CC BY
31
HayKOBMM BiCHUK AbBiBCbKoro Ha^OHa^bHoro ymBepcuTeTy
BeTepuHapHOi меgмцмнм Ta öioTexHO^orin iMem C.3. Ixu^Koro.
Cepm: XapnoBi TexHO^orii
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Food Technologies
ISSN 2519-268X print
https://nvlvet.com.ua/index.php/food doi: 10.32718/nvlvet-f9203
UDC 637.344.8
Technology of low allergenic milk with whey proteins hydrolysate
V.G. Yukalo, K.Ye. Datsyshyn
Ternopil Ivan Pul'uj National Technical University, Ternopil, Ukraine
Article info
Received 04.09.2019 Received in revisedform
03.10.2019 Accepted 04.10.2019
Ternopil Ivan Pul'uj National Technical University, Ruska Str., 56, Ternopil, 46001, Ukraine. Tel.: +38-067-358-80-00 E-mail: biotech@tu.edu.te.ua
Yukalo, V. G., & Datsyshyn, K. Ye. (2019). Technology of low allergenic milk with whey proteins hydrolysate. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Food Technologies, 21(92), 14-18. doi: 10.32718/nvlvet-f9203
In recent years, there has been a steady increase in the number of various allergic diseases in children and adults. Clinical manifestations of allergic reactions can be observed almost from infancy, which is often associated with nutrition specificity. It is proved that one of the strongest milk allergens are the main whey fractions ft-lactoglobulin and a-lactalbumin. One way to reduce allergies is to remove or completely replace whey proteins. Another way to reduce allergenicity is to use whey protein hydrolysates. In most cases, hydrolysates are obtained using cheap active proteolytic preparations. They usually have wide specificity, and the hydrolysates formed by them include short peptides with low allergenicity. Numerous biologically active peptides which have a positive effect on the organism are either lost or the possibility of their formation is reduced in such cases. A valuable source of such biologically active peptides is whey protein-precursors. Therefore, the purpose of the research is to develop a technology of low-allergenic milk with the preservation of natural biologically active peptides from whey proteins. The concentrate of natural casein was obtained in the result of the «milk-pectin-water» system dividing for creating a low-allergenic product. The fractional composition of the casein complex and milk whey proteins was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. Whey protein concentrate was used as the substrate to obtain the hydrolysate. Proteolysis was performed with pancreatin at 37 °C and pH 7.9. The composition of the obtained hydrolysate was analyzed by gel filtration on Sephadex G-25. The peptides and polypeptides composition of hydrolysate was characterizated with the help of express electrophoresis. The technology of the proposed dairy product includes addition to a liquid concentrate of natural casein the whey protein hydrolysate obtained in physiological conditions. The results of electrophoretic and chromatographic researches indicate about the absence of main proteins allergens from milk whey in the product. This allows recommending it for the nutrition of people allergic to whey proteins.
Key words: whey proteins, milk whey proteins hydrolysate, concentrate of micellar casein, proteolysis, low allergenic product.
Технолопя низькоалергенного молока з гiдролiзатом бшшв сироватки
В.Г. Юкало, К.С. Дацишин
Тернотльський нацюнальний техтчний утверситет iменi 1вана Пулюя, м. Тернотль, Украта
В останн роки спостер^асться невпинне зростання кiлькостi рiзноманiтних алергiчних захворювань у дтей i дорослих. Кл> тчт прояви алергiчних реакцш можуть спостерiгатися практично з грудного вщо пов'язано найчастше з особливостями харчування. Доведено, що одними з найсильнших алергетв молока с основн фракцИ сироватки ¡З-лактоглобулт та а-лактальбумт. Одним iз шляхiв зниження алергИ с видалення або повна замта бшюв сироватки молока. 1ншим шляхом зниження алергенностi с використання гiдролiзатiв сироваткових бшюв. В бiльшостi випадюв гiдролiзати отримують з використанням дешевих активних протеолтичних препаратiв. Вони зазвичай володтть широкою специфiчнiстю, а утворен за Их допомогою гiдролiзати включають коротю пептиди iз низькою алергентстю. В таких випадках або повтстю втрачасться, або знижусться iмовiрнiсть утворення численних бiологiчно активних пептидiв, як позитивно впливають на оргатзм. Цтним джерелом таких бiологiчно активних пептидiв с бшки-попередники з сироватки молока. Тому метою роботи с розробка технологи низькоалергенного молока зi збереженням природтх бiологiчно активних пептидiв iз бшюв сироватки. Для створення низькоалергенного продукту нами було отримано концентрат нативного казету врезультатiрозшарування системи "молоко—пектин-вода". Фракцшний
склад бттв казегнового комплексу та сироватки молока аналЬзували електрофорезом в пол1акрилам1дному гел1. Як субстрат для отримання г1дрол1зату використовували концентрат сироваткових бтюв. Протеолгз проводили панкреатином при температур1 37°С та рН 7,9. Склад отриманого г1дрол1зату анал1зували гель-фтьтращею на сефадекЫ 0-25. За допомогою експрес-електрофорезу була проведена оцтка г1дрол1зату за складом пептид1в та полтептид1в. В технологи запропонованого нами молочного продукту, передбачаеться внесення г1дрол1зату бттв сироватки молока, що отриманий у ф1зюлог1чних умовах, до р1дкого концентрату нативного казегну. Отримат електрофоретичт та хроматографгчт досл1дження св1дчать про в1дсуттсть в отриманому продукт1 основних бглкгв-алергенгв з сироватки молока. Це дозволяе рекомендувати його для харчування людей з алерг1ею на бтки сироватки.
Ключовi слова: протегни сироватки молока, г1дрол1зат бтмв сироватки молока, концентрат нативного казегну, протеол1з, низькоалергенний продукт.
Вступ
За даними епщемюлопчних дослщжень вгд 0,6% до 3% дггей до 6 рошв, 0,3% старших дггей та шдлгг-к1в i 0,5% дорослих страждають алерпею на коров'яче молоко. Бшьшють дггей, що страждають алерпею на молоко переростають ïï, стаючи здатними споживати молоко та молочш продукти, хоча 15% хворих зали-шаються алерпчними протягом усього дорослого життя (Kim et al., 2018). Доведено, що одними з най-сильшших алергешв молока е основш фракци сироватки р-лактоглобулш (P-LG) та а-лактальбумш (a-LA). Значно ргдше в лгтератург описано алерпю на гншг бшки молочно1 сироватки, так як гмуноглобулгн (IG), альбумш сироватки (BSA) або лактоферин (LF) (Villa et al., 2018). Одним 3i шляхгв зниження алергп е вида-лення або повна замша бглкгв сироватки молока. У цьому випадку використовують гншг харчовг неалер-геннг бшки. Ще одним способом зниження алергенно-стг е використання пдролгзалв сироваткових бшшв. Проте аналгз лгтератури показуе, що в бшьшосп ви-падшв так ггдролгзати отримували з використанням дешевих активних протеолгтичних препаратгв, для яких характерна широка специфгчнгсть дп (Khramtsov, 2011). Утворенг за 1хньою допомогою ггдролгзати включають коротк пептиди гз низькою алергеншстю.
В останнг десятилитя показано, що бшки сироватки молока P-LG, a-LA та в меншгй мгрг гншг фракци е попередниками численних бюлопчно активних пеп-тидгв. З ргзних бшшв сироватки молока можуть утво-рюватись антигшертензивш пептиди, антагошсти отатних рецепторгв, регулятори моторики кишшвни-ка, гмуномодуляторнг та антимгкробнг пептиди. Також ввдкрип новг види бюактивних пептидгв, Hid виявля-ють антиканцерогенну та антиоксидантну даю, зни-жують ргвень холестеролу в кровг, регулюють апетит, впливають на засвоенная кальцгю (Iukalo et al., 2013). Майже всг природнг бюактивш пептид из бглкгв сироватки молока були отриманг за дiï травних протеаз у фгзюлопчних умовах (Fox et al., 2015). При викорис-танш активних протеолтгачних препарата з широкою специфгчшстю переважно мжробюлопчного похо-дження Тмовгршсть утворення природшх БАП в отри-маних низькоалергенних пдролгзатах сироваткових бшшв низька. Це загалом знижуе бюлопчну цшшсть концевого продукту. Тому з метою збереження природшх БАП перспективним може бути низькоалерген-ний молочний продукт, отриманий комбшащею нативного казешу з пдролгзатом сироваткових бшшв. При цьому пдролгзат повинен бути отриманим за дiï травних протеаз у фгзюлопчних умовах. Важливим при
створенш такого молочного продукту е те, що пдро-лiзати бiлкiв сироватки на ввдмшу вiд казе1нових, не мають вираженого гiркого присмаку. У такому про-дуктi будуть наявнi казешовi попередники БАП та природнi БАП з проте1шв сироватки молока i вшсутш основнi алергени з сироватки молока.
Мета. Розробка технологи низькоалергенного молока зi збереженням природнiх бюлопчно активних пептидiв iз бiлкiв сироватки.
MaTepia™ i методи досл1джень
В робот використовували св1же знежирене молоко кислотшстю 18-19 оТ. Для проведения протеолiзу був взятий ферментний препарат панкреатин виробництва ПрАТ "Технолог" (Украша). Як субстрат для отримання гiдролiзату було використано концентрат сироваткових бшшв (КСБ), вироблений на ТОВ "Буча-цький сирзавод" (Укра1на) згiдно з проектом ТУ У 15.5-00419880-ХХХ:2011 "Концентрат сироваткових бшшв (КСБ-УФ). Техшчш умови". Концентрат нативного казешу (КНК) отримували вiдповiдно до ТУ 49 1169-85. При цьому було використано цитрусо-вий пектин, що вщповщае ДСТУ 6088: 2009. Загаль-ний казе1н видiляли зi свiжого знежиреного молока шляхом подвшного переосадження при рН 4,6. Видшення казе1ну супроводжувалось iнактивацiею природних протеаз шляхом екстракци в оцтовiй кис-лотi при рН 4,0. Сироватку молока видiляли пiсля iзоелектричного осадження казе1шв. Казе1ни вщдшя-ли центрифугуванням. Отриману сироватку вшцен-трифуговували двiчi на центрифузi ОПН-8 (5000 об/хв, 15 хв). Концентрадаю казе1шв та проте1шв си-роватки молока визначали спектрофотометрично за поглинанням при довжиш хвилi X = 280 нм. При цьому використовували коефщенти поглинання (DlM): 12,3 - для &лшв сироватки молока; 8,2 - для
загального казешу. Фракцшний склад бiлкiв казе1но-вого комплексу та сироватки молока аналiзували електрофорезом в полiакриламiдному гелi (ПАГ). Для анатзу бiлкiв сироватки використовували аналггич-ний диск-електрофорез в нативних умовах в трубочках полiакриламiдного гелю (Yukalo et al., 2018). Диск-електрофорез проводили в апарап фiрми "Reanal" (Угорщина). Для аиалiзу гiдролiзатiв концентрату КСБ використовували розроблений нами метод експрес-електрофорезу на пластинках однорiдного ПАГ. Експрес-електрофорез проводили на апаратi типу Стадiера (Yukalo et al., 2019). Аналiз складу бiлкiв казе1нового комплексу проводили в вертикаль-них пластинках однорщного ПАГ за наявностi сечо-
вини (Yukalo et al., 2018). Електpoфopегpaми фшсува-ли в 7% oцтoвiй RHMori i зaбapвлювaли 0,5% aмiдo чopний 10 B. Електpoфopетичнi гелi та бyфеpи готу-вали з викopистaнням pеaктивiв фipми "Reanal" (Угopщинa). Гель-фiльтpaцiю пpoдyктiв пpoтеoлiзy сиpoвaткoвиx бiлкiв пpoвoдили на кoлoнцi з нaбopy для piдиннoï xpoмaтoгpaфiï фipми "Reanal" (Угopщи-на). Пpи цьoмy був викopистaний сефадекс G-25 фip-ми "Pharmacia" (Швещя). В гoтoвoмy пpoдyктi визна-чали opгaнoлептичнi пoкaзники: зoвнiшнiй вигляд та ^нототен^ю, смак, зaпax i кoлip.
Результати та ïx обговорення
Для ствopення низькoaлеpгеннoгo пpoдyктy нами бyлo oтpимaнo КИК в pезyльтaтi poзшapyвaння сис-теми "мoлoкo-пектин-вoдa". Для oцiнки пpoцесy видiлення КИК нами були вiдiбpaнi пpoби з веpxньoï пoлiсaxapиднoï фази i нижньoï бiлкoвoï фази пiсля poзшapyвaння системи. Результати aнaлiзy фpaкцiй-ного складу бшшв обох фаз показаш на рис. 1.
Рис. 1. Електpoфopегpaми, oтpимaнi в pезyльтaтi aнaлiтичнoгo диск-електpoфopезy бшшв пoлiсaxapи-днoï фази (1) та бшшв зaгaльнoгo казешу (2). Елект-poфopегpaми, oтpимaнi в pезyльтaтi oднopiднoгo еле-ктpoфopезy за нaявнoстi сечoвини зaгaльнoгo казешу (3) та ^н^и^ату нaтивнoгo казешу (4)
Оскшьки бшки кaзеïнoвoгo кoмплексy i бiлки си-poвaтки мoлoкa сyттeвo вiдpiзняються свoïми фiзикo-xiмiчними влaстивoстями, нами бyлo викopистaнo двi електpoфopетичнi системи для ïx aнaлiзy (McSweeney & Fox, 2013). Бшки казешу ефективнo poздiляються в oднopiднoмy ПАГ за наявгосп сечoвини. Bсi oснoвнi фpaкцiï сиpoвaтки мoлoкa виявляються пpи застосу-вант диск-електpoфopезy в нaтивниx yмoвax для нейтpaльниx i кислиx бiлкiв. ^и кoмбiнaцiï циx ме-тoдiв ми oтpимaли oб'eктивний aнaлiз poзпoдiлy бш-кoвиx фpaкцiй мoлoкa y пoлiсaxapиднiй i бiлкoвiй фaзi пiсля poзшapyвaння системи "мoлoкo-пектин-вoдa". Результати електpoфopезy св^ать, щo в пoлiсaxapи-дну фазу пеpеxoдять всi oснoвнi aлеpгени сиpoвaтки мoлoкa (ß-LG, a-LA, IG, BSA, LF), а та^ж нoва неь дентифiкoвaнa бiлкoвa фpaкцiя з низьшю електpoфo-pетичнoю pyxливiстю. Пopiвняння ïï з електpoфopе-гpaмoю зaгaльнoгo казешу, oтpимaнo. диск-електpoфopезoм (pис. 1(2), свщчить, щo це мoже бути казет'шва фpaкцiя ß-CN-5P. Biдoмo, m,o ця кaзеïнoвa
фpaкцiя мoже виxoдити iз складу мiцел пpи низькиx темпеpaтypax (Fox et al., 2015). Анaлiз складу бiлкoвoï фази фис. 1(3) свiдчить пpo нaявнiсть в нш всix фpaк-цiй бшшв кaзеïнoвoгo кoмплексy, сеpед якиx e oснoвнi пoпеpедники БАП кaзеïнoвoгo пoxoдження (pис. 1(4). Алеpгенiв з сиpoвaтки мoлoкa в бiлкoвiй фaзi не вияв-ленo.
Для oтpимaння гiдpoлiзaтy бyлo викopистaнo 15% poзчин КСТ. Гiдpoлiз КCБ пpoвoдили в фiзioлoгiчниx yмoвax (37 °C, pИ 7,9) пaнкpеaтинoм пpи стввшш-шеннi ензим: сyбстpaт 1:20. Ефективнiсть тaкoгo ств-вiднoшення дoведенa paнiше (Dekusha, 2009). ^лад oтpимaнoгo гiдpoлiзaтy aнaлiзyвaли гель-фiльтpaцieю на сефaдексi G-25. У вiдiбpaниx для гель-фiльтpaцiï взipцяx гiдpoлiзaтy oсaджyвaли неpoзщепленi бiлки 5% тpиxлopoцтoвoю кислoтoю. Результати гель-фiльтpaцiï пoкaзaнi на pro. 2. Иа xpoмaтoгpaмi видш типoвий мoлекyляpнo-мaсoвий poзпoдiл пpoдyктiв пpoтеoлiзy КCБ пaнкpеaтинoм.
Близькo 85% пpoдyктiв пpoтеoлiзy мають мoлекy-ляpнy масу менше нiж 5000 Да, в тому чи^ близькo 40% - менше тж 1000 Да. Ташж для xapaктеpистики гiдpoлiзaтy були взяп пpoби для електpoфopетичнoгo експpес-aнaлiзy. Такий aнaлiз дoзвoляe oцiнити склад пpoтеïнiв i пoлiпептидiв. Результати aнaлiзy шказат на pис. 3. Иа електpoфopегpaмi КИК (pис. 3(1) виднo oснoвнi бiлки-aлеpгени з сиpoвaтки мoлoкa. У взipцi гiдpoлiзaтy, взятoгo без oсaдження бiлкiв тpиxлopoц-тoвoю кислoтoю, opa^^ro вiдсyтнi висoкoмoлекy-ляpнi бiлки i шлшептиди. Иа електpoфopегpaмi мoж-на noMÍTHTH лише ïxm сл1ди.
0.5 -,
S
3
о оо гм W
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
О
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Фракцм
Рис. 2. Хpoмaтoгpaмa пaнкpеaтинoвoгo гiдpoлiзaтy кoнцентpaтy сиpoвaткoвиx бiлкiв, oтpимaнa гель-фшьтрашею на сефадекш G-25 1 2
*{
BSA a-LA
ß-LG
Рис. 3. Електpoфopегpами, oтpимaнi в pезyльтaтi екс-пpес-електpoфopезy сиpoвaтки мoлoкa (1) та пaнкpеa-тинoвoгo гiдpoлiзaтy КCБ
Низькомолекулярш продукты протеол1зу не ф1к-суються в пол1акрилам1дному гел1. Таким чином у другому компонент! (пдрол1зат КНК), що використо-вуеться для створення продукту, ввдсутт б1лки алер-гени з сироватки молока.
Технолопя виготовлення низькоалергенного продукту з пдрол1затом б1лк1в сироватки молока вклю-чае:
- отримання концентрату нативного казешу за ТУ;
- отримання пдрол1зату сироваткових б1лк1в;
- змшування i пастеризашя сушш!
Основш етапи технологи виробництва низькоалергенного продукту показаш на рис. 4. При його вироб-ництвi важливим е чггке дотримання технiчних умов виготовлення КНК, осшльки зниження рН його роз-чину може призводити до появи осаду.
Отримане низькоалергенне молоко з гiдролiзатом бiлкiв сироватки характеризували за органолептичними показниками. Результати дегустацшно! оцшки показанi у таблицi 1.
Таблиця 1
Органолептичш показники низькоалергенного молока з гiдролiзатом бiлкiв сироватки
Найменування показника
Характеристика
Зовнiшнiй вигляд i консистенцш
Смак i запах
Ктр_
Однорiдна рiдина, без осаду.
Характерний присмак пастеризацп та незначний альбумiнний присмак, що залежить вiд кiлькостi внесеного гiдролiзату
К^р бiлий з жовтуватим вiдтiнком.
Показники зовшшнього вигляду, консистенцп, смаку е характерними для молочних продукпв дано! групи. Наведенi у таблицi 1 характеристики сввдчать про те, що використання гiдролiзату бiлкiв сироватки суттево не змiнюе органолептичнi показники, зокрема смак та запах.
Концентрат сироваткових бшК1в
■
Приготування 15% розчину КСБ
Ферментативний пдрошз панкреатином т=120 хв; t=37-38°C; рН=7,9
Охолодження до t=4°C
J L
Молоко знежирене
_i_
Пдрол1зат шлкш сироватки молока
Приготування системи «знежирене молоко-пектин»
Осадження KHK, т=3±2 год; t=4°C
_L
Вщдшення сироватки
Розчинення KHK
I
Додавання гщрсгшзату бшюв сироватки молока
X
Перемшування
т
Пастеризац1я т=15-20 с; t=72±2°C
X
Охолодження до t=6±2 С
X
Фасування
Збер1гання готового продукту t=0-4° С, тривалють не бшыпе 72 год
Пектин
Приготування водного розчину пектину
Перемшування. т=10-15 хв.
Рис. 4. Технолопчна схема виготовлення низькоалергенного молока з гiдролiзатом бiлкiв сироватки
Отримаш електрофоретичш та хроматографiчнi дослвдження сввдчать про ввдсутшсть основних бiлкiв алергенiв з сироватки молока. Це дозволяе рекомен-дувати продукт для харчування людей з алерпею на бiлки сироватки молока.
Висновки
1. Розроблено технолопю низькоалергенного молока з пдротзатом бiлкiв сироватки.
2. Заданi умови отримання гiдролiзату забезпе-чують утворення природних бiологiчно активних пептидiв з бшшв сироватки молока. Встановлено, що в отриманому гiдролiзатi вiдсутнi бiлки алергени сироватки молока.
В подальшому необхвдно детальшше охарактери-зувати склад пептидiв, щентиф^вати окремi пептиди та провести оптимiзацiю максимального виходу бiологiчно активних пептидiв пiд час отримання пд-ролiзату сироваткових бiлкiв.
References
Dekusha, H.V. (2009). Rozrobka tekhnolohii sukhykh sumishei z hidrolizovanym bilkom dlia dytiachoho kharchuvannia. dys....kand. tekhn. nauk: 05.18.16, Odesa (in Ukrainian). Fox, P., Uniacke-Lowe, T., McSweeney, P., & O'Mahony, J. (2015). Dairy Chemistry and Biochemistry. New York: Springer, 584. doi: 10.1007/978-3-319-14892-2.
Iukalo, A.V., Datsyshyn, K.Ye., & Yukalo, V.G. (2013). Bioaktyvni peptydy proteiniv syrovatky moloka koriv (Bos taurus). Biotekhnolohiia Akta, 6, 49-61. doi: 10.15407/biotech6.05.049 (in Ukrainian).
Khramtsov, A.G. (2011). Fenomen molochnoy syvorotki. SPb.: Professiya (in Russian).
Kim, H., Ahn, S.-I., Jhoo, Jin-Woo, & Kim Gur-Yoo (2018). Comparison of Allergic Parameters between Whey Protein Concentrate and Its Hydrolysate in Rat Basophilic Leukemia (RBL)-2H3 Cells. Korean J. Food Sci. An, 38(4), 780-793. doi: 10.5851/kosfa.2018.e16.
McSweeney, P.L.H., & Fox, P.F. (2013). Advanced Dairy Chemistry: Volume 1A: Proteins: Basic Aspects, 4th Edition. New York: Springer Science+Business Media. doi: 10.1007/978-1-4614-4714-6.
Villa, C., Costa, J., Oliveira, M.B.P.P., & Mafra I. (2018). Bovine Milk Allergens: A Comprehensive Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 17(1), 137-164. doi: 10.1111/1541-4337.12318.
Yukalo, V., Datsyshyn, K., & Storozh, L. (2019). Electrophoretic system for express analysis of whey protein fractions. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies, 2(11(98)), 37-44. doi: 10.15587/1729-4061.2019.160186.
Yukalo, V.G., Storozh, L.A., Datsyshyn, K.Ye., & Krupa, O.M. (2018), Electrophoretic systems for the preparative fractionation of proteins-precursors of bioactive peptides from cow milk. Food science and technology, 12(2), 26-32. doi: 10.15673/fst.v12i2.932.
