CC BY
185
УДК 616-056.7-076:577.21
ТЕХНОЛОГИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВЫХ БИОЧИПОВ
© 2012 г. В.Б. Бородулин1, О.В. Шевченко1, И.А. Горошинская2, А.А. Свистунов3, Н.В. Железинская4, А.В. Саратцев3, Е.Н. Бычков1, Ю.Б. Барыльник1, Е.В. Колесниченко1, Ю.С. Абросимова, Е.В. Бобылева1
1Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, meduniv@sgmu.ru
2Ростовский научно-исследовательский
онкологический институт, ул. 14 линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, rnioi@list.ru
3Первый Московский государственный медицинский университет, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, г. Москва, 119991, rectorat@mma.ru
4Главный клинический госпиталь МВД России, ул. Народного Ополчения, 35, г. Москва, 123063
1Saratov State Medical University, B.Kazachia St., 112, Saratov, 410012, meduniv@sgmu.ru
2Rostov Research Oncological Institute, 14-line, 63, Rostov-on-Don, 344037, rnioi@list.ru
3First Moscow State Medical University, Trubetskaya St., 8-2, Moscow, 119991, rectorat@mma.ru
4Main Clinical Hospital of Russian Interior Ministry, Narodnogo Opolchenija St., 35, Moscow, 123063
Дается обзор разработанной технологии белковых биочипов, позволяющей проводить многопараметрический анализ специфичности белок-белковых и белок-лигандных взаимодействий. Сотни белков могут быть иммобилизованы в разных ячейках микрочипа и одновременно анализированы на способность связывать определенный лиганд, катализировать определенную ферментативную реакцию или взаимодействовать с антителами и т.д. Показано, что молекулы белков, включая ферменты, сохраняют свою биологическую активность при иммобилизации в гелевых ячейках микрочипа. Ряд маркеров онкологических заболеваний широко используется для ранней диагностики и контроля за терапией злокачественных новообразований. Возможность параллельного определения нескольких онкомаркеров значительно повышает эффективность скринингового анализа и увеличивает возможности дифференциальной диагностики онкологических заболеваний.
Ключевые слова: белковый биочип, гидрогелевая ячейка, онкомаркеры.
More recently developed protein microarray technology allows a multivariate analysis of the specificity ofprotein-protein and protein-ligand interactions. Hundreds of proteins can be immobilized in different cells of the microchip and simultaneously analyzed for the ability to bind a specific ligand, to catalyze a specific enzymatic reaction or interact with the antibodies, etc. It was shown that the protein molecules, including enzymes, retain their biological activity when immobilized in the gel cells biochip. Several markers of cancer are widely used for early diagnosis and monitoring treatment of malignant tumors. The possibility of parallel determination of several tumor markers significantly increases the efficiency of screening tests and extends the possibility of differential diagnosis of cancer.
Keywords: protein biochip, hydrogel cell, tumor markers.
Биочип - революционное достижение биотехнологии последнего 10-летия. Это устройство позволяет за короткое время определять большое количество онкомаркеров, различных биологически активных веществ, а также генетических дефектов [1-3]. Технология белковых биочипов, заменяющих целые иммунологические лаборатории, дает возможность в несколько тысяч раз увеличить производительность большинства диагностических методов и резко снизить стоимость анализов. В связи с быстрым развитием молекулярной генетики, расшифровкой генома различных организмов требуется анализ биологической функции огромного количества белков, в том
числе ранее неизвестных. Основная доля изготавливаемых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94 %), оставшиеся 6 % составляют белковые чипы - современная, бурно развивающаяся технология, нашедшая широкое применение в диагностической и клинической медицине [4, 5]. Следует учесть, что технический прогресс последних лет затронул все звенья работы с белковыми чипами - от производства до интерпретации результатов [6, 7].
Белковые биочипы достаточно сложны в изготовлении. Это обусловлено наличием у белков определённой трёхмерной структуры, которая играет решающую роль во взаимодействии с другими вещест-
вами и управляет биологическими процессами. Если белок прикрепить на поверхность биочипа, как это делают с молекулами ДНК, его структура может быть нарушена, и белок не сможет выполнять свои функции. Современные технологии позволяют осуществлять иммобилизацию белков и ферментов с сохранением их свойств, а гидрофильное окружение этих белковых молекул в гелевых ячейках обеспечивает длительный срок хранения белковых биочипов [1, 8].
Существует несколько технологий изготовления белковых микрочипов в зависимости от пространственной иммобилизации молекул.
1. Технология биочипов на основе трехмерных гидрогелей. В 2001 г. 1-е поколение белковых чипов было разработано в лаборатории А.Д. Мирзабекова в Институте микробиологии РАН (ИМБ) им. В.А. Эн-гельгардта. Биочип представляет собой подложку из пластика или стекла, на которую нанесена матрица полусферических гелевых элементов с размером пор 20-100 нм. Каждый гелевый элемент с иммобилизованным индивидуальным зондом-белком имеет объем 0,1 нл, и в нем проходит иммунологическая реакция «сэндвич» - вариант иммуноанализа с флуоресцентной детекцией результата. Биочип, содержащий трехмерные ячейки, обладает существенными преимуществами по сравнению со стандартными двухмерными чипами. Взаимодействие исследуемых образцов с зондами, иммобилизованными в геле, имеет больше сходства с процессами, протекающими в растворе, чем в том случае, когда иммобилизованные зонды находятся на поверхности стекла, вследствие чего достигается высокая специфичность их взаимодействия с молекулами из анализируемого образца. Каждая ячейка содержит гораздо большее количество молекул зонда по сравнению с зондами, прикрепленными к двухмерной поверхности. В водном окружении молекулы сохраняют свою активность, с ними можно проводить любой ферментативный процесс. Трехмерные биочипы позволяют изучать кинетику и термодинамику реакций, протекающих в индивидуальных ячейках. Флуоресцентные сигналы от гелевых элементов регистрируют с помощью специального компьютерного анализатора [9 - 11].
2. Технология наночипов позволяет проводить «активный» иммуноанализ, проходящий в проточной камере, нижняя и верхняя стенки которой представляют собой диализные мембраны (разработка В.Н. Морозова, 2007). На поверхность нижней мембраны с помощью установки для электронапыления наносят микроматрицу моноклональных антител толщиной в одну или несколько молекул белка. Происходит формирование нанопокрытия толщиной в 20^50 нм, контролируемого по плотности, толщине и ориентации молекул. Наночип позволяет определять биомаркеры с очень высокой чувствительностью за несколько минут. Регистрацию сигналов от наночипов проводят с использованием обычного темнопольного микроскопа. Этот метод чрезвычайно чувствителен, однако требует сложного и дорогостоящего оборудования.
3. Технология микрочипов на основе микросфер (х-МАР) разработана в России, но развитие получила
в США. Для иммобилизации моноклональных антител используют карбоксилированные микросферы, заполненные внутри смесью красных и инфракрасных красителей. Система способна определять до 100 биомаркеров. Моноклональные антитела, иммобилизованные на карбоксилированных микросферах, взаимодействуют с антигеном. Затем к реакционной смеси последовательно добавляют биотинилированные вторые антитела, также специфически взаимодействующие с антигеном, коньюгат стрептавидина с фико-эритрином. Регистрируют флуоресцентные сигналы на специальном анализаторе. В результате иммунологической реакции на микросфере формируется нано-покрытие толщиной 20^30 нм, контролируемое по плотности, толщине и ориентации молекул.
Одним из перспективных направлений исследований является разработка на основе технологии белковых микрочипов метода одновременного количественного определения в сыворотке крови человека различных биологических параметров, например, таких, как уровень маркеров онкологических заболеваний (онкомаркеров) [12]. Общепринятые иммунологические методы позволяют определять содержание лишь одного маркера в клиническом образце. Этих недостатков лишена многопараметрическая тест-система на основе биочипа. На сегодняшний день разработано несколько мультиплексных систем на основе белковых иммуночипов для одновременного иммуноанали-за образца по нескольким параметрам.
Онкомаркеры используются в клинической практике для подтверждения диагноза и мониторинга проводимой терапии. Одновременное определение нескольких онкомаркеров повышает возможности дифференциальной диагностики заболеваний. Выявление повышенной концентрации одного онкомаркера не является доказательством для постановки диагноза онкопатологии, поскольку может быть связано с другими процессами. Для определения локализации опухоли также важно знать не только значения концентраций отдельных маркеров, но и их соотношения [13]. При проведении клинической диагностики важно определять концентрации онкомаркеров с высокой чувствительностью. Кроме того, определение концентрации онкомаркеров традиционными иммунофер-ментными тест-системами - работа трудоемкая и требует затраты большого количества ресурсов.
В лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН разработан метод одновременного количественного иммунофлуоресцентного анализа нескольких антигенов на биочипе. Созданная тест-система позволяет одновременно определять ряд серологических онкомаркеров методом иммунофлуоресцентного анализа на биочипе [14]. В качестве объектов учеными выбраны следующие серологические маркеры: альфа-фетопротеин (АФП), раково-эмбриональный антиген (РЭА), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), раковые антигены СА 15-3, СА 125, СА 19-9, простата-специфический антиген, общая форма (ПСАобщ), ПСА, свободная форма (ПСАсвоб), нейрон-специфическая енолаза (НСЕ) (таблица).
Онкомаркеры, анализируемые на гидрогелевых биочипах
Онкомаркер, принятое сокращение Концентрация в крови в норме Повышается при:
АФП < 10 нг/мл (у мужчин и небеременных женщин) гепатокарциноме, тератоме, беременности
РЭА < 5 нг/мл < 10 нг/мл (для курящих) аденокарциноме кишечника, легких, молочной железы, С-клеточной карциноме щитовидной железы
ХГЧ < 10 МЕ*/л (у мужчин и небеременных женщин) раке легких, органов мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта, органов репродуктивной системы, хорионэпителиоме, хорион-карциноме, карциноме яичка и плаценты, тератоме яичника и яичек
СА 15-3 < 28 МЕ/мл (у небеременных женщин) карциноме молочной железы, легких
СА 125 < 35 МЕ/мл раке яичников, сопутствующий маркер многих опухолей
СА 19-9 < 37 МЕ/мл карциноме поджелудочной железы, кишечника, желудка, желчекамен-ных болезнях, панкреатите
ПСАобщ ПСАсвоб < 4 нг/мл (мужчины до 50 лет) ПСАСвоб/ПСАобш > 0,15 раке простаты
НСЕ < 12,5 нг/мл мелкоклеточном раке легких, опухолях нейроэндокринного происхождения
ПСАобщ - серологический маркер рака предстательной железы. Благодаря своей специфичности этот маркер получил широкое внедрение в клиническую практику для диагностики и мониторинга рака предстательной железы.
Для проведения «сэндвич»-анализа для каждого маркера выбрана такая пара моноклональных антител, которая не обладает перекрестным взаимодействием с другими антителами, используемыми в анализе, не взаимодействует с другими определяемыми онкомар-керами, а также даёт наиболее выраженный рост на участке калибровочной кривой. На основании выбранных пар моноклональных антител был сконструирован биочип и создана проявляющая система флуоресцентно окрашенных антител для количественного иммуноанализа 9 маркеров онкологических заболеваний.
На основе этой технологии разработаны диагностические системы: для одновременного определения двух форм ПСА - общей и свободной и для одновременного определения 6 опухолевых маркеров: ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, РЭА, ХГЧ и НСЕ.
Аналитические характеристики новых систем сопоставлены с характеристиками стандартных иммуно-ферментных систем фирмы «CanAg» (Швеция), каждая из которых может определять только один маркер. Показано, что имеется высокая степень корреляции данных, полученных в двух видах систем [15].
Белковые микрочипы являются инструментом бурно развивающейся протеомики. В этой связи особый интерес представляют 2 задачи: 1. Качественное и количественное определение параллельно большого количества белков в клетках различных тканей или в различных функциональных состояниях, для чего можно использовать специфические антитела. В ряде европейских стран уже существуют программы получения большинства белков человеческих и бактериальных клеток и производства специфических антител к ним. 2. Изучение взаимодействий клеточных белков друг с другом и другими клеточными лиган-дами. Значительно более сложной задачей является идентификация белков, специфически взаимодействующих друг с другом и лигандами, если хотя бы один компонент неизвестен. Для этих случаев разра-
ботан метод идентификации связывающихся с микрочипом молекул с помощью масс-спектрометрии. На белковых микрочипах, содержащих иммобилизованные ферменты, можно проводить также кинетический анализ их субстратов и ингибиторов [9, 16].
Протеомный анализ направлен на одновременное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Предметом изучения протеомики являются синтез, модификация, декомпозиция и замена белков исследуемого объекта. После расшифровки геномов человека и других организмов появились базы данных о структуре многих белков человека, их протеолитических фрагментов, полученных в стандартных условиях, что позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их протеолитических фрагментов. Клиническая протеомика - это идентификация и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в биологическом образце (сыворотке крови, спинномозговой жидкости, моче, ткани), и мониторинг изменения их концентраций. Методы проте-омного анализа дают возможность проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций, что позволяет осуществлять диагностику и отслеживать течение заболевания.
Важный момент при работе с белковыми чипами -воспроизводимость результатов. К оценке качества биочипов предъявляются высокие требования: при производстве отбраковывают биочипы, у которых отклонения от среднего значения диаметра ячеек превышают 5 % внутри биочипа и 8 - между биочипами. Строгие требования предъявляются к гелю, в толще которого расположен белок. Подобранный состав ге-леобразующих мономеров, в который входят производные аминосахаров, препятствует дегидратации гелевых ячеек при хранении биочипов, что способствует сохранению исходных свойств иммобилизованных белков. Было показано, что иммобилизованные в гелевых ячейках биочипа антитела сохраняют активность, по крайней мере, в течение 6 мес. при хранении при температуре 2^8 °С. Кроме того, достаточно простая методика постановки анализа и автоматический
анализ его результатов позволили минимизировать вероятность мануальных ошибок.
Описанные эксперименты свидетельствуют о том, что биочипы конкурентоспособны в клинической иммунодиагностике со стандартными методами [17, 18]. Белковые микрочипы уже существенным образом повлияли на области медицины, связанные с оценкой гуморального иммунитета при аутоиммунных заболеваниях, аллергии, инфекционных болезней и рака. Они, вероятно, займут особое место в ранней диагностике сложных заболеваний и в выборе индивидуальной терапии и будут составлять основу биомедицины XXI в.
Литература
1. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы / А.М. Колчинский [и др.] // Молекулярная биол. 2004. № 38. С. 5 - 16.
2. Hydrogel glycanmicroarrays / V.I. Dyukova [et al.] // Anal. biochem. 2005. № 347. Р. 94 - 105.
3. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production / A.Y. Rubina [et al.] // Anal. biochem. 2004. № 325. Р. 92 - 106.
4. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications / A.Y. Rubina [et al.] // Biotechniques. 2003. № 34. Р. 1008 - 1014.
5. Белковые микрочипы / А.Ю. Рубина [и др.] // Докл. АН РАН. 2001. № 5. С. 419 - 422.
6. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology // Drug Discov. Today. 2005. № 10. Р. 503 - 511.
7. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips / A.Y. Rubina [et al.] // Anal. biochem. 2005. № 340. Р. 317 - 329.
8. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие
соединения: свойства и приложения в геномике / В.Е. Барский [и др.] // Молекулярная биол. 2002. № 36. С. 563 - 584.
9. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века // Вестн. РАН. 2003. № 73 (5). С. 412.
10. Why 3-D? Gel-based microarraysin proteomics / A.Y. Rubina [et al.] // Proteomics. 2008. № 8(4). Р. 817 - 831.
11. Fabrication andcharacterization of 3D Hydrogelmicroar-rays to measure antigenicity and antibody functionality for biosensor applications / P.T. Charles [et al.] // Biosens. Bioelec-tron. 2004. № 20. Р. 753 - 764.
12. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови / Т.П. Рябых [и др.] // Рос. биотерапевтический журн. 2006. № 5 (2). С. 49 - 57.
13. Measurement of prostate-specific antigen in serum as ascreening test for prostate cancer / W.J. Catalona [et al.] // N. Engl. J. Med. 1991. № 324. Р. 1156 - 1161.
14. Биологический микрочип для одновременного количественного иммуноанализа маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека / Е.Н. Савватеева [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2009. № 6. С. 679 - 683.
15. Савватеева Е.Н. Одновременный количественный иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе : автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 2008.
16. Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody microarray applications / P. An-genendt [et al.] // J. Chromatogr. 2003. № 1009. Р. 97 - 104.
17. Protein microchips: Use for immunoassay and enzymatic reactions / P. Arenkov [et al.] // Anal. Biochem. 2000. № 278. Р. 123 - 131.
18. Current perspectives in protein array technology / L.J. Kricka [et al.] // Ann. Clin. Biochem. 2006. № 43. Р. 457 - 467.
Поступила в редакцию_30 августа 2011 г.
