CC BY
84
1
ДИАГНОСТИКА 49
>- УДК 616.-65-006.6-074:547.96 T. P. Ryabykh1, T. V. Osipova1, E. I. Dementieva2, E. N. Savvateeva2, E. V. Konovalova2, Z. A. Sokolova1, A. Yu. Rubina2, A. Yu. Baryshnikov1, A. S. Zasedatelev2 BIOCHIP-BASED TEST-SYSTEM FOR SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN (TOTAL AND FREE FORMS) IN BLOOD SERUM 1N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS, Moscow 2 Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS, Moscow ABSTRACT Prostate-specific antigen (PSA) is elevated in the blood of men with prostate cancer, so it is usable for early detection of this cancer. The use of two PSA forms: total (PSAt) and free (PSAf) enhances specificity of PSA test. Biochip technology opens up the new possibilities for this tumor marker application to cancer screening. So the goal of the investigation was the development of the biochip-based test-system for simultaneous determination of two PSA forms (PSAt and PSAf) in human serum. Gel-based microchips with immobilized monoclonal antibodies against two forms of tumor antigen were manufactured in Biochip center of EIMB, RAS. PSAt and PSAf concentrations were determined in 'sandwich' immunoassay with fluorescence detection. Biochip-based test-system for PSAt and PSAf had reasonable analytical performance characteristics. Standard curves obtained in different experiments for PSAt and PSAf had the good reproducibility, coefficients of variation (CV) <11 %. The lower limit of detection of the test-system for PSAt and PSAf was 0.1 ng/ml. "Recovery"-test demonstrated that difference of measured concentration from the design one was from 5 to 9 % for PSAt and from 2 to 9 % for PSAf. No cross-reactivity was observed between PSA and the other tumor markers: alpha-fetoprotein, carcinoembrion-ic antigen and cancer antigens CA 19-9, CA 15-3, CA 125. New biochip-based test-system was examined with the use of clinical material, including sera of cancer patients and healthy donors. It was found, that the levels of PSAt and PSAf in sera of healthy donors did not exceed the cut-off levels: 4 ng/ml and 1.1 ng/ml, respectively. Correlation coefficients for concentrations of PSAt and PSAf in sera of patients with prostate cancer determined in biochip-based test-system and in system Roche Diagnostics were >0.99 (p<0.001); in biochip-based test-system and in system CanAg - >0.99 (p<0.01) also. Thus the laboratory variant of the new biochip-based test-system for PSAt and PSAf was developed. In the future the new system may be used for prostate cancer diagnostics in the group of high risk (men older than 50). Key words: Protein biochip, cancer diagnostics, prostate cancer, PSA, PSAt, PSAf. Т. П. Рябых1, Т. В. Осипова1, E. И. Дементьева2, E. H. Савватеева2, E. В. Коновалова2, 3. А. Соколова1, А. Ю. Рубина2, А. Ю. Барышников1, А. С. Заседателев2 ТЕСТ-СИСТЕМА В ФОРМАТЕ БИОЧИПА ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ И СВОБОДНОЙ ФОРМ ПРОСТАТА-СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва РЕЗЮМЕ Простатический специфический антиген (ПСА) относится к наиболее эффективным маркерам рака предстательной железы. Применение в диагностике РПЖ 2 форм этого антигена — общей и свободной (ПСАобщ ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
1 1
50 ДИАГНОСТИКА
к и ПСАсв) — значительно увеличивает специфичность ПСА-теста. Технология биочипов открывает новые возможности применения этого маркера для скрининга РПЖ. Целью исследования была разработка тест-системы на основе биочипов (изготовлены в ИМБ РАН) для одновременного количественного определения 2 форм ПСА. Тест-система на основе биочипа на 2 формы ПСА имела удовлетворительные аналитические характеристики. Калибровочные кривые на ПСАобщ и ПСАсв были хорошо воспроизводимы в различных экспериментах, коэффициенты вариации <11 %. Аналитическая чувствительность тест-системы как для ПСАобщ, так и для ПСАсв составляла 0,1 нг/мл. Тест на "открытие" показал, что отличие измеряемой концентрации от расчетной составило от 5 до 9 % для ПСАобщ и от 2 до 9 % для ПСАсв. Проверка тест-системы на специфичность показала отсутствие перекрестной реактивности с другими опухолеассоциированными антигенами: АФП, РЭА, и раковыми антигенами СА 19-9, СА 15-3 и СА 125. Тест-система на биочипе была апробирована на клиническом материале, включающем сыворотки онкологических больных и здоровых доноров. Уровни ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках здоровых доноров не превышали общепринятых пороговых уровней: 4 и 1,1 нг/мл соответственно. Коэффициенты корреляции уровней ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках больных РПЖ, измеренных на биочипе и в тест-системе Roche Diagnostics, составили >0,99, (р<0,001); измеренных на биочипе и в тест-системе CanAg — также >0,99, (р< 0,01). Таким образом, разработан лабораторный вариант новой тест-системы в формате биочипа для одновременного определения 2 форм ПСА. В будущем новая тест-система может быть использована для ранней диагностики и скрининга РПЖ в группах высокого онкологического риска (мужчины старше 50 лет). Ключевые слова: белковый микрочип, диагностика рака, рак простаты, ПСА, ПСАобщ, ПСАсв. ВВЕДЕНИЕ ки, антитела и др.) для проведения химических, имму-Эффективная диагностика — одна из ключевых нологических или ферментативных реакций. Основ-проблем онкологии и залог успешного лечения рака. ное преимущество микрочипа перед традиционными Современные достижения в изучении молекуляр- методами — возможность одновременного анализа ных механизмов развития злокачественного процесса образца по многим параметрам с использованием ми-способствовали возникновению новых подходов к диа- нимальных количеств анализируемого материала и до-гностике рака и созданию принципиально новых тест- рогостоящих реагентов. систем [10]. Задача диагностики нового поколения — Наиболее широкое распространение получили учет и точное количественное измерение широкого ДНК-микрочипы с иммобилизованными олигонуклео-спектра биомаркеров, синтезирующихся в процессе тидными зондами [11], которые успешно применяются развития опухоли. Полный анализ этой информации в фундаментальной науке и медицине. позволит с высокой чувствительностью диагностиро- Разработка белковых микрочипов представляет вать ранние стадии опухолевого процесса. собой важную и гораздо более трудно решаемую за-На протяжении многих лет в диагностических це- дачу, поскольку белки, реализующие важнейшие лях широко используются иммунохимические маркеры, функции клетки, являются более сложными и ла-среди которых основное место занимают опухолеассо- бильными молекулами, чем ДНК. Особую проблему циированные антигены, определяемые в сыворотке кро- представляет разработка белковых чипов на основе ви. Эти маркеры в основном используются в прогности- моноклональных антител для иммунометрического ческих целях, их применение для диагностики ранних анализа опухолевых маркеров. Основная трудность стадий опухолевого процесса ограничено. Показано, решения этой задачи состоит в подборе таких усло-что использование комбинаций опухолевых маркеров вий проведения иммуноанализа, которые были бы способствует повышению эффективности диагностики одинаково оптимальны для всех маркеров, объединя-злокачественных новообразований [7; 8; 15; 16]. На се- емых на чипе. годняшний день одновременное определение в одном В Институте молекулярной биологии им. В. А. Эн-образце сыворотки крови нескольких онкомаркеров гельгардта РАН (ИМБ РАН) разработана технология с помощью существующих коммерческих диагностику- микрочипов на основе трехмерных гелевых элемен-мов представляет значительные трудности. тов, содержащих иммобилизованные белки [1; 3; 12; Разработка множественных (мультиплексных) ди- 13]. Трехмерная структура геля повышает емкость яче-агностических тест-систем, включающих несколько ек по сравнению с традиционно применяемым в чипах (в перспективе — сотни и тысячи) потенциальных двухмерным слоем, увеличивая чувствительность ана-маркеров, — основная задача диагностики будущего. лиза, а также обеспечивает окружение иммобилизо-Именно эту задачу помогает решить возникшая на ру- ванных соединений, позволяющее сохранять белки беже веков технология биологических микрочипов. в нативном состоянии. Микрочип — это массив индивидуальных микро- С возникновением отечественной технологии бел-ячеек, содержащих различные зонды (ДНК, РНК, бел- ковых микрочипов появилась возможность начать раз- ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
работки диагностической тест-системы в формате биочипа для одновременного количественного определения сразу нескольких опухолевых маркеров. Создание такой системы в перспективе может привести к существенным изменениям в диагностике рака с помощью белковых маркеров.
Первым этапом на пути создания диагностической тест-системы в формате биочипа на несколько опухолевых маркеров была разработка системы для одновременного количественного анализа 2 форм простата-спе-цифического антигена (ПСА) — главного маркера рака предстательной железы. ПСА широко применяется в клинических исследованиях не только для мониторинга течения заболевания, оценки проводимого лечения, прогнозирования опухолевого процесса, но и для ранней диагностики и скрининга на рак предстательной железы [2; 9]. Одновременное использование 2 форм ПСА: общей (ПСАобщ) и свободной (ПСАсв) увеличивает специфичность ПСА-теста [9]. Технология биочипов открывает новые возможности для одновременного определения 2 форм ПСА (а в перспективе — и других маркеров) для ранней диагностики рака простаты.
Ранее нами показана принципиальная возможность количественного анализа опухолевых маркеров в условиях гелевых микрочипов [1; 6].
Целью настоящего исследования была разработка диагностической тест-системы в формате биочипа для одновременного количественного определения 2 форм ПСА (ПСАобщ и ПСАсв) как первого этапа на пути создания биочипа для определения нескольких опухолевых маркеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Трехмерные микрочипы на основе гидрогелей
В работе использованы микрочипы на основе гидрогелей с иммобилизованными моноклональными антителами к 2 формам ПСА, разработанные в ИМБ РАН. Биочип представляет собой матрицу трехмерных полусферических гелевых элементов, отделенных друг от друга гидрофобной поверхностью предметного стекла (рис. 1). Каждая ячейка матрицы, представляющая собой индивидуальный микроконтейнер объемом 1 нанолитр или менее, которую можно рассматривать как миниатюрную пробирку или лунку планшета, может быть использована для проведения различных реакций.
Антигены, моноклональные антитела и образцы сывороток
Антигены: ПСА, раковоэмбриональный антиген (РЭА), альфа-фетопротеин (АФП) и раковые антигены СА 19-9, СА 15-3 и СА 125 получены на фирме Хе-ма-Медика (Россия). Готовые растворы стандартов ПСА приобретены на фирме CanAg (Швеция).
Моноклональные антитела, специфические к ПСА, предоставлены Лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ГУ Онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН (РОНЦ РАМН) [4; 5] или приобретены на фирме CanAg (Швеция).
Рис. 1. Структура биочипов на основе гидрогелей: а — общий вид; б — фото;
в — увеличенное изображение
Диагностические наборы для определения общей или свободной форм ПСА. В работе использованы диагностические наборы фирмы CanAg (Швеция).
Верифицированные образцы сывороток любезно предоставлены Лабораторией клинической иммунологии и Урологическим отделением ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Концентрация антигена в сыворотках определена с помощью автоматизированной электрохе-милюминесцентной тест-системы ELECSYS фирмы Roche Diagnostics (Германия).
Иммуноанализ на биочипе В работе использован двухстадийный сэндвич-вариант иммуноанализа. Были получены микрочипы с иммобилизованными моноклональными антителами, специфичными к ПСАобщ и ПСАсв. На микрочипы наносили раствор антигена или образец сыворотки крови и после этого — вторые моноклональные антитела, специфичные к ПСА, меченные флюоресцентным красителем (Cy 5). Флюоресцентные сигналы регистрировали с помощью анализатора биочипов на основе CCD камеры, сопряженного с компьютерной системой, со специальным программным обеспечением (Биочип ИМБ, Россия).
Концентрации 2 форм ПСА в образцах сыворотки определяли по соответствующим калибровочным кривым. Чувствительность
Аналитическую чувствительность тест-системы определяли как концентрацию антигена, соответствующую средней (12-кратно определенной) флюоресценции нулевого стандарта плюс 2 стандартных отклонения (средняя величина + 2SD).
Биологическую чувствительность тест-системы в формате биочипа определяли, используя сыворотки крови мужчин с низкими концентрациями ПСА [14]. Биологический предел обнаружения в иммуноанализе на микрочипе был рассчитан как первое среднее значение концентрации 3-кратно измеренного образца сыворотки, превышающее на 2SD доверительный интервал многократно определенного нулевого калибратора (p<0,05).
Специфичность
Тест на специфичность ставили в 2 вариантах. В первом, наряду с ПСА в концентрации 30 нг/мл, на чипы наносили и другие опухолевые маркеры: АФП — 100 нг/мл; РЭА — 64 нг/мл; раковые антигены СA 19-9 — 240 ед/мл; CA 15-3 — 240 ед/мл; CA-125 — 400 ед/мл. Во втором варианте в тесте на специфичность использовали сыворотки крови женщин с различными онкологическими заболеваниями с высокими уровнями опухолеассоциированных антигенов: РЭА, — 1340 нг/мл; АФП — 40 нг/мл; и раковых антигенов СА 19-9, — 604 ед/мл; СА 15-3, — 58,7 ед/мл и СА 125, — 658 ед/мл, а также сыворотку крови мужчины с уровнем ПСА 21,2 нг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Построение калибровочных кривых
Была изготовлена партия биочипов с иммобилизованными моноклональными антителами к общей и свободной формам ПСА. Антиген ПСА был раститрован в широком диапазоне концентраций, и были выбраны участки калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсв, характеризующиеся стабильной линейностью. Рабочие диапазоны концентраций составили от 0,3 до 30 нг/мл для ПСАобщ и от 0,3 до10 нг/мл для ПСАсв соответственно. Типичные калибровочные кривые для ПСАобщ и ПСАсв представлены на рис. 2. Из рисунков видно, что в указанных диапазонах концентраций они имеют характер, близкий к линейному. Известные из литературы верхние границы нормы для ПСАобщ (4 нг/мл) и ПСАсв (1,1 нг/мл) находятся в пределах линейного диапазона калибровочных кривых.
Аналитические характеристики тест-системы в формате биочипа
Проведен анализ воспроизводимости калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсв. Показано, что калибровочные кривые имеют удовлетворительную воспроизводимость: коэффициенты вариации (КВ)
для каждой точки калибровочной кривой как в пределах одного эксперимента (intra-assay), так и в трех независимых экспериментах (inter-assay) не превышали
11 %. Рис. 3. иллюстрирует как intra-assay, так и inter-
ПСАобщ
Концентрация ПСА, нг/мл
ПСАсв
Концентрация ПСА, нг/мл
Рис. 2. Типичные калибровочные кривые для ПСАобщ (а) и ПСАсв (б)
assay воспроизводимость калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсв.
Сыворотки крови человека использовали для оценки точности измерений в пределах одного эксперимента. Видно (рис. 4), что уровни ПСАобщ, ПСА св и %ПСАсв (отношение ПСАсв к ПСАобщ, выраженное в процентах) в сыворотках имеют удовлетворительную воспроизводимость: КВ для ПСАобщ, ПСАсв и %ПСАсв не превышает 8; 15 и 16 % соответственно.
Чувствительность — важная характеристика диагностической тест-системы. Аналитическая чувствительность (нижний предел определения) тест-системы в формате биочипа как для ПСАобщ, так и для ПСА св составила 0,1 нг/мл, а биологическая чувствительность — 0,4 нг/мл, что соизмеримо с чувствительностью ряда традиционных коммерческих тест-систем.
Надежность тест-системы в формате микрочипа оценивали с помощью тестов на линейность и «открытие».
(—
ПСАсв. Inter-assay
Концентрация ПСА, нг/мл
Н
Рис. 3. Воспроизводимость калибровочной кривой для ПСАобщ (а, б) и ПСАсв (в, г): (а, в) в одном эксперименте (intra-assay) и (б, г) в 3 независимых экспериментах (inter-assay), поставленных в пределах 3 нед
Тест на разбавление/линейность. Образец сыворотки крови больного с известным содержанием ПСА (50 нг/мл) последовательно двукратно разбавляли с помощью сыворотки, которая была предварительно промерена на биочипе и не содержала ПСА. Рис. 5 показывает линейный характер кривой, соответствующей разведениям анализируемого образца сыворотки, и ее параллелизм по отношению к калибровочной кривой в интервале концентраций от 0 до 12,5 нг/мл.
Тест на «открытие». Образцы для постановки теста были получены путем добавления сывороток с различными концентрациями ПСАобщ к образцам, содержащим известную концентрацию ПСАобщ (то же самое — для ПСАсв). Сравнивали ожидаемую концентрацию, которая должна была получиться при смешении сывороток с известными концентрациями с реально измеренной на чипе. Отношение измеренной концентрации к ожидаемой, выраженное в процентах, — «процент открытия» — для ПСАобщ составил 91-105 %, для ПСАсв — 102109 % (табл. 1 и 2).
Результаты проведенных тестов свидетельствуют о достаточной надежности определения антигена в тест-системе в формате биочипа.
Специфичность тест-системы. В обоих вариантах постановки теста на специфичность не наблюдалось перекрестной реактивности между моноклональными антителами, специфичными к ПСА, с такими опухолевыми маркерами, как АФП, РЭА, опухолевыми антигенами СА 19-9, СА 15-3, СА 125. Рис. 6. показывает отсутствие перекрестной реактивности при добавлении различных сывороток, содержащих повышенные концентрации этих опухолеассоциированных антигенов, в тест-систему в формате биочипа для анализа ПСАобщ. Значительный флуоресцентный сигнал наблюдается только при добавлении сыворотки, содержащей ПСА.
Определение уровней ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках крови Новая тест-система в формате биочипа должна была пройти апробацию на клиническом материале, включающем сыворотки крови здоровых доноров и онкологических больных.
1 1 1
54 ДИАГНОСТИКА
ПСАобщ
З
«
о
<
о
го
&
о
*
I]
№930 №931 №932 №933 №930/2
2.56% 4.29% 0.69% 0.24% 7.65%
Номера образцов сывороток и коэфффициенты вариации
ПСАобщ
Концентрация ПСА, нг/мл
Рис. 5. Тест на линейность для ПСАобщ. Калибровочная кривая и кривая разведения образца сыворотки
ПСАсв
16
14
и
<
О
Є
х
О)
б)
№931
12.11%
№932
1.83%
№933
14.90%
Номера образцов сывороток и коэффициенты вариации
%ПСА св (ПСАсв/ПСАобщ%)
ItL
№931
15.97%
№933
14.71%
№930/2
1.20%
Номера образцов сывороток и коэффициенты вариации
Рис. 4. Воспроизводимость определения уровней ПСАобщ (а), ПСАсв (б) и %ПСАсв (в) в сыворотках крови человека в пределах одного эксперимен
ПСАобщ
Рис. 6. Специфичность тест-системы на ПСА в формате биочипа. Объяснения в тексте
Уровни ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках крови здоровых доноров, определенные с помощью биочипов по калибровочным кривым, не превышали верхних границ нормы, известных из литературы: 4 и 1,1 нг/мл соответственно (рис. 7). Средние уровни ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках здоровых доноров (мужчин) составляли 0,66 и 0,33 нг/мл соответственно.
Следующим этапом работы было определение на биочипах уровней ПСАобщ и ПСАсв в сыворотках крови больных раком простаты и сравнение с известными и хорошо зарекомендовавшими себя методами. В этих экспериментах использовали верифицированные сыворотки, уровни ПСА в которых предварительно были оценены в традиционных коммерческих тест-системах Roche Diagnostics и CanAg.
Таблица 1
ПСАобщ. Тест на «открытие»
Таблица 2
ПСАсв. Тест на «открытие»
Концентрация ПСАобщ, нг/мл
Измеренная Ожидаемая % открытия
пул 1 1,18
пул 2 4,48
пул 3 19,59
пул 1+ пул 2 2,97 2,83 105
пул 1+ пул 3 9,47 10,36 91
пул 2+ пул 3 11,92 12,04 99
Концентрация ПСАсв, нг/мл
Измеренная Ожидаемая % открытия
пул 1 0,19
пул 2 0,70
пул 3 4,46
пул 1+ пул 2 0,49 0,45 109
пул 1+ пул 3 2,36 2,32 102
пул 2+ пул 3 2,82 2,58 109
На рис. 8. представлены линии регрессии уровней ПСАобщ (а) и ПСАсв (б), измеренных на чипе и в системе Roche Diagnostics. Видно, что в обоих случаях точки расположены вблизи линий регрессии: величина достоверности аппроксимации (R2) составляет 0,986
и 0,985 соответственно. Концентрации каждой из форм ПСА, полученные для одних и тех же сывороток в обеих тест-системах, связаны уравнениями линейной регрессии, указанными на рис 8 (а, б). Коэффициенты корреляции уровней ПСАобщ (рис. 8а) и ПСА св (рис. 8б) в сыворотках больных раком простаты, оце-
(—
ПСАобщ
4п
а)
ч 3.5 I
х 3
< 2 5 Средний уровень 0.66 нг/мл
с "
1 2 я
£ 1.5
а>
1 -гППааоЛааа,
23456789 Номера образцов сывороток
0 10 20 30 40 50 60
[с] ПСА Roche Diagnostics
И
S
х
0.8
0.6
0.4
0.2
б)
ПСАсв
Средний уровень 0.33 нг/мл
UJ
ПСАсв
3 4 5 6
Номера образцов сывороток
Рис. 7. Определение уровней ПСАобщ (а) и ПСАсв (б) в сыворотках крови здоровых доноров: жирными линиями обозначены верхние границы нормы для ПСАобщ и ПСАсв (4 нг/мл и 1,1 нг/мл соответственно)
о
S
\о
<
о
[с] ПСА Roche Diagnostics
Рис. 8. Линии регрессии уровней ПСАобщ (а) и ПСА св (б), определяемых в образцах сывороток больных раком простаты в тест-системе Roche Diagnostics и в тест-системе в формате биочипа
ненные в 2 тест-системах, составляют 0,99 (p<0,001) и 0,992 (p<0,01) соответственно.
На рис. 9 представлены аналогичные данные ПCAoбщ и ПCAсв при использовании в качестве референтной системы коммерческой тест-системы CanAg (CanAg PSAE^ CanAg Free PSAEIA). Уровни ПCAoбщ, определенные в 2 тест-системах, связаны уравнением регрессии, указанным на рис 9, а. Для ПCAсв уравнение регрессии приведено на рис. 9,
б. Коэффициент корреляции для ПCAoбщ составляет
0,994 (р<0,01), а для ПCAсв — 0,99 (р<0,01).
Полученные результаты свидетельствуют, что новая тест-система в формате биочипа для одновременного определения ПCAoбщ и ПCAсв в образцах сывороток больных раком предстательной железы позволяет получать результаты, сравнимые с результатами, полученными в таких тест-системах, как Roche Diagnostics и CanAg.
Таким образом, разработан лабораторный вариант диагностической тест-системы в формате биочипа для
70 60 Е 50
S
і 40 «
<
О 30 с
“ 20 10 0
ПСАобщ
а)
у=1.0176х-0.4697
R2 = 0.9883
4Ґ * п=18; г=0.994;
р<0.01
10 20 30 40
[с] ПСА, СапАд
50
60
12
10
1 6
<
О
ПСАсв
б) И
у=0.9819х-0.1712
R2 = 0.9835
♦ г=0.99;
п=12; р<0.01
4 6
[ПСА], СапАд
10
12
Рис. 9. Линии регрессии уровней ПСАобщ (а) и ПСАсв (б), определяемых в образцах сывороток больных раком простаты в тест-системе СапЛ§ и в тест-системе в формате биочипа
одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена. Новая тест-система имеет удовлетворительные аналитические характеристики: аналитическую чувствительность — 0,1 нг/мл, биологическую чувствительность — 0,4 нг/мл, хорошую воспроизводимость калибровочных кривых, отсутствие перекрестной реактивности с рядом опухолеассоциированных маркеров и достаточную надежность, оцененную в тестах на линейность и «открытие».
Cравнительный анализ результатов, полученных в одних и тех же образцах сывороток крови, на биочипе и в диагностических тест-системах Roche Diagnostics и CanAg показал высокую степень корреляции полученных данных (r>0,99; p<0,01) для обеих форм nCA.
Таким образом, тест-система на основе биочипа позволяет проводить одновременное количественное определение 2 форм опухолевого маркера (nCA) в минимальных объемах образца (20 мкл). В перспективе эта тест-система может быть использована для ранней диагностики и скрининга на рак простаты в группе высокого риска (мужчины старше 50 лет) и расширена за счет включения новых маркеров.
Pанее нами была показана [1] принципиальная возможность определения с помощью гелевых микрочипов и других опухолеассоциированных антигенов: AФП (маркера гепатоцеллюлярного рака), PЭA (маркера колоректального рака), раковых антигенов CA 19-9, (маркера рака поджелудочной железы), CA 15-3 (маркера рака молочной железы), CA 125 (маркера рака яичника). Таким образом, технология микрочипов открывает широкие возможности для одновременного анализа образцов сыворотки крови онкологических больных сразу на несколько (в перспективе — на множество) биомаркеров, что может привести к значительному увеличению эффективности диагностики рака.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дементьева Е. И., Рубина А. Ю., Дарий Е. Л. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров // ftAH. — 2004. — Т. 395. — C. 542-547.
2. Матвеев Б. П., Бухаркин Б. В., Матвеев В. Б. Pак предстательной железы / ^рининг рака предстательной железы. http://medi.ru/doc/093105.htm, 2000.
— C. 1-9.
3. Мирзабеков А. Д., Рубина А. Ю., Паньков С. В. Композиция для полимеризационной иммобилизации биологически значимых соединений и способ ее осуществления. Патент WO 03/033539, БИ, 2003, 32.
4. Осипова Т. В. Ленева Н. В., Боровкова Н. Б., Барышников А. Ю. Издание диагностической тест-системы, выявляющей простатический специфический антиген, на основе новых моноклональеных антител // Mед. Иммунол., Дни иммунологии в Cанкт-Петербyр-ге. — 2001. — Т. 3, № 2. — C. 150-151.
5. Осипова Т. В., Ленева Н. В., Виха Г. В. и др. Набор для количественного определения
общего простатического антигена в сыворотке крови человека методом одностадийного твердофазного иммуноферментного анализа. Патент RU 224006 C2, БИ, 2004, 34.
6. Осипова Т. В., Рябых Т. П.Белковые микрочипы для диагностики злокачественных новообразований. Разработки биочипа на простата-специфический антиген // Росс. биотер. журн. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 24-30.
7. Ando S., Kimura H., Iwai N. et al. Optimal combination of seven tumour markers in prediction of advanced stage at first examination of patients with nonsmall cell lung cancer // Anticancer Res. — 2001. — Vol. 21. — P. 3085-3092.
8. Carpelan-Holmstrom M., Louhimo J., Stenman U. N. et al. CEA, Ca 19-9 and CA 72-4 improve the diagnostic accuracy in gastrointestinal cancers // Anticancer Res. — 2002. — Vol. 22(4). — P. 2311-2316.
9. Catalona W. J., Smith D. S., Ratliff T. L. et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer // N. Engl. J. Med. — 1991. — 324. — P. 1156-1161.
10. Gander T. R., Brody E. N., Mehler R. E. et al. Driving forces in cancer deiagnostics // MLO. — 2003. — 10. — P. 10-20.
11. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. Immobilization of DNA in polyacrilamide gel for the man-
ufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips // Anal. Biochem. — 1998. — Vol. 259. — P. 34-41.
12. Rubina A., Dementieva E., Stomakhin A. et al. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications // BioTechniques. — 2003. — 34.
— P. 1008-1022.
13. Rubina A. Yu, Pan’kov S. V., Dementieva E. I. et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production // Anal. Biochem. — 2004. — 325. — P. 92-106.
14. Stamey T., Graves H., Wehner N. et al. Early detection of residual prostate cancer after radical prostatectomy by an ultrasensitive assay for prostate specific antigen // J Urol. — 1993. — 149. — P. 787-792.
15. Woolas R. P., Xu F. J., Jacobs I. J. et al. Elevation of multiple serum markers in patients with stage I ovarian cancer // J. Natl Cancer Inst. — 1993. — 3, 85(21). — P. 1748-1751.
16. Zhang Z., Barnhill S.D., Zhang H. et al. Combination of multiple serum markers using an artificial neural network to improve specificity in discriminating malignant from benign pelvic masses // Gynecol Oncol. — 1999. — Vol. 73, № 1. — P. 56-61.
Поступила 02.05.2006.
>-
4
