CC BY
13
УДК 616.379-008.64-06:575
https://doi.org/10.24026/1818-1384.4(64).2018.150000
ЗВ'ЯЗОК ПОЛ1МОРФ1ЗМУ RS1799983 ГЕНА NOS3 З ЦУКРОВИМ Д1АБЕТОМ 2 ТИПУ ТА РОЗВИТКОМ ЙОГО УСКЛАДНЕНЬ
C.B. Зяблщев1, О.П. Чернобривцев1, Д.С. Зяблщев2, С.О. Тарасенко3
Нащональний медичний утверситет iMern О.О. Богомольця, Kuïe, Украша 2Кшвський медичний утверситет, Кшв, Украта
3Украгнський науково-практичний центр ендокринног хiрургiï трансплантацп ендокринних оргатв i тканин МОЗ Украни
ft /
ВСТУП
Судинн ускладнення цукрового дiабету (ЦД) переважно визначають тяжесть цього патолопчного стану, ранню iнвалiдизацiю i передчасну смертнкть населення [1, 2]. У цьому планi ключовим е поняття ролi судинного ендотелiю, який е динамiчною регулюючою системою як у фiзiологiчних, так i при патологiчних процесах [3, 4]. Ендотелiальна дисфункцiя (ЕДФ) формуеться при запалены судин, атеросклерозу ппертонп, кардюмюпатп, ретинопатп, нейропати [5-7]. Гiперлiпiдемiя, гiперглiкемiя та iншi метаболiчнi чинники спричиняють розвиток ЕДФ i судинних ускладнень при ЦД 2 типу [7]. До розвитку ЕДФ при ЦД 2 типу призводять Ытенсифка^я окисного стресу, системне запалення з пошкодженням глкокалксу i порушенням мiжклiтинних контактiв ендотелiоцитiв та гемато-тканинного бар'еру та iншi патогенетичнi фактори [8]. З шшого боку, сам пошкоджений ендотелiй включаеться в патогенез ЦД i обумовлюе розвиток подальших порушень [3].
Останнiми дослiдженнями показана важлива роль генетичних факторiв, що вiдiграють важливу етiологiчну роль у виникненн метаболiчних захворювань i, в тому числу ЦД 2 типу [9-12]. У цьому план привернув увагу полiморфiзм гб1 799983 (6894Т, 6!и298АБр) гена 1\ЮБ3, мiнорна алель Т якого асоцшована зi зниженням активносп ендотелiальноí ЫО-синтази (еЫОБ) [9]. Так, у бразильському дослщжены (200 хворих та 100 учаснитв контрольно!' групи) встановлена його асощащя з атеросклерозом (р=0,0378) [10]. У робот турецьких вчених показана роль полiморфiзму гб1 799983 гена ЫОБ3 у виникненн гестацiйного
дiабету (68 хворих проти 73 учасникш контрольно!' групи), який пов'язують з погiршенням функцп рено-васкулярно''' системи [11]. У дослщжены iранських вчених показана роль цього полiморфiзму у виникненнi дiабетично''' виразки на стоп [12]. Численнi лп"ературы данi, а також аналiз власних дослщжень (вiсiм дослiджень з полiморфiзмом rs1799983 гена NOS3 i чотири мета-аналiзи; загалом 4795 випадкiв патологП' та 3805 контрольних) дозволили O. Tabatabaei-Malazy та спiвав. (2017) довести позитивний зв'язок цього полiморфiзму з ЦД 2 типу [13].
Роботою, що пщсумувала рiзнi данi останых рокiв, можна вважати розробку J. Rani та ствав. (2017) генетичного атласу ЦД 2 типу, який був складений шляхом штегративного аналiзу геыв, пов'язаних з цим захворюванням та його ускладненнями з використанням бази Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) [9].
Проаналiзовано дан про 650 геыв i 34 мiкроРНК, як пов'язанi з ЦД 2 типу та розвитком його ускладнень. Доведено, що ам геыв - AG ER, TNFRSF11B, CRK, PON1, ADIPOQ, CRP i NOS3 мають зв'язок з розвитком серцево-судинних ускладнень, атеросклерозу, ретино- та нефропаиями у хворих на ЦД 2 типу.
Виходячи з викладеного, можна вважати, що полiморфiзм rs1799983 гена NOS3 (G894T), який призведе до замши амшокислотноТ послщовносп у молекулi ферменту (Glu298Asp), мае вщношення до розвитку дiабетичних судинних ускладнень, що продиктувало необхщнкть окремого дослщження ролi цього полiморфiзму у формуваннi судинних ускладнень та ЕДФ при ЦД 2 типу у хворих з украТнсько''' популяцп.
Зяблщев Сергш Володимирович, д. мед. н., професор кафедри патофiзюлогu; E-mail: zsv1965@gmail.com. Чернобривцев Олександр Петрович, асистент кафедри татофiзюлогu; Зяблiцев Денис Сергшович, к. мед. н., асистент кафедри внутрштх хвороб. Тарасенко Сергш Олександрович, науковий спiвробiтник вiддiлу патологи.
Мета: проведення аналiзу результат визначення асофаци полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 з ЦД 2 типу, розвитком ускладнень, клшко-лабораторними показниками, що характеризують тяжкiсть перебiгу захворювання та розвиток ЕДФ.
МАТЕР1АЛ ТА МЕТОДИ
До дослщження залучено данi 152 хворих з ЦД 2 типу. Вк пащетчв становив вiд 34 до 80 ротв, у середньому 53,9±8,4 року. Жiнок було 95 (62,5%), чоловшв - 57 (37,5%). Зпдно клiнiчних рекомендацiй [1, 14, 15] за результатами клМко-лабораторних обстежень визначали наявысть дiабетичних ретинопатп, нефропатп за рiвнями альбумшурп та швидкосп клубочково' фтьтраци (ШКФ), сенсорно''' полшейропатп, макроангiопатí'' нижнiх кiнцiвок та артерiально''' ппертензи. Згiдно кл^чноТ класифкацп [15], 1 ступiнь тяжкостi не була виявлена у жодного патента, 2 ступшь - у 120 (78,9%) та 3 ступшь - у 32 (21,1%) хворих. Отже, у цьому дослщжены хворих було розподтено на три групи. Для цього хворих iз 2 ступенем тяжкосп було розподтено на двi групи: першу склали 57 (37,5%) хворих, другу - 63 (41,4%) хворих. Крт^ем для 'х розподту було обрано ступшь компенсацп ЦД 2 типу за рiвнем глкованого гемоглобшу (HbA1C): до 1-'' групи були залучен хворi в стан компенсаци або задовтьноТ компенсацГ'' рiвня гiперглiкемГ'' (HbA1C на рiвнi 7-9%); до 2-' - з низькою якктю глiкемiчного контролю у стан декомпенсацГ'' (HbA1C бiльше 9%). Хворi з 3 ступенем тяжкостi склали 3-ю групу. До контрольно' групи було залучено 95 практично здорових оаб вщповщного вдового та гендерного розподту, як не малi порушень вуглеводного обмiну i клшГчно''' маыфестаци симптомiв, схожих з мiкро- i макросудинними ускладненнями ЦД.
У кровi бiохiмiчними методами визначали вмiст креатиншу, сечовини, глюкози, глiкованого гемоглобiну (HbA1C), оксиду азоту (NO) i дiенових кон'югатiв (ДК), у сечi - рiвнi глюкози та мiкроальбумiну (спектрофотометр Specord, Нiмеччiна); iмуноферментним методом у кровi визначали вмiст чинникiв ЕДФ: ендотелшу 1 (ЕТ1; Biomedica Immunoassays, Авс^я), eNOS (BCM Diagnostics, США) i фактору некрозу пухлин (TNFa; Bender Medsystems, Австрiя). lнтенсивнiсть забарвлення продукту ферментативной реакци кiлькiсно вимiрювали на фотометрi Multiscan EX, Thermo Electron Corp. (Фiнляндiя).
Аналiз полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 (генна
локалiзацiя 7q36.1; 7:150999023) проведено методом полiмеразно''' ланцюгово' реакци (ПЛР) у реальному час (контекстна послдовысть CCCTGCTGCTGCAGGCCCCAGATGA [G/T]
CCCCC AG A ACTCTTCCTTCTG CCCC) в автоматичному амплiфiкаторi Gene Amp® PCR System 7500 (Applied Biosystems, США). На першому етап дослiдження проводили видiлення геномно' ДНК з цтьно''' венозно' кров1 з використанням стандартних реактивiв PureLink® Genomic DNA Kit For Purification of Genomic DNA; виробник INVITROGEN (США). Аналiз полГморФГзму здiйснено з використанням унiфiкованих тест-систем TaqMan Mutation Detection Assays Life-Technology (США).
Для статистично' обробки отриманих даних використовували програму Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Пкля проведення теспв Колмогорова-Смiрнова, Андерсона-Дарлiнга i х-квадрат був встановлений вщмшний вщ нормального характер розподту варiацiйних рядГв (p <0,05). У зв'язку з цим для описово' статистики ктьккних даних використовували медiану (Me) та перший i третiй квартилi (Q1; Q3) варiацiйних рядгв. Незалежнi ви6Грки порiвнювали ¡з застосуванням критерпв Kruskal-Wallis (H) i Mann-Whitney (U). Для порГвняння категор^льних змшних використовували таблицi спряженостi i непараметричний критерiй хi-квадрат (х2) Pearson у модифкацп Yates. У вах випадках статистичного оцiнювання значущiсть вщмшностей враховували при значеннi p <0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
При проведены аналву було порГвняно дан^ отриманi в контрольнш грут, з даними хворих. На початку була проаналвована загальна тенденцт частот генотип^ i алелiв, потГм - частоты рвниф, як вказували на вплив генотипт та алелiв на розвиток захворювання. Для значущих вiдмiнностей розглянуто вщношення шансiв (ВШ) та 95% в1ропдний iнтервал (95% В1), тобто - асоща^ю з ЦД 2 типу (генетичний ризик).
Розподт генотипт у контрольнш грут, згщно наших даних (рис. 1), було портняно з результатами Програми 1000 Genomes Project Phase 3 (http:// www.internationalgenome.org/). У Програму для визначення частот генотипт rs1799983 гена NOS3 було залучено 2504 людини. Предковий генотип G/G був визначений з частотою 0,694 (у наших дослщженнях - 0,46), гетерозигота G/Т - 0,260 (у наших дослщженнях - 0,41), мшорна гомозигота Т/Т -
алелiв вiдповiдали даним Программ 1000 Genomes Project Phase 3 для европейськоТ популяцп'.
У порiвняннi з контролем (див. рис. 1), у хворих було вщзначено зменшення частоти предкового гомозиготного генотипу G/G (p=0,06) та збiльшення частоти мшорного генотипу Т/Т (р=0,09), а також -зменшення частоти предковоТ алелi G (у 1,2 рази; р=0,02) та збiльшення частоти мшорноТ алелi Т (у 1,3 рази; р=0,02). Отже, можна було стверджувати, що розподiл полiморфних генотипiв i алелiв rs1799983 гена NOS3 мав зв'язок з розвитком ЦД 2 типу у хворих з украшськоТ популяцП'.
Для перевiрки цього припущення було проведено розрахунок впливу розподту частот генотитв та алелiв rs1799983 гена NOS3 на розвиток ЦД 2 типу i ступшь Ух асощацп з захворюванням (табл. 1).
Тест ХардиВайнберга для контролiв та випадкв вiдповiдав випадковому характеру успадкування генотитв (вiдповiдно, х2=0,52; df=1; p=0,471 та Х2=1,30; df=1; p=0,254). Аналiз результат по впливу генотипiв, що наведений у таблиц спряженостi (3x3), показав, що зв'язку з захворюванням не виявлено (х2=5,30; p=0,071). Порiвняння частот алелiв, яке наведено у таблиц спряженостi (2x2), показало, що х2=5,82; p=0,016. Отже, алельний полiморфiзм rs1799983 мав зв'язок iз розвитком ЦД 2 типу. Мшорний алель Т збтьшував в 1,6 рази шанси розвитку ЦД 2 типу (ВШ=1,59; 95% В1 1,09-2,32), тодi як предковий алель G так шанси зменшував в 1,6 рази (ВШ=0,63; 95% В1 0,43-0,92).
Отже, осктьки мiнорний алель Т збiльшував
Таблиця 1
Вплив розподту частот генотишв i алелЁв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на розвиток ЦД 2 типу
i ступшьïx асощацм' з захворюванням
Генотипи, алелг ЦД 2 типу, n (f) Контроль, n (f) X2 P ВШ 95% BI
G/G S1 (0,34) 44 (0,4б) S,30 0,071 0,S9 0,3S-0,99
G/T 6B (0,4S) 39 (0,41) 1,16 0,69-1,9S
T/T 33 (0,22) 12 (0,13) 1,92 0,94-3,93
G 170 (0,34) 127 (0,б7) S,B2 0,016 0,63 0,43-0,92
T 134 (0,4S) 63 (0,33) 1,S9 1,09-2,32
npuMimKu: n - юльюсть; f - частота; X - критерй Pearson y модиф'шац'й Yates; р - статистична значyщiсть розб'жностей м'1ж гpyпами; ВШ - в 'дношення шанав; 95% В1 - 95% в 'рог 'дний iнтеpвал для ВШ.
V) ojo 0.60 0.50 0,-10 0.30 0.20 0.10 0,00
^Контроль (11=95)
■9ЦД2Т (11=152)
G/G (pKI.Oi)
GÍT (рЮ.60)
т/т
(рС.09)
0,13
0.22
G
(р—0,02)
0,67
0.56
т
(р=0,02)
0.33
0.44
Рис. 1. Розподл частот генотипе и алел'!в rs1799983 гена NOS3 м'1ж контрольною групою пац'1ент'1в i групою хворих на ЦД 2 типу; р - статистична значущсть роз-бiжностей частот показнике мiж групами за двосто-роннiм точним критерieм Фiшера. За вертикальною вссю - частоти (f); за горизонтальною - генотипи i алел'1.
0,046 (у наших дослщженнях - 0,13); у европейський популяцП' (n=503) показники склали, вщповщно, 0,443; 0,425 та 0,131. Отже, нашi результати зб^алися з результатами для европейськш популяцп.
Порiвняння розподту алелiв у контрольнш груп (див. рис. 1) з даними Програми 1000 Genomes Project Phase 3 показало наступне. Для вах спостережень (n=5008) предкова алель G була визначена з частотою 0,824 (у наших дослщженнях - 0,67), мутантна алель Т - 0,176 (у наших дослщженнях - 0,33); для европейський популяцп (n=1006) показники склали, вщповщно, 0,654 та 0,344. Таким чином, результати контрольно!' групи як по розподту генотитв, так i
Таблиця 2
Домiнантна та рецесивна моделЁ успадкування впливу полiморфiзму rs1799983 гена NOS3
на розвиток ЦД 2 типу
Генотипи ЦД 2 типу (n=152), n (f) Контроль (n=95), n (f) X2 P ВШ 95% В1
Дом. G/G 51 (0,34) 44 (0,46) 4,02 0,045 0,59 0,35-0,99
G/Т+Т/Т 101 (0,66) 51 (0,54) 1,71 1,01-2,89
Рец. G/G+G/Т 119 (0,78) 83 (0,87) 3,23 0,072 0,52 0,25-1,07
Т/Т 33 (0,22) 12 (0,13) 1,92 0,94-3,93
npuMimKu: Дом. - doMÍHaHmHa модель; Рец. - рецесивна модель, n - кльксть; f - частота;Х - критерй Х-квадрат за Pearson у модифкаци Yates; р - значущсть в'дм'шностей; ВШ - в'дношення шансв; 95% В1 - 95% в 'рог 'дний iнтервал для величини ВШ.
шанси розвитку ЦД 2 типу, то ïï наявысть можна було розглядати як фактор ризику розвитку захворювання: шанси розвитку ЦД 2 типу у хворих з украТнськоТ популяцп' ноов aлелi Т збтьшеы в 1,6 рази (р=0,016), тодi як за наявносп предкового алелю G (генотип G/G) так шанси було знижено, що вказувало на можливу протекторну д^ предкового алелю.
Числены повщомлення також вказували на важливу роль полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на розвиток ЦД 2 типу. Так, у египетському дослщжены D. El-Lebedy (2018) при обстеженнi 272 оаб було встановлено, що наявысть мутантноТ алелi Т в 3,07 рази збтьшувала ризик розвитку ЦД 2 типу та в 3,08 рази ризик серцево-судинних захворювань у таких хворих [16]. У широкомасштабному китайському дослщжены з популяцп Хан (1234 хворих на ЦД 2 типу та 1272 учаснитв контрольно!' групи) показана значуща рiзниця у розподЫ мутантноТ алелi полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 (р=2,1010-3), отже було встановлено зв'язок полiморфiзму з ЦД 2 типу [17].
Для з'ясування ролi алелiв у генотипi було проведено порiвняння домшантноТ та рецесивноТ моделей успадкування. Результати розрахунку розподту генотипiв полiморфiзму rs1799983 та генетичного ризику захворювання представлен у таблиц 2.
Розподiл генотипiв rs1799983 за домшантною моделлю успадкування (G/G проти G/Т+Т/Т) мав статистичну значущiсть за крт^ем х2 (х2=4,02; р=0,045), тодi як розподiл генотипiв за рецесивною
моделлю успадкування значущим не був (х2=3,23; р=0,072). Такий результат подтвердив наявнiсть асощацп з ЦД 2 типу саме за умов наявносп у генотип мшорного алелю Т (G/Т+Т/Т).
У цьому план необхiдно зазначити, що мета-аналiз 2015 року [18], до якого було залучено 19 повщомлень (8600 випадмв), також виявив зв'язок алелю Т полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 з ЦД 2 типу у домшантнм моделi (ВШ=1,14; 95% В1 1,031,26): алелi Т проти алелю G (ВШ=1,18; 95% В1 1,091,27) i генотипу TT проти генотипу GG (ВШ=1,33; 95% В1 1,09-1,62), що цтком узгоджувалося з нашими даними.
Осктьки за наявнiстю ускладнень згiдно до кнуючого положення [15], хворих було подтено на три групи, надалi було зроблено спробу з'ясування впливу розподту генотитв та алелiв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на груповий розподт хворих. Аналiз цих даних показав, що для розподтення хворих на групи розподт i генотитв, i алелiв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 значення не мав (вщповщно, р=0,614 i р=0,338). Отже це вказувало i на вщсутнкть значущоТ рiзницi мiж Ух розподiлом у групах хворих.
Також було визначено, чи мають вивчеш генотипи i алелi значення для ступеня компенсацп вуглеводного обмшу, оцiненого за рiвнем гткемп та HbA1C. Розподiл генотипiв та алелiв в залежностi вiд рiвня гткемП- у хворих на ЦД 2 типу не вiдрiзнявся (вiдповiдно, р=0,447 i р=0,376). На вiдмiну вщ цього, статистичну значущiсть мала його залежысть вiд рiвня HbA1C (вщповщно, р=0,015 i р=0,040; табл. 3).
Таблиця 3
Вплив генотишв та aneniB на розподш хворих за ступенями компенсацм вуглеводного обмшу
в залежност вiд рiвня HbA1c, n (f)
Генотипи Ступшь компенсацм X2 р
1, n=24 2, n=33 3, n=95
G/G 8 (0,333) 9 (0,273) 34 (0,358) 12,25 0,015
G/T 14 (0,584) 10 (0,303) 44 (0,463)
T/T 2 (0,083) 14 (0,424) 17 (0,179)
Алелi n=48 n=66 n=190 6,43 0,040
G 30 (0,625) 28 (0,424) 112 (0,589)
T 18 (0,375) 38 (0,576) 78 (0,411)
Прим1тки: ступ'шь компенсац'й: 1 (компенсаця) - HbAiC <7%, 2 (субкомпенсаця) - HbAiC=7-9%, 3 (декомпенсаця) - HbA1c>9%; n - кЛьксть; f- частота;х2 - критерйх-квадрат за Pearsonу модиф'каци Yates;р - значущсть в'дм'нностей.
Звертала на себе увагу висока частота хворих з поганою компенсацкю ЦД 2 типу (2 та 3 ступен компенсаций за умов наявносп у них генотипу Т/Т та алелю Т. Отже, можна було зробити висновок, що наявнкть алелю Т сприяла поганш компенсацм ЦД 2 типу за ступенем глкування бтка ^вень ИЬД1С у кровО.
Наступним етапом дослщження було з'ясування впливу полiморфiзму гб1 799983 гена N053 на наявнкть дiабетичних ускладнень (табл. 4).
Вiрогiдний вплив генотипи мали ттьки на наявнiсть нефропатп за швидкктю клубочково' фтьтрацп (х2=10,15; р=0,006). На вiдмiну вщ цього, алелi мали бiльш широкий дiапазон впливiв: на наявнiсть нефропатп за швидкiстю клубочково' фiльтрацГ'' (х2=8,00; р=0,005) i за рiвнем мiкроальбумiнурп (х2=4,81; р=0,028), а також - на наявнкть артерiально''' гiпертензГ'' (х2=4,74; р=0,029).
У дослiдженнi [13] був доведений зв'язок полiморфiзму гб 1799983 гена N053 з розвитком дiабетично''' нефропатп. При цьому полiморфiзм гб1 799983 не впливав на активнкть N0 у судинах нирки при дiабетичнiй нефропатп, але алель Т був пов'язаний з пщвищенням окисного стресу у таких випадках [19]. На значущий зв'язок полiморфiзму гб1 799983 гена N053 з розвитком дiабетично'''
нефропатп вказувало також дослщження, що було проведене у ^вычному КитаТ (431 хворий на ЦД 2 типу з дiабетичною нефропаткю проти 420 хворих на ЦД 2 типу без неТ) [20]. Принципова можливкть патогенетичного впливу мшорних алелiв полiморфних локусiв ДНК була показана i у наших попереднiх дослщженнях: полiморфiзми rs759853 та rs9640883 гена AKR1B1 мали зв'язок з розвитком дiабетичноТ ретинопатП' у хворих на ЦД 2 типу [21].
Отже, можна було заключити, що полiморфiзм rs1799983 гена NOS3 мав зв'язок з розвитком дiабетично''' нефропатп, що могло бути пов'язане з штенсифкацкю окисного стресу та, як на наш погляд, - i зi зниженням функцп нирок, а також -рiвня NO, що продукуеться eNOS.
Для пiдтвердження такого припущення був проаналiзований вплив генотипiв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на клшко-лабораторы показники, що асоцiюються з функцкю нирок (табл. 5) та чинники ЕДФ (табл. 6).
Перевiрка за критеркм Kruskal-Wallis показала наявнiсть впливу генотитв на рiвень у кровi креатинiну (Н=8,74; р=0,013), швидкiсть клубочковоТ фтьтрацп (Н=8,28; р=0,016) i рiвень мiкроальбумiнурi''' (Н=8,32; р=0,016). Такi самi результати (критерiй Mann-Whitney) були отриман
Таблиця 4
Вплив генотишв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на наявнкть дiабетичниx ускладнень, n (f)
Генотипи
Показник Значення р
G/G, n=51 G/T, n=68 T/T, n=33 X
ш 10 (0,196) 16 (0,235) 7 (0,212)
Наявшсть ДР 0,27 0,874
так 41 (0,804) 52 (0,765) 26 (0,788)
ш 7 (0,137) 11 (0,162) 0 (0,00)
Наявнiсть ДСПН 5,83 0,054
так 44 (0,863) 57 (0,838) 33 (1,000)
Наявшсть ДН за ш 29 (0,569) 37 (0,544) 8 (0,242) 10,15 0,006
ШКФ так 22 (0,431) 31 (0,456) 25 (0,758)
ш 11 (0,216) 13 (0,191) 1 (0,030)
Наявшсть ДН за МАУ 5,64 0,059
так 40 (0,784) 55 (0,809) 32 (0,970)
ш 32 (0,628) 36 (0,529) 13 (0,394)
Наявшсть АГ 4,39 0,111
так 19 (0,372) 32 (0,471) 20 (0,606)
нi 40 (0,784) 54 (0,794) 26 (0,788)
Наявшсть ДМАНК 0,02 0,991
так 11 (0,216) 14 (0,206) 7 (0,212)
Прим1тки: ДР - д'шбетична ретинопатя; ДСПН - д'абетична сенсорна пол'нейропат'я; ДН - д'шбетична нефропатiя; ШКФ - швидюсть клубочково)' фтьтраци; МАУ - м'кроальбум'нур'я; АГ - артер'альна г'тертенз'я; ДМАНК - д'юбетична макроанг'юпат'я нжних юнц'!вок; n - юльюсть; f - частота пац'1ент'1в з в'дпов'дними генотипами;р - статистична значущстьрозб'жностей м'1жгрупами за критер'емх2 Pearson у модифкац'й Yates
i для алел1в: для креатиншу (U=9546; р=0,015), швидкосп клубочково!' фшьтрацП' (U=9252; р=0,005) i рiвня 1^кроальбумшурп (U=9533; р=0,015). При цьому piBHi креатиншу i 1^кроальбумшури були вищими за наявностi генотипу ризику Т/Т i мшорного алелю Т проти предкового генотипу G/G i протективного алелю G, а рiвень швидкосп клубочково!' фтьтраци - суттево нижчим. Це вказувало на патогенетичну роль мшорного алелю Т для показникв функцГГ нирок при ЦД 2 типу.
Вплив полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на чинники ЕДФ подано у таблиц 6.
Як i можна було очкувати, серед вах чинникв ЕДФ, вплив генотитв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 виявився у вщношены вмкту у кровi NO (Н=13,79; р=0,001) та, бтьшою мiрою, - eNOS (Н=71,77; р <0,001). З рештою чинникiв (ЕТ1, TNFa та ДК) впливу виявлено не було. При цьому, рiвень у кровi NO був вищим за наявностi протективного генотипу G/G проти генотипу ризику Т/Т. Аналопчы результати демонстрував i вплив алелiв (за крт^ем MannWhitney для NO: U=8630; р=2,910-4 i для eNOS: U=4732; р=2,210-18). Рiвень у кровi eNOS також був вищим за наявносл протективного генотипу
Таблиця 5
Вплив генотишв полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 на клЫко-лабораторш показники, що асоцiюються з функцкю нирок, Ме (Q1;Q3)
Показники Генотипи Н р
G/G,n=51 G/T, n=68 T/T, n=33
Дурез, л на добу 2,00 (1,80; 2,00) 2,00 (1,75; 2,15) 2,00 (1,70; 2,00) 2,53 0,282
ШКФ, мл/хв 91,70 (77,99; 107,81) 91,69 (71,81; 105,08) 74,96 (58,87; 88,74) 8,28 0,016
Сечовина, ммоль/л 6,40 (5,40; 7,50) 6,30 (5,15; 7,50) 7,00 (6,00; 8,90) 5,18 0,075
Креатинш, мкмоль/л 84,00 (73,00; 93,00) 80,00 (71,00; 92,00) 89,00 (80,00; 118,00) 8,74 0,013
Гпюкозурiя, г/л 6,30 (0,00; 18,00) 10,30 (0,40; 26,60) 5,10 (0,00; 18,45) 2,18 0,336
МАУ, мг на добу 65,41 (40,72; 100,30) 68,48 (35,02; 101,35) 90,00 (76,17; 119,20) 8,32 0,016
Прим1тки: ШКФ - швидюсть клубочково)' фтьтраци; МАУ - м'кроальбум'нур'я; Н - критерй Kruskal-Wallis; р -статистична значущсть розб'жностей
Таблиця 6
Вплив генотипу rs1799983 гена NOS3 на вмкт чиннимв ЕДФ, Ме (Q1; Q3)
Показники Генотипи Н р
G/G,n=51 G/T, n=68 T/T, n=33
ЕТ1, фмоль/мл 2,13 (1,94; 2,63) 2,29 (1,93; 2,57) 2,40 (2,13; 2,56) 2,28 0,319
NO, мкмоль/л 6,47 (5,97; 7,04) 6,36 (6,36; 5,78) 6,04 (5,65; 6,31) 13,79 0,001
eNOS, пг/мл 269,78 (250,31; 364,79) 210,19 (191,85; 253,71) 159,22 (151,91; 220,13) 71,77 <0,001
TNFa, пг/мл 103,23 (91,74; 124,34) 107,63 (81,43; 125,88) 93,36 (72,87; 114,74) 3,46 0,178
ДК, E/мл 5,41 (4,74; 5,65) 5,30 (4,39; 5,56) 5,19 (4,55; 5,65) 1,45 0,485
Прим1тки: ЕТ1 - ендотелн 1; NO - оксид азоту; eNOS - ендотел'шльна NO-синтаза; TNFa - фактор некрозу пухлин альфа;ДК - д'еновi кон'югати; H - критерй Kruskal-Wallis; р - статистична значущсть розб'жностей м'1ж групами.
G/G проти генотипу ризику Т/Т та алелi G проти швидкосп клубочково!' фтьтраци, що в свою чергу,
алелi Т. Отже, генотип ризику Т/Т та мшорна алель обфунтовувало зв'язок полiморфiзму rs 1799983
Т сприяли зменшенню рiвнiв у кровi i NO, i eNOS, що гена NOS3 з розвитком саме дiабетичноï' нефропати. у наших дослщженнях вщповщало накопиченню у кровi креатиншу, мiкроальбумiнурiï i зменшенню
ВИСНОВКИ
1. Доведено, що у хворих на ЦД 2 типу з украТнськоТ популяци розподш алелiв rs1799983 був пов'язаний з розвитком захворювання (х2=5,82; р=0,016). Наявнкть у генотип мiнорного алелю Т збтьшувала у 1,6 рази (ВШ=1,59; 95% В1 1,09-2,32) шанси розвитку ЦД 2 типу. Зв'язок iз захворюванням за домiнантною моделлю успадкування (G/G проти G/Т+Т/Т) показав, що патогенна дiя rs1799983 проявлялася за умов наявносп у генотип мшорного алелю Т (ВШ=1,92; 95% В1 0,94-3,93; р=0,045).
2. Наявнiсть алелю Т сприяла декомпенсацп ЦД 2 типу за ступенем глкування бтка (бтьший рiвень HbA1C), погiршенню функцп нирок (збтьшенню рiвня в кровi креатинiну, мiкроальбумiнурiТ та зменшенню клубочковоТ фтьтрацп), що могло бути пов'язаним з меншим рiвнем у кровi NO та eNOS. Саме це обумовлювало вплив алелю Т на наявнкть нефропатп за швидкктю клубочковоТ фтьтрацП' (Х2=8,00; р=0,005) i за рiвнем мiкроальбумiнурiТ (Х2=4,81; р=0,028) та обфунтовувало його вплив на наявнкть артерiальноТ ппертензп (х2=4,74; р=0,029).
Автори пов!домляють про в'дсутн'1сть конфлкту Штереав при написанн cmammi.
Л1ТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Pankiv VI. [Diabetes mellitus: diagnostic criteria, etiology and pathogenesis]. International Endocrinology Journal. 2013;8(56):53-64. [In Ukrainian].
2. Type 2 Diabetes Complications. Web-resource: www. endocrineweb.com/ conditions/type-2-diabetes.
3. Pi X, Xie L, Patterson C. Emerging Roles of Vascular Endothelium in Metabolic Homeostasis. Circ Res. 2018 Aug 3;123(4):477-494. doi: 10.1161/ CIRCRESAHA.118.313237.
4. Sinyachenko OV, Ziablitsev SV, Chernobryvtsev PA. [Endothelial dysfunction in glomerulonephritis]. Donetsk: New World; 2006. 152 p. [In Russian].
5. Carrizzo A, Izzo C, Oliveti M, et al. The Main Determinants of Diabetes Mellitus Vascular Complications: Endothelial Dysfunction and Platelet Hyperaggregation. Int J Mol Sci. 2018 Sep 28;19(10):2968. pii: E2968. doi: 10.3390/ ijms19102968.
6. Babik B, Petak F, Agocs S, Blaskovics I, Alacs E, Bodo K, Südy R. [Diabetes mellitus: endothelial dysfunction and changes in hemostasis]. Orv Hetil. 2018 Aug;159(33):1335-1345. doi:
10.1556/650.2018.31130. [In Hungarian].
7. Polovina MM, Potpara TS. Endothelial dysfunction in metabolic and vascular disorders. Postgrad Med. 2014 Mar; 126(2):38-53. doi: 10.3810/ pgm.2014.03.2739.
8. Bermejo-Martin JF, Martin-Fernandez M, Lopez-Mestanza C, Duque P, Almansa R. Shared Features of Endothelial Dysfunction between Sepsis and Its Preceding Risk Factors (Aging and Chronic Disease). J Clin Med. 2018 Oct 30;7(11). pii: E400. doi: 10.3390/ jcm7110400.
9. Rani J, Mittal I, Pramanik A, et al. T2DiACoD: a gene atlas of type 2 diabetes mellitus associated complex disorders. Sci Rep. 2017 Jul 31; 7(1):6892. doi: 10.1038/s41598-017-07238-0
10.Campedelli FL, E Silva KSF, Rodrigues DA, Martins JVM, Costa IR, Lagares MH, Barbosa AM, de Morais MP, Moura KKVO. Polymorphism of the gene eNOS G894T (Glu298Asp) in symptomatic patients with atherosclerosis. Genet Mol Res. 2017 May 4; 16(2). doi: 10.4238/gmr16029550
11.Atay AE, Akbas H, Tumer C, Sakar MN, Esen B, Incebiyik A, Simsek S, Sit D. The association of endothelial nitric oxide synthase gene G894T polymorphism and serum nitric oxide concentration with microalbuminuria in patients with gestational diabetes. Clin Nephrol. 2014 Feb; 81(2):105-11.
12.SadatiSM, Radfar M, Hamidi AK, AbdollahiM, Qorbani M, Esfahani EN, Amoli MM. Association between the polymorphism of Glu298Asp in Exon 7 of the eNOS gene with foot ulcer and oxidative stress in adult patients with type 2 diabetes. Can J Diabetes. 2018 Feb; 42(1):18-22. doi: 10.1016/j.jcjd.2017.03.001
13.Tabatabaei-Malazy O, Khodaeian M, Bitarafan F, Larijani B, Amoli MM. Polymorphisms of Antioxidant Genes as a Target for Diabetes Management. Int J Mol Cell Med. 2017 Summer; 6(3):135-147. doi: [10.22088/acadpub.BUMS.6.3.135]
14.IDF Diabetes Atlas Eighth Edition, 2017: 149. http:// www.diabetesatlas.org/
15.Order of the Ministry of Health of Ukraine; dated December 21, 2012, No. 1118 "On Approval and Implementation of Medical-Technological Documents for the Standardization of Medical Aid in Type 2 Diabetes". Unified clinical protocol for primary and secondary (specialized) medical aid "Diabetes type 2". 2012. Kyiv.
16.El-Lebedy D. Interaction between endothelial nitric oxide synthase rs1799983, cholesteryl ester-transfer protein rs708272 and angiopoietin-like protein 8
rs2278426 gene variants highly elevates the risk of type 2 diabetes mellitus and cardiovascular disease. Cardiovasc Diabetol. 2018 Jul 4; 17(1):97. doi: 10.1186/s12933-018-0742-8
17.Li JY, Tao F, Wu XX, Tan YZ, He L, Lu H. Polymorphic variations in manganese superoxide dismutase (MnSOD) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) genes contribute to the development of type 2 diabetes mellitus in the Chinese Han population. Genet Mol Res. 2015 Oct 21; 14(4):12993-3002. doi: 10.4238/2015.October.21.20.
18.Jia Z,ZhangX,KangS, Wu Y. Association of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus: a meta-analysis. Endocr J. 2013; 60(7):893-901. Epub 2013 Apr 7.
19.Toda N, Imamura T, Okamura T. Alteration of nitric oxide-mediated blood flow regulation in diabetes mellitus. Pharmacol Ther. 2010 Sep; 127(3):189-209.
20.Huo P, Zhang D, Guan X, Mei Y, Zheng H, Feng X. Association between genetic polymorphisms of ACE & eNOS and diabetic nephropathy. Mol Biol Rep. 2015 Jan; 42(1):27-33. doi: 10.1007/s11033-014-3736-y
21. Mogilevskyy Slu, Bushuieva OV, Ziablitsev SV, Natrus LV. Relationship of the AKR1B1 rs759853 and rs9640883 with the development of diabetic retinopathy. Journal of Ophthalmology (Ukraine). 2017; 2:3-7. https://doi.org/10.31288/oftalmolzh2017237
РЕЗЮМЕ
Зв'язок полiморфiзму rs1799983 гена NOS3 з цукровим дiабетом 2 типу та розвитком його ускладнень
С.В. Зяблцев, О.П. Чернобривцев, Д.С. Зяблцев, С.О.Тарасенко
Судинн ускладнення цукрового дебету (ЦД) можуть визначатися розвитком ендотелТальноТ дисфункцп (ЕДФ), розвиток яко', в свою чергу, може залежати вщ полморфвму гент, що регулюють стан ендотел^.
Мета: проведення аналву результат^ визначення асо^а^' пол1морфвму rs1799983 гена NOS3 з ЦД 2 типу, розвитком ускладнень, клшко-лабораторними показниками, що характеризують тяжккть переб^у захворювання та розвиток ЕДФ.
Матерiал та методи. До дослщження залучено дан 152 хворих з ЦД 2 типу, вком вщ 34 до 80 рокв (53,9±8,4 року). До контрольно''' групи було залучено 95 практично здорових оаб. За результатами клЫко-лабораторних обстежень визначали
наявнкть ретинопатП', нефропатП' за ртнями мкроальбумжурп та швидкосп клубочково' фтьтрацп, сенсорно''' полiнейропатi''', ангюпати нижых кшцток та артерiально''' ппертензп. ПолГморФГзм rs1799983 визначали методом пол^еразно' ланцюгово' реакцП' у реальному часi (амплiфiкатор Gene Amp® PCR System 7500 Applied Biosystems, США) за допомогою тест-систем TaqMan Mutation Detection Assays Life-Technology (США). Для статистично' обробки отриманих даних використовували програму Statistica 10 (StatSoft, Inc., США).
Результати та Тх обговорення. У хворих на ЦД 2 типу з укра'нсько''' популяцп розподт алелiв rs1799983 був пов'язаний з розвитком захворювання (х2=5,82; р=0,016). Алель Т збiльшував у 1,6 рази (ВШ=1,59; 95% В1 1,09-2,32) шанси розвитку ЦД 2 типу; в1рогщною була домiнантна модель успадкування (G/G проти G/T+Т/Т): ВШ=1,92; 95% В1 0,94-3,93 (р=0,045). Алель Т сприяв бтьшому рГвню HbA1С, збтьшенню рГвня в кровГ креатинiну, мкроальбумжурп та зменшенню клубочково''' фiльтрацi''', що могло бути пов'язаним з меншим ртнем у кровГ оксиду азоту (NO) та eNOS. Це, на наш погляд, обумовлювало вплив алелю Т на наявнкть нефропатП' за швидкктю клубочково''' фтьтраци' (х2=8,00; р=0,005) i за рiвнем мiкроальбумiнурi''' (х2=4,81; р=0,028) та обГрунтовувало його вплив на наявнкть артервльно' гiпертензi''' (х2=4,74; р=0,029).
Висновок. ПолГморфГзм rs 1799983 гена NOS3, який призводить до зниження активносп eNOS, мае вщношення до розвитку нефропатП' та артер^льно''' ппертензп у хворих на ЦД 2 типу з укра'нсько''' популяци.
Ключовi слова: цукровий д^бет 2 типу, нефропатiя, артерiальна ппертензт, полГморфГзм rs1799983 гена NOS3
SUMMARY
The relationship of the polymorphism rs1799983 NOS3 gene with type 2 diabetes mellitus and the development of its complications Ziablitsev SV, Chernobryvtsev OP, Ziablitsev DS, Tarasenko SO
The vascular complications of diabetes mellitus (DM) may be determined by the development of endothelial dysfunction (EDF), the development of which, in turn, may depend on the polymorphism of the genes regulating the state of the endothelium.
Aim: to analyze the results of the determination of
association of polymorphism rs1799983 of the NOS3 gene with DM 2 type, development of complications, clinical and laboratory parameters characterizing the severity of the course of the disease and the development of EDF.
Material and methods. The study involved 152 patients with DM 2 type, aged 34-80 years (53.9±8.4 years). The control group involved 95 healthy persons. The results of clinical and laboratory tests determined the presence of retinopathy, nephropathy by levels of microalbuminuria and glomerular filtration rate, sensory polyneuropathy, angiopathy of the lower extremities, and arterial hypertension. Polymorphism rs1799983 was determined by real-time polymerase chain reaction (Gene Amp® PCR System 7500 Applied Biosystems, USA) using TaqMan Mutation Detection Assays Life-Technology (USA) test systems. Statistica 10 (StatSoft, Inc., USA) was used to statistically process the data obtained.
Results and discussion. In patients with DM 2 type in the Ukrainian population, the distribution of alleles T rs1799983 was associated with the development of the
disease (x2=5.82; p=0.016). AlleleT increased by 1.6 times (OR=1.59; 95% CI 1.09-2.32) chances of development of DM 2 type; the dominant model of inheritance (G/G versus G/T+T/T) was probable: OR=1.92; 95% CI 0.94-3.93 (p=0.045). Allele T contributed to a higher level of HbA1C, increased levels of creatinine, microalbuminuria, and reduced glomerular filtration, which could be associated with lower levels of nitric oxide (NO) and eNOS. This, in our opinion, determined the effect of allele T on the presence of nephropathy at the rate of glomerular filtration (x2=8.00; p=0.005) and the level of microalbuminuria (x2=4.81; p=0.028) and justified its effect on the presence of arterial hypertension (x2=4.74; p=0.029).
Conclusion. Polymorphism rs1799983 of the NOS3 gene, which leads to a decrease in the eNOS activity, is relevant to the development of nephropathy and arterial hypertension in patients with DM 2 type in the Ukrainian population.
Key words: Diabetes mellitus 2 type, nephropathy, arterial hypertension, polymorphism rs1799983 of the NOS3 gene.
flama HadxodweHHa do pedaKuiï 19.10.2018 p.
