CC BY
338
1 1
72 ДИАГНОСТИКА
к УДК 616-006-073 T. V. Osipova, T. P. Ryabykh, A. Yu. Baryshnikov DIAGNOSTIC MICROCHIPS: APPLICATION IN ONCOLOGY N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT The review is concerned with the possibility of application of protein microchip technology to cancer diagnosis. The paper deals with current state in cancer diagnosis and the role of serologic tumor markers; the next-generation cancer diagnostics founded on multiplexed biomarker measurements; the employment of microchips in experimental and diagnostic research; different kinds of biochips for the analysis of tumor markers as well as the data obtained by the authors for the use of gel biochip-based microchips in tumor marker analysis. Key words: protein microchips, cancer diagnostics, serologic tumor markers. Т. В. Осипова, Т. П. Рябых, А. Ю. Барышников ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МИКРОЧИПЫ: ПРИМЕНЕНИЕ В ОНКОЛОГИИ ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ В обзоре рассматривается возможность применения технологии белковых микрочипов в диагностике злокачественных новообразований. Обсуждаются современное состояние диагностики рака и роль серологических опухолевых маркеров; диагностика рака нового поколения, основанная на измерении широкого спектра биомаркеров; применение микрочипов в экспериментальных и диагностических исследованиях; виды микрочипов для анализа опухолевых маркеров, а также данные авторов по использованию гелевых микрочипов для анализа опухолевых маркеров. Ключевые слова: белковые микрочипы, диагностики рака, серологические опухолевые маркеры. ВВЕДЕНИЕ СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ Одной из важнейших проблем современной онко- ДИАГНОСТИКИ РАКА логии является разработка новых и совершенствова- Снижение смертности от злокачественных опухо-ние традиционных методов диагностики рака на осно- лей и успешное лечение зависят от широкого внедрения ве новых технологий. Появление технологии биологи- в медицинскую практику простых надежных методов ческих микрочипов привело к фундаментальным ранней диагностики злокачественных новообразований. изменениям в диагностике опухолей с помощью опу- Из рис. 1 видно, что 5-летняя выживаемость при холевых маркеров. На основе биологических микро- запущенных формах рака яичника очень низка, тогда чипов в настоящее время разрабатываются новые ди- как более 90 % женщин, у которых диагностирована I агностические системы для количественного иммуно- стадия рака яичника, имеют вероятность прожить бо-логического анализа уровня сывороточных маркеров лее 5 лет [49]. На этом же графике показано, как изме-в крови онкологических больных. Преимуществом нилась бы картина распределения больных по стадиям микрочипа перед традиционными диагностическими заболевания в случае ранней диагностики рака. системами является возможность одновременного Аналогичные данные получены для немелкокле-анализа образца по нескольким параметрам при мини- точного рака легкого [32]: 5-летняя выживаемость мальном расходе анализируемого материала и реаген- примерно в 20 раз более вероятна у больных с локали-тов. Биологические микрочипы позволят не только зованной опухолью, чем с отдаленными метастазами. повысить эффективность использования опухолевых И хотя раннее выявление опухоли не всегда приводит маркеров в диагностике онкологических заболеваний, к увеличению продолжительности жизни, тем не ме-но также изучить природу этих маркеров и их роль нее диагностика рака на ранней стадии открывает шив развитии злокачественного процесса. рокие перспективы для лечения. ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
Стадия
1 | Распределение по стадиям в настоящее время
Ш I Распределение по стадиям при ранней диагностике
Рис. 1. Прогноз 5-летней выживаемости при раке яичника [49]
В настоящее время раннее выявление рака - это, скорее, исключение, чем правило, поскольку на ранних стадиях опухолевый процесс протекает бессимптомно. Многие виды рака потенциально излечимы, если диагностирована ранняя стадия заболевания. Однако в большинстве случаев больные обращаются за помощью, когда процесс уже распространился за пределы органа или опухоль дала отдаленные метастазы. На момент постановки диагноза опухолевый процесс локализован лишь в 50 % случаев при раке молочной железы (РМЖ) [39], в 56 % случаев при раке предстательной железы [40], в 35 % случаев при колоректальном раке [41] и менее, чем в 20 % случаев, при немелкоклеточном раке легких [32]. Несмотря на имеющиеся методы скрининга, такие, как маммография для РМЖ и тестирование на скрытую кровь для рака кишечника, именно эти формы рака занимают лидирующие места в структуре смертности от злокачественных новообразований [18; 42].
Для раннего выявления злокачественных опухолей нужны простые, недорогие и минимально инвазивные методы диагностики. К ним относится определение опухолевых маркеров в сыворотке крови - важном источнике информации о состоянии пациента, поскольку она постоянно перфузирует ткани и в нее поступают белковые субстанции от погибающих или мертвых клеток организма.
ДИАГНОСТИКА РАКА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ: МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
Последние годы характеризуются фундаментальными изменениями в подходах к диагностике рака, основанной на серологических маркерах. В этой области в течение длительного времени доминировал подход, базирующийся на поисках единичных опухолевых маркеров, которые с высокой чувствительностью и специфичностью обнаруживали бы различные виды рака, аналогично тому, как хорионический гонадотропин выявляет беременность или обнаружение вирус-
ной ДНК или РНК указывает на присутствие ряда патогенов [16]. К сожалению, этот подход не оправдал себя, и ни один «идеальный» опухолевый маркер, который мог бы со 100 %-ной вероятностью обнаруживать опухолевый процесс, не был найден [2].
Растущие опухоли высвобождают различные факторы и индуцируют множество изменений в своем окружении, включая воспаление и ангиогенез. Факторы, выделяемые опухолевыми клетками или секретируе-мые в ответ на рост опухоли клетками организма, идеально подходят для роли биомаркеров [22] . Исходя из этого, задачей диагностики нового поколения является измерение широкого спектра потенциальных биомаркеров и полный анализ этой информации, что позволит с высокой чувствительностью диагностировать опухолевый процесс [16]. Таким образом, современная диагностика направлена на разработку множественных - мультиплексных - систем, позволяющих одновременно оценивать широкий спектр потенциальных онкомаркеров.
Возникшая на рубеже веков технология белковых микрочипов создает возможности для разработки таких диагностических систем.
МИКРОЧИПЫ - НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Виды микрочипов
В настоящее время основным направлением совершенствования лабораторной диагностики является создание микрочипов - многоэлементных матриц, представляющих собой миниатюрные аналитические устройства для одновременного анализа специфических взаимодействий биологических молекул. Преимущество таких устройств перед традиционными методами диагностических исследований состоит в возможности одновременного анализа большого количества образцов с использованием минимальных количеств исследуемого материала и дорогостоящих реагентов.
Биологические микрочипы представляют собой твердый субстрат, на поверхность которого нанесены вещества биологического происхождения (ДНК, РНК, белки, моноклональные антитела, лиганды, рецепторы и т. д.), способные специфически взаимодействовать с молекулами анализируемого образца, образуя соответствующие комплексы. Кроме отдельных молекул, в микрочипы могут быть внесены различные клетки (бактериальные или клетки млекопитающих). В настоящее время разрабатываются следующие основные виды биологических микрочипов: ДНК-микрочипы, белковые, клеточные и тканевые [21; 23].
ДНК-микрочипы, содержащие иммобилизованные олигонуклеотидные зонды или фрагменты геномной ДНК, - наиболее разработанная область современной технологии микрочипов [31; 35]. Эти микрочипы применяются в молекулярной диагностике различных заболеваний, связанных с мутациями и перестройками в генах, а также при определении лекарственной ус-
н
1 1
74 ДИАГНОСТИКА
к тойчивости. В настоящее время ДНК-микрочипы вы- В Институте молекулярной биологии им. В. А. Эн-пускаются промышленно и успешно используются гельгардта РАН разработаны микрочипы на основе в фундаментальной науке и медицине. трехмерных гидрогелей [8; 34]. В гелевых микрочипах Последнее время большое внимание уделяется белки или антитела иммобилизуют в слое полиакрила-развитию технологии белковых микрочипов, так как мидного геля, нанесенного на специально обработан-именно белки реализуют важнейшие функции клетки ную поверхность стекла. Иммобилизация антител и играют ключевую роль во всех физиологических происходит в результате фотоиндуцированной сополи-и патологических процессах [46]. меризации [44]. Раствор смеси геля и антител наносится с помощью робота на поверхность стекла в виде ка-Белковые микрочипы пель диаметром от 50-300 мкм и объемом ~1 нл. ПолиИзготовление белковых микрочипов напоминает меризацию проводят облучением ультрафиолетовым производство ДНК-микрочипов, но в силу ряда причин светом (1=350 нм) в течение 30 мин при комнатной технология изготовления белковых чипов находится температуре. Приготовленные таким образом белков стадии разработки. Исторически сложилось так, что вые чипы используют для проведения различных реак-ДНК-чипы были востребованы в свое время глобаль- ций, в том числе иммунологических. В «сэндвич»-ва-ным проектом «Геном человека», выполнение и успеш- рианте иммуноанализа 2-е антитела метят флюорес-ное завершение которого было бы невозможно без вне- центным красителем (цианиновыми красителями Cy3 дрения этой новой технологии. Трудности создания или Cy5). После соответствующих этапов анализа из-белковых чипов связаны с природой белковых молекул. меряют флюоресцентные сигналы от гелевых ячеек Белки более разнообразны в химическом и физическом с помощью анализатора микрочипов (Биочип ИМБ), плане (кислые, основные, гидрофильные, гидрофобные снабженного специальными компьютерными про-и т.д.) и больше подвержены повреждениям, чем граммами. ДНК. Большую проблему представляет сохранение на- Основные преимущества использования чипов на тивной структуры и функциональной активности белка основе гидрогелей состоят в следующем. Благодаря при иммобилизации на микрочипе. трехмерной конфигурации ячейки число иммобили-Можно выделить 2 основных направления исполь- зованных молекул значительно выше, чем в поверх-зования белковых чипов: во-первых, применение для ностных микрочипах, что приводит к увеличению си-изучения и анализа взаимодействий огромного коли- гнала флюоресценции. Белки, иммобилизованные чества белков, кодированных геномом данного орга- в геле, благодаря водному окружению сохраняют нанизма [20]; во-вторых, использование в медицине тивную структуру и не подвергаются денатурации. в диагностических целях: для определения иммунного Гелевые полусферы отделены гидрофобной поверх-статуса организма, выявления специфических антиге- ностью, что исключает перетекание раствора от ячей-нов и антител, идентификации аллергенов, определе- ки к ячейке. ния опухолевых маркеров [29]. В гелевых ячейках возможно осуществление раз-Последние 5 лет интенсивно разрабатываются личных вариантов иммуноанализа - прямого, непря-белковые микрочипы для иммунологического анализа. мого, «сэндвич»-анализа. Показана возможность колиНа сегодняшний день моноклональные антитела и их чественного анализа белков в таких чипах [1]. аналоги (Fab, одноцепочечные фрагменты антител, содержащие вариабельные участки, и др.) наиболее час- ОПУХОЛЕВЫЕ МАРКЕРЫ И ИХ РОЛЬ то используются для иммобилизации на микрочипах. В ДИАГНОСТИКЕ РАКА Сфера применения микрочипов на основе антител Опухолеассоциированные антигены. Диагности-(АТ-микрочипов) может быть разнообразна: анализ ческая чувствительность и диагностическая специ-в биологических жидкостях уровней различных цито- фичность кинов [26], инфекционных агентов [12], гормонов [38], В онкологических клиниках в целях диагностики опухолевых маркеров [37; 50; 51], антител к опухоле- и контроля за лечением (мониторинг) на протяжении вым маркерам [9]. многих лет используют опухолевые маркеры- вещес-Предполагается, что такие микрочипы имеют су- тва, секретируемые опухолевыми клетками или орга-щественные преимущества в изучении процессов, низмом в ответ на рост опухоли. связанных с возникновением и прогрессией опухо- Международно признанных маркеров немного, лей. Микрочипы позволяют, используя небольшой но их число постоянно увеличивается. В табл. 1 пе-объем образца, одновременно исследовать многие речислены наиболее распространенные серологиче-белки, задействованные в этих процессах, а также ские опухолевые маркеры - опухолеассоциирован-анализировать соотношения между разными группа- ные антигены. Они представляют собой сложные ми белков [20]. белки, секретируемые опухолевыми клетками, как Микрочипы на основе гидрогелей — трехмерные правило, в значительно больших количествах, чем микрочипы нормальными. Эти маркеры широко используются Существуют разные способы изготовления белко- в клинической практике при наблюдении за больны-вых микроматриц, отличающиеся способом нанесе- ми, для раннего выявления рецидивов и контроля за ния и иммобилизации белков. лечением. ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
Опухолевые маркеры позволяют дифференцировать злокачественные и доброкачественные опухоли, определять стадию заболевания, своевременно выявлять и диагностировать рецидив. Значение этих маркеров в диагностике ранних стадий рака ограниченно, поскольку каждый из этих маркеров обладает невысокой диагностической чувствительностью и специфичностью [2; 15], то есть не позволяет диагностировать заболевание в группе больных злокачественными опухолями в 100 % случаев и не дает 100 %-ного отрицательного ответа в группе здоровых доноров. Исключение составляет ПСА, применяемый не только для дифференциальной диагностики и мониторинга, но и для скринингового выявления клинически не проявляющихся опухолей (табл. 1).
Несмотря на недостаточную чувствительность и специфичность, опухолеассоциированные антигены нашли широкое применение в клинической практике, и вся история их использования - постоянный поиск новых подходов, позволяющих преодолеть указанные недостатки. Один из таких подходов - использование комбинаций опухолевых маркеров.
Комбинирование опухолевых маркеров
Давно замечено, что применение в клинической практике комбинаций опухолевых маркеров позволяет увеличить чувствительность и специфичность и тем самым повысить эффективность диагностики злокачественных новообразований.
Для солидных опухолей большинства локализаций использование нескольких опухолевых маркеров оказывается гораздо более эффективным, чем применение одного, даже самого чувствительного. В табл. 2 представлены наиболее распространенные формы злокачественных опухолей и возможные комбинации раз-
Серологические опухолевые маркеры, наиболее часто
личных маркеров, информативных для опухолей данной локализации. Многими авторами предложены различные комбинации опухолевых маркеров с целью увеличения диагностической эффективности [7; 24; 28; 36; 47; 52].
Однако на сегодняшний день одновременное определение нескольких онкомаркеров с помощью различных коммерческих диагностикумов для установления точного диагноза чрезвычайно дорого.
Современная онкология столкнулась с необходимостью развития новых подходов к диагностике рака и создания принципиально новых тест-систем, позволяющих одновременно количественно определять сразу многие опухолевые маркеры.
БИОЧИПЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЕРОВ
АТ-микрочипы позволяют одновременно параллельно определять сразу многие опухолевые маркеры в небольшом объеме образца (например, в сыворотке крови). Применение АТ-микрочипов для анализа опухолевых маркеров включает 2 основных направления диагностических исследований: поиск новых маркеров и количественное определение известных опухолевых маркеров в средах организма [19].
Другими примерами применения АТ-микрочипов в онкологии может служить оценка координированных изменений элементов сигнальных путей или изменение в уровнях экспрессии определенного класса белков, таких, например, как факторы ангиогенеза [19].
Идентификация потенциальных биомаркеров злокачественных опухолей
В основе поиска новых опухолевых маркеров лежит следующий подход: одновременно измеряя многие
Таблица 1
используемые в клинических исследованиях [6]
Маркер Вид рака Основное клиническое применение
а-фетопротеин Г епатоцеллюлярный, несеминоматозный тестикулярный Определение стадии опухолевого процесса
Хорионический гонадотропин-Р человека Хорионкарциномы яичка и плаценты Определение стадии опухолевого процесса
СА 15-3 Молочной железы Мониторинг заболевания
СА 19-9 Поджелудочной железы, желудка Мониторинг заболевания
СА 125 Яичника, шейки матки Мониторинг заболевания
РЭА Колоректальный, поджелудочной железы, легких, молочной железы Мониторинг заболевания
ПСА Предстательной железы Скрининг, мониторинг заболевания
Таблица 2
Различные комбинации опухолевых маркеров, используемые в клинической практике
Опухоли (по локализации) РЭА АФП СА 19-9 СА 125 СА 15-3 р-хгч ПСА
Рак прямой и ТОЛСТОЙ кишки • • • •
Рак желудка • •• • •
Рак поджелудочной железы • •• • •
Рак молочной железы • • • • •
Рак легких • • •
Опухоли яичников • •• • • •
Рак эндометрия • •
Рак щитовидной железы •
Рак простаты ••
Рак печени ••
Рак шейки матки • • •
белки, сопоставляют 2 любые интересующие исследователей популяции (например, здоровых и больных данным видом рака) по большому числу параметров (белков) и идентифицируют наилучшие прогностические маркеры опухоли данной локализации.
С помощью АТ-микрочипов был проведен поиск новых прогностических маркеров рака легкого [17]. На микрочипах с 84 нанесенными антителами к сывороточным белкам были протестированы 80 образцов сыворотки крови (24 - больных с первично диагностированным раком легких; 24 - здоровых доноров и 32 -больных хроническими обструктивными заболеваниями легких). Было показано повышение уровеней экспрессии С-реактивного белка, сывороточного амилоида А, муцина 1 и а-1-антитрипсипа. Большинство этих белков не являются опухолеспецифическими и связаны с такими процессами, как травма, инфекция, воспаление и т.д. По-видимому, они могут быть использованы как дополнительные маркеры к известным опухолевым маркерам.
В табл. 3 представлены новые биомаркеры, обнаруженные с помощью АТ-микрочипов для рака легких [17], предстательной железы [25], рака поджелудочной железы [30] и рака яичника [27]. Из таблицы видно, что эти маркеры не являются специфическими для изученных видов рака. Они могут давать положительный эффект при других видах рака (например, маркеры рака яичника дают положительный эффект при раке молочной железы [27]), но позволяют достаточно точно дифференцировать (с вероятностью 95 %) группу больных данным видом рака (включая больных I и II стадией заболевания [27]) от здоровой популяции.
АТ-микрочипы позволяют также проводить имму-нофенотипирование и диагностику лейкозов [10; 11; 14].
Это лишь первые результаты поиска новых потенциальных маркеров, которые могли бы быть использованы для ранней диагностики и скрининга злокачественных новообразований с использованием АТ-микро-чипов. Они позволяют сделать следующие выводы:
1. Обнаруженные маркеры, как правило, не являются опухолеспецифическими (см. маркеры рака легких и рака поджелудочной железы в табл. 3);
2. Комбинации из 4-7 маркеров позволяют с высокой степенью вероятности дифференцировать сыворотки крови больных раком от сывороток крови здоровых доноров.
Таким образом, по-видимому, эти маркеры не позволяют диагностировать ту или иную форму рака, однако вполне могут быть использованы наряду с другими опухолевыми маркерами в скрининговых исследованиях для выявления опухолевого процесса как такового.
Количественное определение опухолеассоциированных антигенов
Вторым подходом к увеличению эффективности диагностики злокачественных новообразований на основе применения мультиплексных систем является создание АТ-микрочипов для одновременного количественного определения сразу нескольких (в перспективе - многих) опухолевых маркеров. Этот подход строится на создании тест-системы, аналогичной применяемой в настоящее время в клинической практике, но позволяющей одновременно определять уже изве-
Таблица 3
Новые биомаркеры, обнаруженные с помощью АТ-микрочипов
Опухоль Маркеры Число иммобилизованных антител В списке литературы
Рак легких С-реактивный белок, сывороточный амилоид А, муцин 1, а-1-антитрипсин, трансферрин, гелзолин 84 17
Рак простаты Фактор фон Виллебрандга, иммуноглобулин М, а-1-антихимотрипсин, виллин, иммуноглобулин в 184 25
Рак поджелудочной железы С-реактивный белок, а-1-антитрипсин, сывороточный амилоид А, иммуноглобулин А, гелзолин, индуцируемый белком антагонист витамина К-П 92 30
Рак яичника легггин, пролактин, остеопонтин, инсулино-подобный ростовой фактор II 169 27
стные опухолевые маркеры в одном образце сыворотки крови.
В отличие от АТ-микрочипов, описанных в предыдущем разделе и предназначенных для полуколичест-венного анализа, такой микрочип предназначен для количественного определения опухолевых маркеров. Это связано с тем, что все известные опухолевые маркеры экспрессируются и у здоровых людей, а у большинства больных злокачественными новообразованиями существенно повышается их уровень.
В настоящее время технология микрочипов позволяет одновременно исследовать десятки тысяч характеристик анализируемого образца. Однако для диагностических целей, как было показано выше, вполне достаточно нескольких опухолевых маркеров, значимость которых для данного заболевания установлена. Поэтому при диагностических исследованиях обычно ограничиваются рассмотрением систем, оценивающих в образце от 2 до 100 аналитов, представляющих наибольший интерес [33].
Создание биочипов для количественного определения сразу нескольких опухолевых маркеров - сложная задача. По аналогии с традиционными тест-системы в формате микрочипа должны иметь хорошую чувствительность, специфичность и воспроизводимость полученных результатов анализа. Основная трудность решения этой задачи состоит в подборе таких условий проведения иммуноанализа, которые были бы одинаково оптимальны для всех маркеров, объединяемых на чипе.
Одной из первых задач, вставших перед исследователями, был иммуноанализ в миниатюрном варианте -в ячейке микрочипа - и количественное определение хотя бы одного опухолевого маркера. В серии работ была показана возможность определения на биочипе уровня в сыворотке крови таких единичных опухолевых маркеров, как ПСАобщ, ПСАсв, интерлейкин-в, хорионический гонадотропин-в человека (в-ХГЧ),
РЭА, ферритин, АФП, СА 19-9 [4; 45; 48]. Было показано, что определение этих маркеров может проводиться с высокой чувствительностью [45].
Одна из первых мультиплексных тест-систем в формате биочипа была разработана для одновременного количественного определения сразу 12 опухолевых маркеров: СА 125, СА 15-3, СА 19-9, СА242, РЭА, АФП, ПСАобщ, ПСАсв, в-ХГЧ, гормон роста человека (ГРЧ), нейрон-специфическая енолаза (ЖЕ) и ферритин [43]. Тест-система была апробирована на образцах сыворотки крови онкологических больных с клинически подтвержденным диагнозом и имела диагностическую чувствительность 68,2 % и диагностическую специфичность 97,1 %. Наибольшей была частота выявления для рака печени (92,05 %), рака поджелудочной железы (81,5 %) и яичника (81,3 %). Для желудочно-кишечного тракта частота выявляемости была низкой (38,75 % для рака кишечника и 57,95 % для рака желудка). Большой интерес представляют данные о том, что у каждого больного была обнаружена своя индивидуальная картина уровней опухолевых маркеров.
Применение такого чипа - мультичипа - для диагностики различных форм рака позволило сделать ряд интересных наблюдений. Во-первых, при раке каждой локализации увеличивается экспрессия многих маркеров. Второе наблюдение следует непосредственно из первого: не существует так называемых опухолеспецифических маркеров. И, в-третьих, нет так называемых «женских» и «мужских» опухолевых маркеров. Например, ПСА, всегда рассматривавшийся как мужской маркер, в небольшом проценте случаев повышается у женщин при раке яичника, шейки матки и молочной железы [43].
Таким образом, результаты исследований, проведенных на чипах, лишний раз подтвердили ранее существовавшее положение об отсутствии опухолеспецифических маркеров.
Новая тест-система была использована в скрининговых исследованиях на контингенте численностью 15 867 человек. Из 436 человек, имевших повышенный уровень опухолевых маркеров, были прослежены 138. Из них в 16 случаях рак был клинически подтвержден, в 41 случае пациенты имели доброкачественные заболевания, с которыми связано повышение уровней опухолевых маркеров в сыворотке крови, тогда как в 81 случае на момент обследования пациенты не имели никаких симптомов заболевания и в настоящее время находятся под наблюдением.
В будущем внимание исследователей, по-видимому, будет сфокусировано на отборе и оптимизации различных комбинаций известных опухолевых маркеров, а также возможном расширении их за счет новых маркеров для раннего выявления различных опухолей или предопухолевых состояний.
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЕРОВ НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЕВЫХ МИКРОЧИПОВ
В РОНЦ РАМН на протяжении ряда лет велись разработки традиционных диагностических тест-систем на основе ELISA для количественного определения опухолевых маркеров, были наработаны антигены и моноклональные антитела к ним. В частности, в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО была разработана и запатентована тест-система на простата-специфический антиген (в формате 96-луночного планшета) для диагностики рака предстательной железы [3]. В то же время в ИМБ РАН была разработана и защищена между-народым патентом оригинальная технология создания микрочипов на основе гидрогелей [8; 34; 35]. Это можно считать предпосылками для создания онкодиагнос-тического биочипа для количественного определения опухолевых маркеров в сыворотке крови.
На рис. 2 представлен общий вид гелевого биочипа. На поверхности специально обработанного предметного стекла располагаются трехмерные гелевые элементы. На 1 мм2 стекла может размещаться до 100 индивидуальных гелевых ячеек. Каждый элемент содержит иммобилизованные моноклональные антитела, специфические к опухолевым маркерам (например, ПСА). Количественное определение опухолевого антигена на чипе, как и в традиционных методах, осуществляется иммунологическим методом, в наших
исследованиях применялся так называемый «сэнд-вич»-вариант иммуноанализа. На биочип наносили исследуемый образец крови больного (сыворотку), а после этого - 2-е антитела к этому же маркеру, меченные флюоресцентным красителем (Су5 или Су3). Интенсивность флюоресценции гелевого элемента была пропорциональна концентрации АГ. Флюоресцентные сигналы от гелевых ячеек измеряли с помощью анализатора микрочипов. Таким образом, на чипе иммуноанализ проходил в каждом гелевом элементе объемом меньше 1 нл.
Разработка онкодиагностического биочипа была начата с создания биочипа на ПСА (общую и свободную формы) для диагностики рака простаты. Мужчины старше 50 лет составляют группу риска в отношении этого заболевания. В последние 10 лет в ряде стран применяются программы скрининга, в которых ПСА-тест является одной из важных составляющих. Результатом этого стала тенденция к выявлению более ранних стадий рака простаты и снижение частоты возникновения. Использование для диагностики 2 форм ПСА (общей и свободной) позволяет значительно увеличить чувствительность и специфичность метода в интервале концентраций ПСА от 4 до 10 нг/мл [13].
Целью исследования была разработка тест-системы на основе биочипов (изготовлены в ИМБ РАН) для одновременного количественного определения 2 форм ПСА.
Показано [5], что тест-система на основе биочипа на 2 формы ПСА имеет удовлетворительные аналитические характеристики. Калибровочные кривые на ПСАобщ и ПСАсв (рис. 3) были хорошо воспроизводимы в различных экспериментах, коэффициенты вариации <11 %. Аналитическая чувствительность тест-системы как для ПСАобщ, так и для ПСАсв составляла 0,1 нг/мл. Надежность определения уровня маркеров в тест-системе оценивали с помощью специальных тестов. Было показано (тест на «открытие»), что отличие измеряемой концентрации от расчетной составило от 5 до 9 % для ПСАобщ и от 2 до 9 % для ПСАсв. Проверка тест-системы на специфичность показала отсутствие перекрестной реактивности с другими опухолеассоциированными антигенами: АФП, РЭА и раковыми антигенами СА 19-9, СА 15-3 и СА 125.
Тест-система на биочипе была апробирована на клиническом материале, включающем сыворотки онкологических больных и здоровых доноров. Уровни ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках здоровых доноров не
Концентрация ПСА, нг/мл
Концентрация ПСА, нг/мл
Рис. 2. Общий вид (а) и флюоресцентное изображение (б) гелевого микрочипа
Рис. 3.
ПСАсв [5]
Калибровочные кривые для ПСАобщ и
превышали общепринятых пороговых уровней: 4 и 1,1 нг/мл соответственно. Коэффициенты корреляции уровней ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках больных РПЖ, измеренных на биочипе и в тест-системе Roche Diagnostics, составили >0,99, (р<0,001), (рис. 4); измеренных на биочипе и в тест-системе CanAg - также >0,99, (р< 0,01) [5].
ПСАобщ
50 t 40 1 І " "о 20 а) ♦ у = 1 Л597х + 0 220 9 ^ R2 = 0.9856 ч
10 п=38;р<0-001; J* f=0.99
10 20 30 40 50 Є0 [с] ПСА, Rochs Diagpioitlcs
[с] ПСА. Roche Diagnostics
Рис. 4. Линия регрессии уровней ПСАобщ (а) и ПСАсв (б), определяемых в образцах сывороток больных раком простаты в тест-системе Roche Diagnostics и тест-системе в формате биочипа [5]
Таким образом, тест-система на основе биочипа позволяет одновременно количественно определять 2 формы опухолевого маркера (ПСА) в минимальных объемах образца (20 мкл). В перспективе эта тест-система может быть использована для ранней диагностики и скрининга на рак простаты в группе высокого риска (мужчины старше 50 лет) и может быть расширена за счет включения новых маркеров.
В настоящее время ведутся исследования по созданию диагностического микрочипа для одновременного количественного определения нескольких опухолевых маркеров. Показана [1] принципиальная возможность определения с помощью гелевых микрочипов опухолеассоциированных антигенов: АФП (маркера гепатоцеллюлярного рака), РЭА (маркера колоректального рака), раковых антигенов СА 19-9 (маркера рака поджелудочной железы), СА 15-3 (маркера рака молочной железы), СА 125 (маркера рака яичника). Таким образом, технология микрочипов открывает широкие возможности для одновременного анализа образцов сыворотки крови онкологических больных сразу на несколько (в перспективе - на множество) биомаркеров, что может значительно увеличить эффективность диагностики рака.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Возникновение технологии белковых микрочипов привело к изменению подхода к диагностике злокачественных новообразований. Новая технология позволяет проводить одновременный параллельный анализ сразу многих опухолевых маркеров, что увеличивает эффективность диагностики. 2 основные области применения этой технологии в онкологических исследованиях - это поиск новых биомаркеров и одновременное количественное определение уже известных опухолевых маркеров.
Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что микрочипы - это новая, перспективная технология, которая может кардинально изменить подход к диагностике рака и увеличить диагностическую эффективность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дементьева Е. И., Рубина А. Ю., Дарий Е. Л. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров // ДАН. - 2004. - Т. 395. - С. 542-547.
2. Кушлинский Н. Е. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркеров в онкологической клинике. Часть 1 (лекция) // Клин. Лаб. Диагн. - 1999. - № 3. - С. 25-32.
3. Осипова Т. В., Ленева Н. В., Виха Г. В. и др. Набор для количественного определения общего простатического антигена в сыворотке крови человека методом одностадийного твердофазного иммунофер-ментного анализа. Патент RU 224006 C2, БИ, 2004, 34.
4. Осипова Т. В., Рябых Т. П., Дементьева Е. И. и др. Белковые микрочипы для диагностики злокачественных новообразований. Разработка биочипа на простат-специфический антиген // Росс. Биотер. Журн.
- 2003. - №3. - С. 24-30.
5. Рябых Т. П., Осипова Т. В., Дементьева Е. И. и др. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови // Росс. Биотер. Журн. - 2006. - № 2. - С. 49-57.
6. Alaoui-Jamali M. A., Xu Y. Protein technology for biomarker profiling in cancer: an update // J Zhejiang University Science B. - 2006. - Vol. 7(6). - P. 411-420.
7. Ando S., Kimura H., Iwai N. et al. Optimal combination of seven tumour markers in prediction of advanced stage at first examination of patients with nonsmall cell lung cancer // Anticancer Res. - 2001. - Vol. 21.
- P. 3085-3092.
8. Arenkov P., KukhtinA., Gemmel A. et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Anal. Biochem. - 2000. - Vol. 278. - P. 123-131
9. Ascari M., Alarie J. P., Moreno-Bondi M., Vo-Dinh T. Application of an antibody for p53 detection and cancer diagnosis // Biotechnol. Prog. - 2001. - Vol. 17(3).
- P. 543-552
10. Belov L., de la Vega O., dos Remedios C. G. et al. Immunophenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray // Cancer Res. - 2001. -Vol. 61(11). - № 1. - P. 4483-4489.
11. Belov L., Huang P., Barber N. et al. Identification of repertoires of surface antigens on leukemias using an antibody microarray // Proteomics. - 2003. - Vol. 3(11). -P. 2147-2154.
12. Borrenbaeck C. A. Antibodies in diagnostics -from immunoassays to protein chips // Immunology today.
- 2000. - Vol. 21. - P. 379-382
13. Catalona W. J., Smith D. S., Ratliff T. L. et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a
1 1
80 ДИАГНОСТИКА
к screening test for prostate cancer // N. Engl. J. Med. - cer // Cancer Res. - 2005. - Vol. 65(23). - P. 1991. - Vol. 324. - P. 1156-1161. 11193-11202. 14. Christopher son R. I., Stoner K., Barber N et al. 31. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. Classification of AML using a monoclonal antibody microar- Immobilization of DNA in polyacrilamide gel for the ray // Methods Mol. Med. - 2006. - Vol. 125. - P. 241-245. manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide 15. EtzioniR., UrbanN., RamseySet al. The case for microchips // Anal. Biochem. - 1998. - Vol. 259. - P. eary detection // Nat. Rev Cancer. - 2003. - Vol. 3(4). - P. 34-41. 243-252. 32. Ries L. A. G., Eisner M. P., Kosary C. J et al. 16. Gander T. R., Brody E. N., Mehler R. E. et al. SEER Cancer Statistics Review 1973-1999, National Driving forces in cancer diagnostics // MLO. - 2003. - P. Cancer Institute, 2002. 10-20. 33. Rubenstein K. Multiplex assays: technologies, 17. Gao W. M., Kuick R., Orchekowski R. P. et al. applications, and markets // CMA. - 2006. -Distinctive serum protein profiles involing abundant pro- www.advancesreports.com teins in lung cancer patients based upon antibody microar- 34. Rubina A., Dementieva E., Stomakhin A. et al. ray analysis // BMC Cancer. - 2005. - Vol. 5. - P. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, prop-110-119. erties, and applications // BioTechniques. - 2003. - Vol. 18. Greenlee R., Murray T., Bolden S., Wingo P. 34. - P. 1008-1022. Cancer statistics 2000 // CA Cancer J Clin. - 2003. - Vol. 35. Rubina A. Yu, Pan’kov S. V., Dementieva E. I. et 50(1). - P. 7-33. al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: 19. Haab B. B. Antibody arrays in cancer research // properties and methods for large-scale production // Anal. Molec. Cell. Proteomics. - 2005. - Vol. 4. - P. 377-383. Biochem. - 2004. - Vol. 325. - P. 92-106. 20. Haab B. B., Dunham M. J., Brown P. O. Protein 36. Russel H., Crocer J. Expression of CEA, CA microarrays for highly parallel detection and quantitation 125, CA 19-9 and human milk fat Globole membrane anti-of specific proteins and antibodies in complex solutions // gen in ovarian cancer // J Clin Pathol. - 1988. - Vol. 41(3). Genome Biol. - 2001. - Vol. 2. - P. 4.1-4.13. - P. 260-269. 21. HallJ. The microarray revolution: how one chip 37. Sato K., Tokeshi M., Kimura H., Kitamori T. is changing the face of science // Harvard Science Rev. - Determination of carcinoembrionic antigen in human sera 2002. - P. 82-85. by integrated bead-bed immunoassays in a microchip for 22. Hanahan D., Wainberg R. A. The hallmarks of cancer diagnosis // Anal. Chem. - 2001. - Vol. 73(6). - P. cancer // Cell. -2000. - Vol. 100. - P. 57-70. 1213-1218. 23. Jain K. K. The role of protein-chip technology 38. Schneider B. H., Diekenson E. L., Vach M. D. et in molecular diagnostics // IVD Technology. - 2002. - al. Highly sensitive optical chip immunoassays in human P. 1-10. serum // Biosens. Bioelectron. - 2000. - Vol. 15. - P. 24. Lahousen M., Stettner H., Pickel H.The predic- 597-604. tive value of combination of tumor markers in monitoring 39. Screening for breast cancer //- 2001. patients with ovarian cancer // Cancer. - 1987. - Vol. 60. - 40. Screening for prostate cancer// - 2000. P. 2228-2232. 41. Screening for colorectal cancer//- 2001. 25. Miller J. C., Zhou H., Kwekel J. et al. Antibody 42. Smith R., Mettlin C., Davis K., Eyre H.American microarray profiling of human prostate cancer sera: anti- cancer society guidelines for the early detection of cancer body screening and identification of potential biomarkers // CA Cancer J Clin. - 2000. - Vol. 50(1). - P. 34-49. // Proteomics. - 2003. - Vol. 3. - P. 56-63. 43. Sun Z., Fu X., Zhang L. A protein chip system for 26. Moody M. D., Van Arsdell S. V., Murphy K. P. et parallel analysis of multitumor markers and its applica-al. Array-based ELISAs for high-throughput analysis of tion in cancer detection // Anticancer res. - 2004. - Vol. human cytokines // BioTechniques. - 2001. - Vol. 31. - P. 24. - P. 1159-1166. 186-194. 44. Vasiliskov A. V., Timofeev E.N., Surzhikov S. A. et 27. Mor G. Visintin I., Lai Y. et al. Serum protein al. Fabrication of microarray of gel-immobilized com-markers for early detection of ovarian cancer // PNAS. - pounds on a chip by copolymerization // Biotechniquies. -2005. - Vol. 102. - P. 7677-7682. 1999. - Vol. 27. - P. 592-606. 28. Muzushima Y., Hirata H., Isumi S. et al. 45. Wiese R., Belosludtsev Y., Powdrill T. et al. Clinical significance of the number of positive tumor Simultaneous multianalyte ELISA performed on a markers in assisting the diagnosis of lung cancer with microarray platform // Clin Chem. - 2001. - Vol. 47. - P. multiple tumor marker assay // Oncology. - 1990. - Vol. 1451-1457. 47. - P. 43-48. 46. Wiesner A. Detection of tumor markers with 29. Ng J. H., Ilag L. L. Biomedical application of ProteinChip® Technology // Current Pharmacol Biotech. protein chips // J. Cell Mol. Med. - 2002. - Vol. 6. - № 3. - 2004. - Vol. 5. - P. 45-67. - P. 329-340. 47. Woolas R. P., Xu F.J., Jacobs I.J. et al. Elevation 30. Orechekowski R., Hamelinck D., Li L. et al. of multiple serum markers in patients with stage I ovarian Antibody microarray profiling reveals individual and cancer // J. Natl Cancer Inst. - 1993. - 3, 85(21). - P. combined serum proteins associated with pancreatic can- 1748-1751. ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 I
48. Wu G., Datar R.H., Hansen K.M. et al. Bioassay of prostate-specific antigen using microcantilevers // Nature Biotechnology. - 2001. - Vol. 19. - P. 856-860.
49. Wulfkuhle J. D., Liotta L. A., Petricoin E. F. Proteomic applications for the early detection of cancer // Nature Reviews. Cancer. - 2003. - Vol. 3. - P. 267-275.
50. Xiao Z., Jiang X., Beckett M. L., Wright G. L. Generation ob baculovirus recombinant prostate-specific membrane antigen and its use in the development of a novel protein biochip quantitative immunoassay // Protein Expr Purif. - 2000. - Vol. 19(1). - P. 12-21.
51. Xiao Z., Adam B. L., Cazares L. H. et al. Quantization of serum prostate-specific membrane antigen by a novel protein biochip immunoassay discriminates benigh from malignant prostate disease // Cancer Res. -2001. - Vol. 61(16). - P. 6029-6033.
52. ZhangZ., Bast R.C., Yu Y. et al. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64. - P. 5882-5890.
Поступила 20.07.2006.
>-
4
