital Vienna in cooperation with the Medical University of Vienna. The indications for a bone biopsy were as following:
Differential diagnosis of bone diseases
— In particular Juvenile (premenopausal) Osteoporosis (DD Osteogenesis imperfecta).
— Male osteoporosis and fractures after inadequate traumas.
— Clinical discrepancies — fractures at normal or osteopenic BMD measurements.
— Hyperostosis.
— Fragility fractures in young patients.
— Non responders to antiresorptive therapy.
— Scientific investigations & studies.
The aims of the procedure in general are:
— Analysis of microarchitecture and material properties (mineralization).
— Analysis of mRNA extraction on tissue level.
— Gender-specific differences in structure and metabolic dynamics.
— Initiation of specific therapies.
A brief characterisation of the patients is given in Table 1. In the observation period, about 80—100 consultations of patients occurred weekly (Monday — Friday) for bone diseases in the outpatient and inpatient wards. The majority of bone biopsies (90 %) was performed by one single investigator (PHK). Transiliac bone biopsy was performed as described in one of our publications [15] with respect to the technique of Bordier et al. [16].
The spectrum of diagnoses is represented in Table 2.
ням захворювань скелета, як на рутинному рiвнi, так i на рiвнi клМчних дослщжень (рис. 1). Метою ще! ро-боти став описовий аналiз частоти та причин юстково! бюпсп, якост зразюв, пстопатолопчних дiагнозiв та можливостей використання аналiзу юстково! бюпсп для обГрунтування терапевтично! стратеги.
Пацкнти
Було проведено 152 черезклубовi бюпсп юстки про-тягом перюду з кв^ня 1995 по грудень 2010 р. Бюп^я юстки виконувалася в другому медичному вщдМ ревматологи/остеологи Лжарш Святого Вшсента (Вщень) у сшвпращ з ушверситетською клшжою Медичного уш-верситету Вщня. Показаннями для бюпсп юстки були такк
I. З метою диференцшного дiагнозу захворювань юстки:
— зокрема, раннш (пременопаузальний) остеопороз (з метою диференцшного дiагнозу недосконалого остео-генезу);
— остеопороз у чоловтв i наявшсть низькоенергетичних переломiв;
— клшчш розб1жност — поява переломiв при нормаль-нш мшеральнш щшьност юстково! тканини або при остео-пени;
— гшеростоз;
— низькоенергетичш переломи в молодих пащенлв;
— пащенти, яю не мали вщповщ на антирезорбтивну те-рапш;
— науково-дослщницька робота.
II. Метою процедури загалом е:
— аналiз мжроархтгектошки та матерiальних властивос-тей (мiнералiзацiя кiстковоi тканини);
— аналiз мРНК на тканинному рiвнi;
— гендерш специфiчнi вiдмiнностi у структурi та динашщ метаболiзму кiстково'i тканини;
— призначення специфiчно'i терапи.
Коротка характеристика обстежених пащенлв подана в табл. 1. За перюд спостереження щотижнево (iз поне-дiлка по п'ятницю) здiйснювалося близько 80—100 поль клШчних та стацiонарних консультацiй для пащенпв iз захворюваннями кiсток. Бiльшiсть бюпсш (90 %) кiстки виконував один единий дослщник (РНК). Черезклубова бюпия кiстки виконувалася згiдно з рашше опублжова-ною методикою, що була описана в однш iз попередшх публiкацiй авторiв статтi [15] та е модифжащею методики
Бордieра та сшвавт. [16].
Спектр дiагнозiв наведено в табл. 2. Table 1. Average ages in male and female patients Таблиця 1. Середнйв'кобстеженихпацЫнт'в
Ктькють (%) Середнш bík Стандартне вщхилення STD (роки) М1н1мальний bík Максимальний bík
Чолов^и 84 (54,9) 46,3 12,8 18 79
Жшки 69 (45,1) 49,0 15,29 10 84
Всього 153 47,8 13,9 10 84
Table 2. Histological diagnosis Таблиця 2. Пстолог'мнi д'югнози
Пстолопчы дiагнози Чоловти Жшки Усього
Остеопороз i3 низькою швидкютю ремоделювання, n 2 4 6
Остеопороз i3 високою швидкютю ремоделювання, n 5 10 15
Остеопенiя з низькою швидкютю ремоделювання, n (%) 18 (21,4) 16 (23,2) 34 (22,2)
Остеопеыя iз високою швидкiстю ремоделювання, n (%) 19 (22,6) 16 (23,2) 35 (22,9)
Остеопоромаляцiя (остеопороз/остеоУдоз), n 7 4 11
Мастоцитоз, n 3 0 3
Недосконалий остеогенез, n 1 1 2
Плазмоцитома, n 0 1 1
lншi (лiмфома, гiперфосфатазiя), n 4 1 4
Норма (%) 13 (15,4) 8 (11,5) 22 (14,4)
Без висновку/не придатний до дослщження 12 8 20
Всього 84 69 153
Indications and Clinical Evaluation
Показання та клМчна оцiнка
Following the study approval by the local ethics committee, patients with bone diseases are recruited at the outpatient clinic of the II Medical Department, St. Vincent Hospital Vienna, Austria.
All patients have to give written informed consent prior to any study or routine-related procedures.
Medical history details including the previous use of osteotropic drugs, concomitant medication, life-style habits (e.g. smoking), fractures including trauma history and parental fractures are recorded in detail and implemented by the FRAX calculation tool. Inclusion criteria are adapted from major interventional trials in female and male osteoporosis [17, 18]. Exclusion criteria for the biopsy procedure include the previous use of any specific antiosteoporotic substances over a longer time period (more than 12 months) other than vitamin D and calcium supplements (e.g. bisphosphonates). Moreover, hypogonadism, thyroid disorders, the use of corticosteroids, thyroid hormones, antiepileptic substances or any malignoma history within the last five years exclude patients from enrolment of the procedure.
Clinical Examination, Densitometry and X-Ray-Imaging
Prior to each bone biopsy physical examination is performed, body weight and patient height are assessed using a stadiometer with integrated weighing scale (BWB 700, Tanita). Fasting blood samples are drawn from all patients between 8:00 and 10:00 a.m. Routine blood and urine analyses are performed at the Vienna-based Central Laboratory of the St. Vincent Group. Routine blood tests include a whole blood count, serum potassium, sodium, calcium
Згщно з затвердженими вимогами мюцевого комитету етики, пащенти з хворобами исток спостерц-аються у по-лгашчному вщдшенш другого медичного вщдшу Лжарш Святого Вшсента м. Вщня (Австргя).
Уам пащентам необидно тдписати шформовану згоду перед проведенням будь-яких загальноприйнятих чи спещ-альних процедур.
1сторгя хвороби мае детальну шформащю щодо попере-днього використання остеопоротичних медикаменлв, терапи супутшх захворювань, шкщливих звичок (наприклад, палш-ня), стилю життя, анамнезу переломiв iз детальним описом травми, переломiв у батьюв, ощнку FRAX. Критери вклю-чення адаптоваш до критерив включення головних клiнiчних дослщжень з остеопорозу в жшок та чоловтв, яю супрово-джувалися швазивними методиками [17, 18]. Критерiями виключення для проведення кiстковоi бiопсii е попередне використання будь-яких специфiчних антирезорбтивних медикамента (наприклад, бюфосфонатав) протягом тривалого перiоду (понад 12 мюящв), окрiм вiтамiну D та препаратав кальцiю. Також до критерив виключення вщносяться гшого-надизм, захворювання щитоподiбно'i залози, використання кортикостеро'iдiв, гормонiв щитоподiбно'i залози, антиет-лептичних медикаментiв, злояюсш новоутворення протягом останнгх п'яти роюв.
Клiнiчне обстеження, денситометрiя та рентгенографiя
Перед проведенням кожно! бiопсii кiстки виконували за-гальноприйняте клiнiчне обстеження. Вимiрювали масу тiла та зрют пацiента за допомогою ростомiру зi шкалою маси тiла (BWB 700, Тапйа). Здiйснювали забiр кровi в уах пацiентiв натще, мгж 8.00 та 10.00 годиною. Загальноприйнят досль дження кровi та сечi проводили у Вщенськш центральнiй лаборатори Святого Вшсента. Дослщження кровi включало загальний аналiз кровi, визначення рiвня калiю, натрiю, кальцiю i фосфору, а також паратгормона, 25-(ОН)-вгтамшу
and phosphate as well as PTH, 25-(OH)-vitamin D, TSH, kidney and liver function parameters and total testosterone measurements in male patients. Calcium and phosphate excretion is measured from a 24-hour-urine collection. Moreover patients undergo dual-X-ray-absorptiometry (DXA) scanning of the hip and spine (Lunar iDXA, GEHealthcare). In case of inconclusive DXA measurements due to degenerative alterations QCT of lumbar spine and hip is performed. To complete clinical work-up, vertebral fracture status is analyzed by anterior-posterior and lateral x-ray-studies of the thoracic and lumbar spine. The images are read by an experienced radiologist trained for Genant scoring [19].
Biochemical Bone Markers
Per patient 2 ml serum is stored in 1 ml voids at —70°C for batched bone marker double analysis at the Department of Laboratory Medicine of the Medical University of Vienna. Bone markers are measured using electrochemiluminescence-immu-noassays (ECLIA; beta-CrossLaps (CTX), N-MID Osteocalcin (OCN), total N-terminal type I procollagen propeptide (P1NP); all Roche Diagnostics) on a Modular Analytics E170 device (Roche Diagnostics).
Pre-interventional procedure — Labelling with tetracycline
On days —21/—20/—19 and days -8/-7/-6 before biopsy, 2000 mg tetracycline are administered orally to visualise mineralisation. (Tetracycline double labelling is performed routinely to retain the option for a later post hoc quantitative analysis of the bone specimen and dynamic histomorphometry) [16]. However, this procedure is not necessary to gete a histopathological diagnosis, which can also be achieved by static histomorphometry, without labelling. Mineralized bone histology after tetracycline double labelling is the only way to establish absence or presence of mineralization defect or evident osteomalacia with or without concomitant osteopenia (Tab. 3).
Technique of transiliac Bone Biopsy
Prior to the biopsy the patient is monitored (blood pressure, oxygen saturation) and receives oxygen continuously. Sedoanalgesia is performed by using midazolame and propofol (1%) intravenously and lidocaine (1%) subcoutaneously.
The transiliac biopsy is taken after incision of the skin from an area situated 5-8 cm below the ante-riorsuperior iliac spine and 8 cm below the summit of the iliac crest using a manual trocar with 6-mm
D, ТТГ, аналiз ниркових та печшкових проб, а також ви-значення piBra загального тестостерону в чоловтв. OKpiM цього, дослщжували piBem кальщю та фосфору в добовш ce4i. Також yciM пащентам проводили двофотонну рентге-швську денситометрго (DXA) на piвнi кульшових сyглобiв та хребта (Lunar iDXA, GEHealthcare). У pазi непоказових даних DXA через дегенеративш змши призначали кшьюсну комп'ютерну томографш (QCT) поперекового вщдшу хребта та кульшових сyглобiв. Наявшсть пеpеломiв визначали за допомогою прямо! та боково! рентгенографи грудного та поперекового вщдшу хребта. Ощнку рентгенограми проводив досвщчений радюлог, який проходив курси iз методики дш-гностики пеpеломiв за Дженантом [19].
Бiохiмiчнi маркери кктковоТ тканини
Маркери кюткового метаболiзмy проводили у вщдь лi лабораторно! медицини Медичного ушверситету Вщ-ня. Уим пащентами забирали по 2 мл сироватки кpовi та роздшяли !х на двi проби, одну iз яких заморожували при темпеpатypi —70 °С та використовували для контролю результата. Маркери визначали за допомогою хемшюмшес-центного методу iмyнофеpментним аналiзатоpом Modular Analytics El70 (Roche Diagnostics). Дослщжували piвень ß-СТх (зшивки спipалей колагену, CrossLaps), остеокаль-цину, P1NP (N-теpмiнальний пропептид проколагену I типу).
Маркування тетрациклiном — процедура, що проводиться перед кiстковою бюпскю
Для вiзyалiзацi! швидкостi мiнеpалiзацi! призначають 200 мг тетpациклiнy за 21—20—19 та 8—7—6 дшвперед бю-паею. Подвiйне маркування тетpациклiном виконуеться за-звичай для кiлькiсного апостеpiоpного аналiзy та для прове-дення динамiчно! гiстомоpфометpi! [16]. Проте ця процедура не проводиться перед пстолопчним дослщженням кiстково!
Table 3. Tetracycline labeling scheme Таблиця 3. Схема пдготовки пацента з маркуванням тетрациклном (зразок)
Preparation for bone biopsy: 09r12.10
Treatment with Tetracycline
Patient, DOB
Please lake one tablet to the below listed date and tim e
Cwis f*\a le txeafcl«!
15.11.2010 8:00 AM 1:00 PM 6:00 PM 11.00 PM
16.11.2010 8:00 AM 1:00 PM 6:00 PM 11:00 PM
17.11.2010 8:00 AM 1:00 PM 6Л0 PM 11Я0 PM
14 days break
01,12.2010 8;00 AM 1 ;00 PM ело PM 11:00 PM
02.12.2010 8:00 AM 1:00 PM 6Я0 PM 11.-00 PM
03.12,2010 8;Q0 AM 1:00 PM 6Л0РМ 11:00 PM
Be aware of: UV Exposure dairy products; food Supplemente; antibiotics
Прим '1тка: у таблицi розписано день та час прийому тетра-циклну. Патент nid час прийому тетрациклну не повинен мати ультрафолетового опромнення, приймати харчов'1 добавки та антиб'ютики.
Figure 1. Organigram of the science network RNO (Research Network in Osteology Vienna) Рисунок 1. Схема орган'ваци науково-досл'дног роботи у Biddrni остеологи в м. BidHi
тканини з метою диференцшного д1агнозу, при якому при-значаеться звичайна (статична) гiстоморфометрiя без мар-кування. Маркування i3 тетрациклiном дозволяе дослщити наявнiсть чи вiдсутнiсть дефектiв мшералiзащ! або дiагнос-тувати остеомаляцiю з остеопешею чи без не! (табл. 3).
Техшка черезклубово! 6ioncii кктки
Перед кiстковою бiопсieю проводиться монiторинг осно-вних napaMeTpiB (артерiальний тиск, сатурация кисню) та без-перервна оксигенацiя. Анестезiя здiйснюeться за допомогою введення мщазоламу та 1% пропофолу внутрiшньовенно та 1% лщокашу пiдшкiрно.
Черезклубова бюпсш здiйснюeться 6-мiлiметровим троакаром пiсля проведеного надрiзу шкiри в дiлянцi, яка знаходиться на 5—8 см нижче spina iliaca anteriorsuperior, до точки, що локалiзуeться на 8 см нижче за найвищу точку гребеня клубово! кiстки.
Для того щоб провести структурний, пстоморфометрич-ний аналiз та тест на експресш генiв, кожному пацieнту проводиться двi орieнтованi паралельно черезклубовi бюпсп лiвоi клубово! кiстки (рис. 2). Бюпсш кiстки здiйснюeться в операцшному залi в стерильних умовах. Отримаш бiоптати (дiаметром 7 мм) спочатку оцiнюються вiзуально. Бiоптати повиннi мати кортикальний шар iз зовншньо! та внутршньо! сторони завтовшки 6—8 мм, тобто бюптат е повним зразком клубово! юстки, цiлiсного органу, що мае трабекулярний та два кортикальних шари, якi можна помiряти (рис. 3). Трива-лiсть процедури — близько 12—15 хвилин.
Figure 2. Principles of doing a bone biopsy Рисунок2. Принципи виконання к'ктково! бюпси
inner diameter. In order to perform histomorphom-etry and structural analysis as well as gene expression testing, each patient undegoes two parallel-oriented, left transiliac bone biopsies (Fig. 2). Using a trephine needle, all biopsies are carried out under sterile conditions at the local operating theatre. Both biopsy cylinders (inner diameter = 7mm) are first visually examined. This method produces a sample with cortex at both ends (6 : 8 mm) which is a representative volume of iliac bone in its entirety, i.e. as an organ, and permits the measurement of trabecular and cortical parameters and the transition areas like the en-
doresoptive area (Fig. 3). The procedure lasts about 12-15 minutes.
The larger, more intact sample is selected for subsequent histomorphometric and structural analysis and is placed in 70% ethanol. The second biopsy is immediately submerged in RNA-Later (Ambion) after dissection of cutaneous, fatty or muscular fragments, stored as instructed by the manufacturer and shipped on dry ice to the Medical University of Vienna.
After biopsy, patients are advised to maintain bed rest with the biopsy site on a sand sack for a period of 6 h and patients should refrain from hard work for at least 3-4 days. Normally, the 3-4 stitching are removed after 14 days. Local side effects are seldom, mostly due to early movements of the patients including local hematoma. None of the patients had a post interventional wound infection so far.
Histology and Histomorphometry
Processing of the bone samples is performed without decalcification as described previously [19, 20]. Sections of 5-8m thickness are cut, and Goldner and Giemsa staining are performed; Specimen processing for histology is performed according to Roschger et al. [22, 23]. All 'structure'-biopsies are ethanol-fixed, dehydrated and polymethylmethacrylate-(PMMA)-embedded. The sections are prepared with 2-methoxyethyl-acetate before being stained with a modified Gold-ner's Trichrome method. Histological analyses are performed according to Parfitt et al. [24] on the whole area of the bone sections. In order to exclude malignant causes of osteoporosis such as lymphoma or mastocytosis, a certified pathologist performs routine assays (Fig. 4). A light microscope (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Germany) equipped with a Zeiss AxioCam videocamera is used to obtain digital images of the sections. The images are analyzed using standard procedures (NIH Image software versions 1.62 and 1.63, Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD) on a Power Macintosh G4. For the male patients structural parameters and static parameters of bone formation and resorption are usually compared with published normative data from men aged between 41 and 50 years [25].
Analytical histomorphometry is performed by BIOQUANT Image Analysis Corporation (Nashville,TN) using the BIOQUANT OSTEO bone biology research system, version 8.40.10. For each section, 25 systematically random fields of view are imaged with a 20X objective from within the
Figure 3. Native bone specimen Рисунок 3. Зразок к'кткового боптата
Найбшьший та непошкоджений зразок вщбирають для подальшого пстоморфометричного та структурного аналiзу та помщають у контейнер i3 70% етиловим спиртом. Другий бюптат очищують вод кусочюв шюри, жирово'1 та м'язово'1 тканини та негайно помщають у спещальний розчин, який використовують для подготовки зразюв до дослщження мРНК, та вщправляють на сухому льодi до Медичного ушверситету Вщня.
Шсля проведено'1 бюпси, пащентам радять знаходитися в ложку протягом 6 годин. На зазначений час на мюце, де було взято бюптат, кладуть мшечок iз тском. Пащента звшьня-ють вод важко'1 роботи щонайменше на 3—4 дно Шви зшма-ють через 14 дшв шсля проведено'1 процедури. 1з мюцевих побiчних ускладнень iнодi виникае локальна гематома, яка зазвичай пов'язана iз порушенням рухового режиму. У жод-ного пацiента не було шфекцп' пiсляоперацiйноï рани.
Гiстологiчне та гктоморфометричне дослiдження
Пiдготовка зразкiв до дослщження проводиться без де-кальцифжаци, як здiйснювалося ранiше [19, 20]. Зрiзи за-втовшки 5—8 мм фарбуються за Голднером та Пмзе; пщго-товка зразкiв до пстолопчного дослiдження здiйснюеться за методикою Roschger та спiвавторiв [22, 23]. Ус бiоптати для вивчення структурних властивос-тей фiксуються спочатку в етанол^ потiм зне-воднюються, пiсля чого фжсуються полiметил-метакрилом. Безпосередньо перед фарбуванням за Голднером зразки фжсуються 2-метоксиеть лацетатом. Гiстологiчний аналiз здшснюють за методикою Парфiта та ш. [24], при якому вивча-еться вся площа отриманого бiоптата. З метою виключення злоякiсного Генезу остеопорозу, наприклад лiмфоми або мастоцитозу, зразки на-правляються до сертифiкованого патологоанатома для висновку (рис. 4). Наступним етапом е свiтлооптична мжроскошя (Axiophot, Zeiss, Oberkochen, Нiмеччина), обладнана видеокамерою (Zeiss AxioCam) для отримання цифрових зображень зразка, а також використо-вуються загальноприйнятi методики. У чоловiкiв отримаш результати структурного та статичного аналiзу формування та резорбц11 кiстки порiвнюються з опублiкованими норма-тивними даними чоловтв 41—50^чного вiку [25].
Аналогична гiстоморфометрiя здiйснюеться за допомогою аналiзатора зображення BIOQUANT (Nashville, TN) iз використанням системи дослiдження бюлопчних параме-трiв кiстковоï тканини BIOQUANT OSTEO, версоя 8.40.10. Дана система дозволяе вивчати одночасно 25 рiзних дшянок кiстковоï тканини зi збшьшенням об'ектива х 20, при якому можна оцiнити структуру трабекули. Результати пстоморфо-метр11 (рис. 5) вщповщають стандартизованiй номенклатурi [24]. Додатково ощнюеться об'ем кiсткового мозку, як об'ем тканини мшус об'ем кiстки, та об'ем жиру, який обчислю-еться як повний об'ем адипоцитав у межах об'ему кюткового мозку юстки.
Figure 4. Bone section in Goldner staining Рисунок4. Зр'в к'ктково! тканини,зафарбований за Голднером
trabecular compartment. Histomorphometric data
(Fig. 5) are reported according to the standardized
nomenclature [24]. In addition, marrow volume
(Ma.V) is calculated as tissue volume minus bone
volume. Fat volume (Fat V) is calculated as the total
adipocyte volume within bone marrow volume.
As an alternative semiquantitative approach os-teoporomalacia (osteoporosis and osteomalacia) is distinguished from high-turnover osteoporosis by quantifying and characterising osteoblasts. Highturnover osteoporosis is characterised by about 30 % of osteoid surface covered with cubic osteoblasts and high-normal or increased number of osteoclasts. Mineralizing surface or bone surface and activation frequency is increased; whereas mineral apposition rate and mineralization lag time is normal. Low-turnover osteopenia is characterized by few remodeling foci and reduction in osteoblast and osteoclast number. Osteoidosis and fibro-osteoclasia may be considered as indicators for renal osteodystrophy if impaired renal function is known (this information is always provided to the osteopathologist); if this is not the case, this histological finding suggests primary hyperparathyreoidism.
Quantitative backscattered electron imaging (Fig. 6.)
The block samples embedded in polymethylmethacrylate (PMMA) containing cancellous and cortical bone are prepared by grinding and polishing to receive plane and parallel surfaces. Subsequently, the surface plane containing bone tissue is coated by carbon (using vacuum evaporation) for qBEI analysis in the scanning electron microscope. Cancellous (Cn.) and cortical (Ct.) bone mineralization density distribution (BMDD) are determined by qBEI using a digital scanning electron microscope (DSM 962, Zeiss, Oberkochen, Germany) equipped with a four-
Figure 5. Histomorphometric analysis (Goldner staining) Рисунок 5. Пстоморфометричний аналiз (зафарбований за Голднером)
Примтка: результат досл'дження наведено в таблиц (по-казники обстеженого патента порiвнюються i3 показниками групи здорових людей)
Також проводиться альтернативний нашвкшьюсний ана-лiз на остеопоромаляцш (остеопороз та остеомалящя) у пащ-ента i3 високим ступенем юсткового ремоделювання, метод Грунтуеться на визначенш характеролопчних та кшьюсних властивостей остеобласта. Остеопороз i3 високим ступенем юсткового ремоделювання характеризуеться пстолопчною картиною, при якш близько 30 % остеощу покрито ^6i4-ними остеобластами та кшьюсть остеокласта сягае верхньо'1 межi норми або е вищою за норму. Мiнералiзацiя поверхш юстки або частота ïï активацй' збшьшена, тодi як швидюсть мшералiзацil та час затримки мiнералiзацiï в межах норми. Остеопороз iз низькою швидкютю ремоделювання характеризуеться лише кшькома фокусами ремоделювання та зни-женням кшькост остеоцита та остеобласта. Остеощоз та фiброостеоклазiя можуть розщнюватися як шдикатор нир-ково'1 остеодистрофй', якщо у пащента е порушення нирково'1 функци (ця шформащя повинна бути в остеопатофiзiолога), якщо ж такого симптому немае, то це може бути ознакою первинного гшерпаратиреозу.
Кшьккна зворотна електронна мiкроскопiя qBEI (рис. 6)
Пiдготовленнi блоки для електронно'1 мiкроскопiï мають губчату та кортикальну кiстку. Зразки фiксуються полiметил-метакрилом (PMMA) для полiрування та шлiфування, щоб отримати чiтку поверхню кiстковоï тканини. Пiд час прове-дення qBEI в електронному мжроскош зовнiшня поверхня блока, яка мютить тканину кiстки, занурюеться у вуглець (проходить вакуумне випаровування).
Дана методика дозволяе визначити розподщ мшераль-но'1 щiльностi (BMDD) в трабекулярнш (Cn.) та корти-кальнш (Ct.) кiстцi, використовуючи потужний цифро-вий електронний мiкроскоп (DSM 962, Zeiss, Oberkochen, Шмеччина). Структура губчато'1 та кортикально'1 тканини можна вивчати при збшьшенш х 50, що вщповщае роздiль-нiй здатностi 4 мм/пiкселiв, використовуючи швидкiсть сканування до 100 с/кадр, що дозволить отримати цифрове зображеннями з роздшьною здатшстю 512 х 512 пiкселiв.
Figure 6. QBEI analysis Рисунок6. QBEIанал'>з (к'тьшсназворотна електроннамЫроскоп'т) Примтка: на рисунку зл'ша подано зразок пстоморфометричного досл'дження. На рисунку справа — досл'дження qBEI, яке дае змогу оцнити структуру однieíтрабекули. Темно-ср длянки а низькою, а св'тло-с'р — 'в високою м'шерал'вац'кю.
quadrant semiconductor backscattered electron (BE) detector as described previously [26]. The accelerating voltage of the electron beam is adjusted to 20 kV, the probe current to 110 pA, and the working distance to 15 mm. The entire cancellous and cortical bone areas are imaged at x 50 nominal magnification (corresponding to a pixel resolution of 4 ^m/pixel), using a scan speed of 100 sec/frame, resulting in digital calibrated BE images of 512 x 512 pixels. From the digital images, grey level histograms are deduced, displaying the percentage ofbone area occupied by pixels of a certain grey level. The transformation of these into calcium wt% histograms leads to a bin width of 0.17wt% calcium. A technical precision of 0.3 % is achieved. The BMDD parameters e.g., the mean (weighted mean) CaMean and the most frequent calcium concentration CaPeak (mode, peak position of the BMDD) in the sample, the width of the distribution CaWidth (full width at half maximum) reflecting the heterogeneity in matrix mineralization, the fraction of low mineralized bone (CaLow), which is the percentage of the area below 17.68 wt% Ca (corresponding to the 5th percentile of reference BMDD) and the fraction of fully mineralized bone (CaHigh), which is the portion of the area above 25.30 wt% Ca (corresponding to the 95th percentile of reference BMDD) [27, 28] are derived from the histogram. The BMDD values obtained from the patients are compared to those of the reference BMDD of normal adults (Fig. 7) [28, 29].
Micro-computed Tomography (p-CT)
The micro-tomographic imaging system (^CT40, Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland) is equipped with a 5^m focal spot X-ray tube as a source. A two-dimensional CCD coupled to a thin scintillator as a detector permitted acquisition of 206 tomographic images in parallel. The long axis of the PMMA-em-bedded biopsy is oriented along the rotation axis of
Даний метод дозволяе Í3 цифрового зображення вивести показник кютки, зайнято! ткселями певного рiвня яскра-воста, у вщсотках. Таким чином, можна ощнити насичення певно! дшянки кютково! тканини кальщем. Техшчна точ-нють сягае 0,3 %. Можна ощнити таю показники з дiаграм розподшу мшерально! щшьносп кютки (BMDD): середня концентрация кальщю в кютщ (CaMean); найчастша кон-центращя кальщю в зразку (CaPeak); ширина розмщення кальщю (CaWidth), яка визначае гетерогеншсть мшераль заци зразка; показник низько! фракци кальщю (CaLow), тобто у вщсотках показник площi iз рiвнем кальщю ниж-чим 17,68 wt% (показник нижче 5 %е); фракщя повно! мь нералiзащi кютки (CaHigh), яка вщображае дшянки iз кон-центращею кальщю вищою за 25,30 wt% (показник вище 95-го процентиля BMDD) [27, 28]. Ус отримаш результати пащента порiвнюються з нормативними даними BMDD здорових дорослих людей (рис. 7) [28, 29].
Мшрокомп'ютерна томографiя (ц-CT)
Система мiкротомографiчноi' вiзуалiзацii' (^CT40, Scanco Medical AG, Brüttisellen, Швейцарiя) обладнана рентгенiвською трубкою. Двовимiрний зарядний при-стрiй приеднаний до тонкого сцинтилятора як детектора, який дозволяе робити паралельно 206 томографiчних зображень. Фжсований полiметилметакрилом бiоптат кладуть так, щоб по довжинi вш збiгався з вiссю обертан-ня сканера. Сканування здшснюеться при iзотропiчнiй номiнальнiй роздiльностi 10 ^м (висока роздшьшсть). Данi зображення фiльтрують, використовуючи фiльтр Гауса. Мiнералiзована тканина фрагментуеться залежно вщ кольору тканини (22 % — максимально ирий колiр шкали). Використання 3D [30] дозволяе дослщжувати об'ем трабекул в середин бiоптата iз видiленням досль джувано! зони. Морфометричнi показники визначають-ся у дев'яти рiзних мiсцях трабекулярно! кiстки i вклю-чають об'ем юстки, товщину трабекул, розгалуженiсть трабекул, кшькють трабекул, щiльнiсть трабекул, струк-турний iндекс зразка.
the scanner. The X-ray tube is operated at 70kVp and 114^A with an integration time set to 200ms. Scans are performed at an isotropic, nominal resolution of 10^m (high resolution mode). The image data are filtered using a Gaussian filter (sigma 1.2, support 1) to partially suppress noise in the volume. The mineralized tissue is segmented from soft tissue by a global threshold procedure with a value set to 22 % of the maximum greyscale value. A special automatic contouring algorithm is used to automatically detect the envelope of the biopsy, followed by a 3D erosion algorithm to define the trabecular bone volume of interest (VOI) within the biopsy and to exclude any cortical bone. Morphomet-ric indices are determined for the nine trabecular bone compartment using a direct 3D approach [30] and included bone volume (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular separation (Tb.Sp), trabecular number (Tb.N), connectivity density (Conn.D) and the structure model index (SMI).
RNA extraction, cDNA and RealTime PCR
Using RNAse-free instruments, a small cube of trabecular bone (approx. 5 x 5 x 5 mm) is cut out of the middle part of the intact biopsy at a laminar flow bench. To reduce marrow content, the cube is repeatedly rinsed with RNA-Later. Together with two small steel beads, the bone sample are transferred to an RNAse-free Eppendorf tube and are flash-frozen in liquid nitrogen. For tissue homogenization, the cooled tubes are placed in a grinding mill (3 minutes; 30Hz). Subsequently RNA extraction is performed on the basis of a guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform protocol (Trizol, Invitrogen) [31]. Apart from double precipitation and centrifugation at the isopropanol stage (12000 g; 10 minutes; 4 °C), the manufacturer's protocol is followed. RNA quality and quantity are checked by electrophoresis and photometry at 260 nm and 280 nm. The 260/280nm absorbance ratios ranged from 1.5 to 2. cDNA is synthesized from 4 ^g of total RNA using a cDNA synthesis kit (High Capacity cDNA reverse transcription kit, Applied Biosystems). Realtime PCR is performed using assay-on-demand primers and probes following the manufacturer's instructions. Per reaction the amplification mixture (20 ^l) consisted of 9 ^l cDNA (dilution 1 : 10), 10 ^l mastermix buffer (TaqMan Universal PCR Mastermix) and 1 ^l probe i.e. Wnt10b Hs00559664_m1), runx2 (Hs00231692_ m1), osterix (Hs00541729_m1), osteocalcin (Hs00609452_g1), SOST (Hs00228830_m1), RANKL (Hs00243519_m1), OPG (Hs00171068_ m1) and GAPDH (Hs99999905_m1). Using a thermal cycler (ABI Prism Sequence Detection System 7700, Applied Biosystems) 10 cycler conditions were
Figure 7. BMDD curve of normal human adult trabecular bone (line A) and of a girl with OP before(line B) and after (line C) VID therapy Рисунок7. Криварозпод'лумнерально/ щ'льност! трабеку-лярно/ к'ктки у здорово/ доросло/людини (крива А) та крива д'вчинки i3 недосконалим остеогенезом до (крива В) та тсля (крива С) лЫування втамном D
Витяг РНК, кДНК та полiмеразноланцюгова реакщя в реальному 4aci
З найбшьш неушкоджено! трабекулярно! частини бюптата (ближче до середини) надрiзаеться зразок роз-мiром 5 х 5 х 5 мм. Для звшьнення зразка вщ юсткового мозку його промивають спещальним розчином RNA-later. Шсля цього зразок помщають в спещальш про-бiрки (RNAse-free) разом iз двома сталевими кульками та заморожують у рщкому азоть Шсля цього заморожен пробiрки помщають у спещальний пристрш для подрiб-нення зразка до гомогенно! маси (3 хв). Витяг РНК здш-снюеться з використанням тризолу та швгтрогену [31]. Наступним кроком е стадiя iз використанням iзопропа-нолу (згщно з протоколом), на якш двiчi проводяться прециштащ! та центрифугування (12 000 г; 10 хвилин; при 4 °C). Яюсть i кшьюсть РНК перевiряють шляхом електрофорезу та фотометрп при 260 нм та 280 нм (260/280-нм сшввщношення спектрально! поглинально! здатност вщ 1,5 до 2).
Для дослщження кДНК потрiбно 4 мг речовини, отри-мано! для дослщження РНК, та тест-система для визна-чення кДНК (High Capacity cDNA reverse transcription kit, Applied Biosystems). Здшснюеться полiмеразноланцюго-ва реакщя в реальному чаи згщно з шструкщею вироб-ника. Проби ставляться тричi для кожного гена. Визна-чаються RANKL, OPG, OSX i runx2 (граничне значення показника складае 0,15), GAPDH (граничне значення показника становить 0,03 одинищ), wnt, остеокальцин i SOST (граничне значення показника становить 0,07) [32]. Отримаш результати дослщження експресп гешв використовують для аналiзу ^-CT та отримують збiльше-не в кшька разiв зображення, змодельоване GAPDH екс-пресiею генiв (рис. 8).
50 °C for 2 min and 94 °C for 2 min, followed by 40 cycles with 94 °C for 15 s and 60 °C for 30 s. Amplification curves are visually checked for exponentially and thresholds are set at 0.15 units for RANKL, OPG, OSX and runx2. The threshold for GAPDH is 0.03 units, whereas the threshold for wnt, osteocalcin and SOST is set at 0.07 units. All experiments are performed in triplicates and are normalized to the housekeeping gene GAPDH. GAPDH is chosen as housekeeping gene because of its repeated use in human gene expression studies addressing osteoporosis research questions [32]. The results are calculated applying the ^-CT method and are presented in fold increase relative to GAPDH expression (Fig. 8).
Conclusion
Despite all progress in non-invasive diagnostic procedures for metabolic bone diseases such as osteoporosis, there is still a small subgroup of female and male patients who may benefit from adding bone biopsy into the diagnostic procedure. Most of the patients with osteoporosis are mainly managed using serum biochemical markers or non-invasive imaging techniques. These patients are categorized as untypical cases, i.e. males and pre- and postmenopausal females with fragility fractures, individuals in whom conventional non-invasive diagnostic procedures cannot explain the aetiology of the bone disease, or their «non-responders» status to treatment.
Limitations of bone biopsies can be optimised with frequent training of the biopsy technique and better understanding oft the analytical information that can be obtained from bone biopsies. Since new therapeutic agents have been developed which suppress high osteoclast turnover and osteoclast inductive therapies which stimulate predominantly bone formation. Basically bone biopsies should be performed when pathogenic mechanisms are unclear. Further, changes in bone quality and material properties, such as microarchitecture, matrix quality, and mineral quality as contributing factors to bone fragility — still require invasive analysis of bone tissue and cannot be described by non-invasive techniques.
Osteoporosis Normal
Figure S. pCT images Рисунок S. М'жрокомп'ютерна томограф'я к'ктково! тканини
Висновок
У бшьшост випадюв хворим з остеопорозом при-значають сироватковi бiохiмiчнi маркери та нешвазивш шструментальш методи дослщження. Незважаючи на значний прогрес нешвазивних методiв, яю викорис-товуються для дiагностики метаболiчних захворювань кютки, зокрема остеопорозу, юнуе маленька група па-щенлв, для яких важливе включення кютково'1' бюпсп' в дiагностичний алгоритм. Ктшчш випадки у таких хво-рих називають атиповими, для прикладу, чоловжи, пре-та постменопаузальш жшки iз низькоенергетичними переломами, тобто це т пащенти, у яких даш, отримаш за допомогою сучасних нешвазивних методiв, нешфор-мативш щодо етюлогп' хвороби кютки, або т пащенти, яю не вщповщають на призначену терашю.
Недолжи бюпсп' можна усунути шляхом накопичен-ня досвщу ïï проведення та кращого усвщомлення важ-ливостi й iнформативностi даних, отриманих iз вико-ристанням цього методу. З'явилися новi терапевтичнi середники, яю пригнiчують активнiсть остеобластiв, та розроблено остеоакластшдукуючу терапiю, метою яко'1 е стимулювання формування кiстки. В основному кютко-ва бiопсiя повинна призначатися у випадку незрозумших патогенетичних механiзмiв розвитку хвороби.
Порушення якостi кютки та ïï тканинних властивостей, таких як мжроархггектошка, якють матриксу, незадовшь-ний стан мiнералiзацi'ï як чинники, що сприяють крихкостi кiстки, — усе це вимагае призначення швазивного методу дослщження i не може бути описано за допомогою жодно'1' нешвазивно'!' технiки.
Список лiтератури/References
1. Kruse H.-P., Kuhlencordt F. Grundzüge der Osteologie. — Berlin: Heidelberg; New York: Springer-Verlag; Tokyo,1984.
2. Malluche H.H., Faugere M.-C. Bone biopsies: histology and histomorphometry of bone // Metabolic bone disease and clinically related disorders / Avioli L.V., Krane S.M. (eds). — Philadelphia: WB Saunders Company, 1990. — Р. 283-328.
3. Meunier P.J. Assessment of bone turnover by histomorphometry in osteoporosis // Osteoporosis — etiology, diagnosis and management / Riggs B.L., Melton L.J. (eds). — New York: Raven Press, 1988. — Р. 317-332.
4. Kann P.H. Bone densitometry and ultrasound studies of the bone: methods, indications and efficacy // Orthopäde. — 2001. — 30. — 437443.
5. Pfeilschifter J., Kann P.H. Evaluation of osteoporosis // Z. Gastroenterol. — 2002. — 40 (Suppl. 1). — S46-S56.
6. Ettinger MP Aging bone and osteoporosis: strategies for preventing fractures in the elderly // Arch. Intern. Med. — 2003. — 163. — 22372246.
7. Kenny A.M., Joseph C., Taxel P., Prestwood K.M. Osteoporosis in older men and women // Conn. Med. — 2003. — 67. — 481-486.
8. Scheidt-Nave C., Baum E., Dören M., Hadji P., Keck E., Minne E., Seibel M. DVO-Leitlinie Osteoporose bei postmenopausalen Frauen // Osteologie. — 2003. — 12. — 13-41.
9. Fassbender W.J., Scheidt-Nave Ch., Pfeilschifter J. Dachverband der Deutschsprachigen Osteologischen Fachgesellschaften Evidence-based clinical practice guidelines for diagnosis and treatment of osteoporosis // Dtsch Med. Wochenschr. — 2003. — 128. — 1615-1616.
10. Hauge E., Mosekilde L.E., Melsen F. Missing observations in bone histomorphometry on osteoporosis: implications and suggestions for an approach // Bone. — 1999. — 25. — 389-395.
11. Ziegler R Osteoporose: aktuelle Diagnostik und Therapie // Orthopädische Praxis. — 2002. — 38. — 570-577.
12. Mehl B., Delling G., Schlindwein I., Heilmann P., Voia C., Ziegler R., Nawroth P., Kasperk C. Do markers of bone metabolism reflect the presence of a high- or low-turnover state of bone metabolism? // Med. Klin. — 2002. — 97. — 588-594.
13. Allolio B. Role of bone histology in the determination of bone metabolism // Med. Klin. — 2003. — 98. — 110.
14. Barthel H.R., Seibel M.J. Role of bone histology in the determination of bone metabolism // Med. Klin. — 2003. — 98. — 111-112.
15. Patsch J., Kohler T., Berzlanovic A., Muschitz C., Bieglmayr, Roschger P., Resch H., Pietschmann P. Trabecular bone microstructure and local gene expression in iliac crest biopsies of men with idiopathic osteoporosis // JBMR, accepted 2011.
16. Bordier P., Matrajt H., Miravet L., Hioco D. Mesure histologique de la masse et de la résorption des travées osseuses // Pathol. Biol. — 1964. — 12. — 1238-1243.
17. Orwoll E., Ettinger M., Weiss S., Miller P., Kendler, Graham J., Adami S., Weber K., Lorenc R., Pietschmann P., Vandormael K., Lom-bardi A. Alendronate for the treatment of osteoporosis in men // N. Engl. J. Med. — 2000. — 343. — 604-10.
18. Orwoll E.S., Scheele W.H., Paul S., Adami S., Syversen U., Diez-Perez A., Kaufman J.M., Lancy A.D., Gaich GA. The effect of teriparatide (human parathyroid hormone (1—34)) therapy on bone density in men with osteoporosis // J. Bone Miner. Res. — 2003. — 18. — 9-17.
19. Genant H.K., Wu C.Y., van Kuijk C., Nevitt M.C. Vertebral fracture assessment using a semiquantitative technique // J. Bone Min. Res. — 1993. — 8. — 1137-48.
20. Hahn M., Vogel M., Delling G. Undecalcified preparation of bone tissue: report of technical experience and development of new methods // Virchows Arch. а Pathol. Anat. — 1991. — 418. — 1-7.
21. Delling G., Werner M. Ist die histologische Untersuchung des Knochengewebes noch zeitgema ß? // Osteologie. — 2001. — 10. — 3-14.
22. Roschger P., Rinnerthaler S., Yates J., Rodan G.A., Fratzl P., Klaushofer K. Alendronate increases degree and uniformity of mineralization in cancellous bone and decreases the porosity in cortical bone of osteoporotic women // Bone. — 2001. — 29. — 185-91.
23. Roschger P., Gupta H.S., Berzlanovich A., Ittner G., Dempster D.W., Fratzl P., Cosman F., Parisien M., Lindsay R., Nieves J.W., Klaushofer K. Constant mineralization density distribution in cancellous human bone // Bone. — 2003. — 32. — 316-23.
24. Parfitt A.M., Drezner M.K., Glorieux F.H., Kanis J.A., Malluche H., Meunier P.J., Ott S.M., Recker R.R. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee // J. Bone Miner. Res. — 1987. — 2. — 595-610.
25. Rehman M.T., Hoyland J.A., Denton J., Freemont A.J. Age related histomorphometric changes in bone in normal British men and women // J. Clin. Pathol. — 1994. — 47. — 529-534.
26. Roschger P., Fratzl P., Eschberger J., Klaushofer K. Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies // Bone. — 1998. — 23. — 319-326.
27. Roschger P., Paschalis E.P., Fratzl P., Klaushofer K. Bone mineralization density distribution in health and disease // Bone. — 2008. — 42. — 456-466.
28. Roschger P., Gupta H.S., Berzlanovich A., Ittner G., Dempster D.W., Fratzl P., Cosman F., Parisien M., Lindsay R., Nieves J.W., Klaushofer K. Constant mineralization density distribution in cancellous human bone // Bone. — 2003. — 32. — 316-32.
29. Fratzl-Zelman N., Roschger P., Misof B., Nawrot-Wawrzyniak K., Pötter-Lang S., Muschitz C., Resch H., Klaushofer K., Zwettler E. Fragility fractures in men with idiopathic osteoporosis are associated with undermineralisation of the bone matrix. Accepted CTI 2011.
30. Hildebrand T., Laib A., Müller R., Dequeker J. and Rüegsegger P. Direct three-dimensional morphometric analysis of human cancellous bone: microstructural data from spine, femur, iliac crest, and calcaneus // J. Bone Miner. Res. — 1999. — 14. — 1167-74.
31. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. — 162. — 156-919.
32. Kuliwaba J.S., Findlay D.M., Atkins G.J., Forwood M.R., Fazzalari N.L. Enhanced expression of osteocalcin mRNA in human osteoar-thritic trabecular bone of the proximal femur is associated with decreased expression of interleukin-6 and interleukin-11 mRNA // J. Bone Miner. Res. — 2000. — 15. — 332-41.
Переклад Роксолани ПОВОРОЗНЮК та Натали БАЛАЦЬКОÏ Отримано 21.03.11
