CC BY
98
Татьяна Павловна Рябых1, Татьяна Владимировна Осипова2, Зинаида Александровна Соколова3, Николай Борисович Паклин4, Владимир Иванович Грабко5
ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КОММЕРЧЕСКОЙ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ СУСПЕНЗИОННЫХ МИКРОЧИПОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВЫХ ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЕРОВ
1 Д. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН
(115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 К. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН
(115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Младший научный сотрудник, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН
(115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
4 К. т. н., доцент, кафедра общей, теоретической физики и методики преподавания физики,
РГУ им. С. А. Есенина (390000, РФ, г. Рязань, ул. Свободы, д. 46)
5 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория биологически активных наноструктур, ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России
(123098, РФ, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, Рябых Татьяна Павловна, e-mail: [email protected]
Разработанные в последнее время диагностические системы на основе микрочипов позволяют проводить одновременную количественную оценку сразу нескольких опухолевых маркеров, что может существенно улучшить диагностику злокачественных новообразований. На массиве из 95 образцов сыворотки крови онкологических больных и пациентов контрольной группы проведена оценка диагностических характеристик новой коммерческой системы на основе суспензионных микрочипов «WideScreen™Human Cancer Panel 1» («Tumor markers») фирмы «Novagen» (США). Измеренные уровни маркеров сопоставлены с результатами, полученными в отечественной мультиплексной системе «ОМ-биочип» и в традиционных иммуноферментных системах, рассчитанных на определение одного опухолевого маркера. Показано, что новая система позволяет получать данные, которые коррелируют с результатами, полученными при измерении каждого индивидуального маркера в соответствующей иммуноферментной системе (r 0,616—0,978; p < 0,0001), и результатами, полученными в системе на основе планарных микрочипов «ОМ-биочип» (r 0,768—0,828; p < 0,0001). Методом ROC- и логистического регрессионного анализа проведено разграничение больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы. Оценка диагностической чувствительности и специфичности, а также определение площади под ROC-кривыми показали, что новая система на 6 опухолевых маркеров с учетом возраста пациента имеет достоверно более высокую диагностическую эффективность по сравнению с системами для определения каждого единичного опухолевого маркера (площади под ROC-кривыми 0,920 и 0,553—0,787 соответственно; р < 0,003). Таким образом, применение мультиплексных диагностических систем в формате микрочипов для анализа опухолевых маркеров в перспективе позволит существенно улучшить диагностику рака.
Ключевые слова: биологические микрочипы, опухолевые маркеры, диагностика, ROC-анализ.
Возможность ранней диагностики опухолей по серологическим маркерам является вопросом принципиальной важности [1]. Тем не менее белковые опухолевые
маркеры, широко используемые в клинической практике, не находят, за редкими исключениями, применения при скрининговом обследовании населения в целях вы-
5B
явления злокачественной опухоли из-за их невысокой чувствительности и специфичности. Показано, однако, что одновременная количественная оценка уровней сразу нескольких опухолевых маркеров может повысить их диагностическую эффективность [2—4].
Разработанные в последнее время отечественные [5] и зарубежные [6] мультиплексные (многопараметрические) системы на основе микрочипов позволяют проводить одновременную количественную оценку десятков и сотен биомаркеров в минимальном объеме сыворотки крови и могут стать технологиями, которые позволят существенно улучшить диагностику злокачественных новообразований.
Недавно нами была оценена диагностическая эффективность отечественной системы «ОМ-биочип» на основе технологии планарных гидрогелевых микрочипов [5] для одновременного определения уровней 6 опухолевых маркеров: альфа-фетопротеин (АФП), раково-эмбриональный антиген (РЭА), простат-специфический антиген общий и свободный (ПСАобщ., ПСАсв.), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) и нейрон-специфическая енолаза (НСЕ). Показано, что ее эффективность при разграничении больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы существенно выше, чем при использовании каждого отдельного маркера [7].
В последние годы широкое распространение в мире получила технология суспензионных микрочипов (хМАР-технология), позволяющая одновременно определять до 100 биомаркеров в ячейке микропланшета и используемая для диагностики различных заболеваний. В настоящее время на российском рынке появилась коммерческая система «WideScreen™Human Cancer Panel 1» («Tumor markers») — (далее «Панель-ОМ1») фирмы «Novagen» (США), предназначенная для применения в онкологии и рассчитанная на одновременное определение следующего спектра опухолевых маркеров: АФП, РЭА, СА 125, СА 15-3, СА 19-9 и пролактина (табл. 1).
Целью нашего исследования являлись оценка диагностической эффективности новой многопараметрической коммерческой системы «Панель-ОМ1» и сопоставление уровней маркеров с результатами, полученными в мультиплексной системе «ОМ-биочип» и в традиционных имму-ноферментных системах, рассчитанных на определение одного опухолевого маркера.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Пациенты и образцы сыворотки крови
В исследование включены 95 пациентов с установленными диагнозами, из них 61 больной со злокачественными новообразованиями (колоректальный рак — у 38, рак желудка — у одного, рак яичников — у 8, рак молочной железы — у 14), 27 больных с доброкачественными новообразованиями и неопухолевыми заболеваниями (полипоз кишечника — у 7, хронический колит — у 3, хронический панкреатит — у 9, цирроз печени — у 4, дивертикулез кишечника — у одного, ревматизм — у 2, ишемическая болезнь сердца — у одного) и 7 здоровых доноров.
© Рябых Т. П., Осипова Т. В., Соколова З. А., Паклин Н. Б., Грабко В. И., 2011 УДК 616.006.6:577.2.088:616-71
Для 90 пациентов были получены данные о возрасте. Средний возраст составил 57 ± 11,9 года в группе больных со злокачественными новообразованиями и 66 ± 15,9 года в контрольной группе.
Образцы крови онкологических больных были предоставлены лабораторией клинической иммунологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, образцы крови больных неопухолевыми заболеваниями получены в ГКБ №60 г. Москвы, образцы крови здоровых доноров — в гематологическом научном центре РАМН и в НИИ СП им. Н. В. Склифосовского.
Сыворотку получали путем центрифугирования образцов крови при 1500 g в течение 15 мин с последующим замораживанием и хранением при температуре —80 °С вплоть до проведения анализа.
Мультиплексные диагностические системы
В работе использовали диагностические системы на основе технологии x-МАР и на основе планарных гидрогелевых микрочипов.
Диагностическая система на основе xMAP (Multianalyte Pгofiling)-технологии. Технология xMAP (суспензионные биочипы) предполагает использование микросфер (гранул из полистирола диаметром 5,6 мкм) в качестве твердой фазы для иммобилизации моноклональных антител. Образец (сыворотку крови) вносят в ячейку 96-луночного планшета, в которой происходит иммуноанализ с использованием микросфер. Внутри каждой микросферы содержится смесь красного и инфракрасного красителей в определенных соотношениях. На микросфере, содержащей на своей поверхности карбоксильные группы, способные вступать в реакцию с образованием ковалентных связей с лигандами, иммобилизуют захватывающие антитела, которые специфически связывают определенную компоненту аналита (в нашем случае — опухолевого маркера). Затем к реакционной смеси добавляют биотинилированные вторичные антитела, также специфически взаимодействующие с компонентой ана-лита. После этого добавляют конъюгат стрептавидина с фикоэритрином, что позволяет регистрировать сигнал флуоресценции фикоэритрина на тех микросферах, на которых произошло первичное связывание интересующей компоненты аналита. Анализ осуществляется на специальном лазерном проточном анализаторе флуоресцентных сигналов. Выпускаемые в настоящее время системы теоретически позволяют проводить количественное определение до 100 различных аналитов за один анализ [6].
В работе использовали коммерческую систему «Панель-ОМ1» фирмы «Novagen» (США), рассчитанную на одновременное определение 6 опухолевых маркеров: АФП, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, РЭА и пролактина. Регистрацию флуоресцентных сигналов от микросфер проводили с помощью автоматизированного мультиплексного иммуноанализатора «BioPlex System». Анализ результатов выполняли с использованием компьютерной программы «BioPlex Manager Software 4.1.4» и пакета прикладных программ Microsoft Excel 2003.
Диагностическая система на основе технологии гидрогелевых микрочипов. Используемая в работе система в формате микрочипа на основе трехмерных гидрогелей [5] «ОМ-биочип» предназначена для одновременного
Таблица 1
Характеристики опухолевых маркеров [20]а
Название маркера Повышенные уровни у больных злокачественными опухолями Границы нормы Патологические значения
полное сокращенное
Раковоэмбриональный антиген РЭА Колоректальный рак, рак желудка, легкого, мочевого пузыря, метастазы в печени 0—5 нг/мл > B нг/мл
Альфа-фетопротеин АФП Первичный рак печени, яичников, опухоли яичка, метастазы в печени, тератома и др. 0—5 ME/мл > 10 ME/мл
Раковый антиген СА 125 CA 125 Рак яичников, матки, молочной железы, поджелудочной железы, печени, желудка, колоректальный рак и др. 0—30 ME/мл > 40 ME/мл
Раковый антиген СА 15-3 СА 15-3 Рак молочной железы, бронхогенная карцинома, рак желудка, печени, яичников, поджелудочной железы, матки 0—22 ME/мл > 30 ME/мл
Раковый антиген СА 19-9 СА 19-9 Рак поджелудочной железы, желчного пузыря, печени, желудка, молочной железы, яичников, матки, колоректальный рак, метастазы в печени 0—30 ME/мл > 40 ME/мл
Пролактин (гормон, основным органом-мишенью которого являются молочные железы) Пролактин Опухоли гипофиза, пролактиномы 1 —25 нг/мл (женщины). 1—20 нг/мл (мужчины) > 100 нг/мл
а Опухолевые маркеры и их обследование. — Prague: Immunotech Info Line
количественного определения 6 опухолевых маркеров: ПСАобщ., ПСАсв., АФП, РЭА, НСЕ и ХГЧ (разработана в ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН, наборы приобретены в
ООО «Биочип-ИМБ»). Каждый биочип представляет собой матрицу трехмерных полусферических гелевых элементов, разделенных между собой гидрофобной поверхностью предметного стекла, в которых иммобилизованы моноклональные антитела к опухолевым маркерам, а также соответствующие антигены [8].
Концентрации антигенов определяли с помощью сэндвич-варианта иммуноанализа (одностадийный вариант) с флуоресцентной детекцией. На микрочип с иммобилизованными моноклональными антителами наносили раствор антигена или сыворотки крови одновременно со смесью вторых моноклональных антител к шести опухолевым маркерам, меченных флуоресцентным красителем (Cy 5). Флуоресцентные сигналы анализировали с помощью портативного лазерного анализатора биочипов «Чипдетектор-01» (ИМБ РАН, Россия).
Анализ с помощью иммуноферментных тест-систем. В качестве систем сравнения использовали иммунометри-ческие тест-системы на СА 125, СА 15-3, СА 19-9, АФП, РЭА («CanAg», «Fujirebio Diagnostics», Швеция) и на про-лактин («DRG Diagnostics», Германия).
Статистический анализ. Рассматривали способность новой системы отличать больных со злокачественными новообразованиями от контрольной группы: больных с доброкачественными новообразованиями, неопухолевыми заболеваниями и здоровых доноров. При оценке диагностической эффективности тест-системы применяли ли-
нейный регрессионный, многофакторный логистический регрессионный анализ и анализ характеристических кривых (Receiver Operating Characteristic curve analysis, ROC-анализ) [9; 10]. Для каждого отдельного маркера, а также для комбинации опухолевых маркеров были построены ROC-кривые — графики зависимости доли истинноположительных случаев (чувствительность теста) от доли ложноположительных случаев (100 — специфичность) при различных пороговых величинах. ROC-кривые сравнивали с помощью определения площади под кривыми — AUC (Area Under Curve), которая изменялась от 0,5 (диагональ, проходящая через начало координат, — минимальная площадь под кривой, минимальная диагностическая эффективность) до 1 («идеальная» модель, максимальная площадь под кривой, максимальная диагностическая эффективность).
Статистические расчеты были выполнены с использованием статистического пакета MedCalc для Windows, версия 9.3.5.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Поскольку диагностическая система для анализа опухолевых маркеров «Панель-ОМ1» («Novagen», США) появилась на отечественном рынке впервые, мы сочли необходимым провести валидизацию новой системы: сопоставление полученных результатов с «золотым стандартом». Мы сравнили уровни опухолевых маркеров в образцах, получаемые при их одновременном определении с помощью новой системы, с концентрациями, получаемыми для тех же образцов в традиционных иммунофер-
ментных системах (ИФА-системах), предназначенных для определения одного опухолевого маркера. Полученные результаты были проанализированы с помощью линейной регрессии и оценки коэффициента корреляции.
Согласно данным, представленным в табл. 2, имеется значимая корреляция уровней маркеров, измеренных в системах двух видов: коэффициенты корреляции изменяются от 0,616 для АФП до 0,978 для СА 125 (р < 0,0001). Абсолютные значения уровней маркеров, измеренных в новой системе (y в уравнении регрессии), достаточно близки к уровням, измеренным в ИФА-системах (x в уравнении регрессии): коэффициенты при x изменяются от 0,75 до 1,89, т. е. близки к 1. Исключение составляет CA 19-9: уровни маркера, измеренные в системе «Панель-ОМ1», занижены по сравнению с концентрациями, измеренными в системе «Fujirebio Diagnostics», в 3 раза (коэффициент при x равен 0,3). При этом коэффициент корреляции уровней маркера, измеренных в двух системах, весьма высок: 0,871 (р < 0,0001).
Следовательно, данные, полученные для каждого опухолевого маркера при их одновременном определении в мультиплексной системе, сопоставимы с данными, полученными при измерении каждого индивидуального маркера в соответствующей ИФА-системе.
Поскольку две изучаемые нами диагностические системы — зарубежная («Панель-ОМ1») и отечественная («ОМ-Биочип») — были рассчитаны, в частности, на определение двух одинаковых опухолевых маркеров — АФП и РЭА, представляло интерес провести сопоставление результатов их определения в двух мультиплексных системах.
Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о корреляции уровней РЭА и АФП, измеренных в двух системах: коэффициенты корреляции составляют 0,828 и 0,768 соответственно (р < 0,0001).
Следовательно, данные, полученные в новой диагностической системе, сопоставимы с результатами, получен-
Таблица 2
Уровни опухолевых маркеров, измеренные в одних и тех же образцах сыворотки крови с помощью системы «Панель-ОМ1» («Novagen, США) и соответствующих ИФА-систем: результаты регрессионного и корреляционного анализа
Таблица 3
Уровни АФП и РЭА, измеренные в образцах сыворотки крови в системах «Панель-ОМ1» и «ОМ-Биочип»: результаты регрессионного и корреляционного анализа
Маркер Число образцов сыворотки Уравнение регрессии r p
РЭА 59 y = 0,82x + 3,72 0,828 < 0,0001
АФП 64 y = 0,51x + 2,06 0,768 < 0,0001
ными в другой мультиплексной системе — отечественной системе «ОМ-Биочип».
Результаты сравнения с традиционными ИФА-системами и с системой в формате микрочипа позволили перейти к оценке диагностической эффективности новой системы.
Диагностическая эффективность системы — это ее способность разграничивать обследуемые группы, например больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы (здоровых доноров, больных с доброкачественными новообразованиями и неопухолевыми заболеваниями).
В настоящее время наилучшим способом оценки диагностической эффективности системы является так называемый ROC-анализ [9; 10]. Он позволяет, во-первых, оценить чувствительность (долю истинно положительных случаев от общего числа положительных случаев) и специфичность (долю истинно отрицательных случаев от общего числа отрицательных случаев) теста, а во-вторых, сопоставить диагностическую эффективность нескольких тестов с помощью сравнения площади под ROC-кривыми (AUC). В зависимости от величины площади под кривой качество диагностической системы имеет несколько градаций от неудовлетворительного (AUC 0,5—0,6) до отличного (AUC 0,9—1).
При оценке диагностической эффективности мультиплексных систем, каковыми являются микрочипы, был применен математический аппарат множественной логистической регрессии [10].
Оценивали, насколько эффективно новая система способна разграничивать больных со злокачественными новообразованиями и без таковых. Эффективность модели оценивали на основании величины площади под ROC-кривой.
На рис. 1 представлены ROC-кривые для каждого из нескольких опухолевых маркеров, измеренных в системе «Панель-ОМ1», и комбинации из 6 опухолевых маркеров, полученной с помощью логистического регрессионного анализа (LR6). Видно, что ROC-кривая LR6 расположена к верхнему левому углу графика, соответствующему 100% чувствительности и 100% специфичности ближе, чем ROC-кривые для каждого индивидуального маркера. Величины площади под ROC-кривыми представлены в табл. 4. Из нее видно, что площади под кривыми для каждого из 6 опухолевых маркеров, за исключением РЭА, находятся в пределах 0,553—0,634. Это свидетельствует о неудовлетворительной, статистически незначимой диагностической эффективности каждого индивидуального маркера.
Маркер Число образцов сыворотки крови Уравнение регрессии r p
РЭА 87 y = 1,71x - 2,64 0,949 < 0,0001
СА125 37 y = 0,81x + 8,05 0,978 < 0,0001
СА 15-3 36 y = 0,85x + 2,72 0,892 < 0,0001
СА 19-9 64 y = 0,3x + 4,33 0,871 < 0,0001
АФП 81 y = 0,75x + 1,26 0,616 < 0,0001
Пролактин 36 y = 1,89x - 9,08 0,850 < 0,0001
Специфичность, %
Рисунок 1. Результаты сопоставления диагностической эффективности мультиплексной системы «Панель-ОМ1» (6 переменных) с эффективностью единичных опухолевых маркеров посредством определения площади под ROC-кривыми: разграничение больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы. _Я6: АФП + СА 125 + СА 15-3 + СА 19-9 + РЭА + пролактин. 1 — _Я6; 2 — РЭА; 3 — СА 19-9; 4 — СА 125; 5 — АПФ; 6 — СА 15-3.
Площадь под кривой для РЭА составляет 0,787, что указывает на эффективность этого маркера. Возможно, это связано с преобладанием больных колоректальным раком в исследуемой группе. Площадь под кривой LR6, соответствующей комбинации из 6 опухолевых маркеров, составляет 0,856 и достоверно превышает площади под ROC-кривыми для каждого из 6 индивидуальных опухолевых маркеров (см. табл. 4).
Использование дополнительного параметра «возраст пациента» позволяет увеличить площадь под ROC-кривой до 0,920, что свидетельствует об отличной диагностической эффективности системы из 7 маркеров (LR7). Эта площадь значительно превосходит площади для всех 7 переменных (рис. 2.; см. табл. 4) и практически приближается к 1.
Поскольку из всех индивидуальных маркеров наибольшую площадь под ROC-кривой и, следовательно, наибольшую диагностическую эффективность имел РЭА, чувствительность и специфичность этого маркера на изучаемом массиве данных были сопоставлены с чувствительностью и со специфичностью комбинаций маркеров, полученных с помощью логистического регрессионного анализа (табл. 5). Обычно проводят сравнение специфичности теста при одинаковом значении чувствительности (близком или равном 90%). Из табл. 5 видно, что комбинация из 6 опухолевых маркеров позволяет получить более высокую специфичность по сравнению с использованием одного РЭА (48,44% против 31,25%), тогда как использование 7 маркеров позволяет увеличить специфичность до 68,75%.
Следовательно, результаты оценки диагностической чувствительности и специфичности, а также площади под
о Ы—|--------1----1-----1----1----1----1-----1----1------
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Специфичность, %
Рисунок 2. Сопоставление диагностической эффективности мультиплексной системы «Панель-ОМ1» (7 переменных) с эффективностью единичных опухолевых маркеров посредством определения площади под ROC-кривыми: разграничение больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы. _Я7: _Я6 + возраст пациента. 1 — _Я7; 2 — РЭА; 3 — СА 19-9; 4 — СА 125; 5 — АПФ; 6 — СА 15-3.
ROC-кривыми свидетельствуют, что мультиплексная система «Панель-ОМ1» имеет достоверно более высокую диагностическую эффективность по сравнению с единичными опухолевыми маркерами при выявлении больных со злокачественными новообразованиями.
Таким образом, использование коммерческой мультиплексной системы «Панель-ОМ1» позволяет увеличить диагностическую эффективность по сравнению с использованием систем, предназначенных для определения единичных опухолевых маркеров.
обсуждение
Опухолевые маркеры призваны помочь ответить на вопросы клинициста, первыми из которых являются: 1) имеется ли у пациента злокачественное новообразование; 2) если да, то какой орган поражен [11; 12]. Поскольку большинство индивидуальных опухолевых маркеров не обладает чувствительностью и специфичностью, достаточными для ответа на эти вопросы, в последнее время большие надежды связывают с микрочипами — мультиплексными системами, позволяющими одновременно определять сразу несколько опухолевых маркеров [13; 14].
Нами показано, что отечественная диагностическая система «ОМ-биочип» на 6 опухолевых маркеров по сравнению с использованием каждого единичного маркера позволяет существенно повысить диагностическую эффективность [7]. В настоящей работе аналогичные результаты получены для другой комбинации опухолевых маркеров и другой — зарубежной коммерческой мультиплексной — системы, основанной на применении суспензионных микрочипов.
В последнее время в печати появилась серия работ, в которых различные системы, основанные на технологии суспензионных чипов, применяют для анализа опухолевых маркеров в сыворотке крови [15—17], слюне [18] и слезной жидкости [19] и сопоставляют уровни измеренных биомаркеров с концентрациями, полученными в традиционных однопараметрических системах ELISA [18]. Показано, что предлагаемые авторами панели из нескольких опухолевых маркеров эффективны при выявлении ранних стадий рака яичников [16] и немелкоклеточного рака легкого [17].
заключение
Новая диагностическая система на основе суспензионных микрочипов «Панель-ОМ1» для одновременного определения 6 опухолевых маркеров позволяет получать данные, которые коррелируют с результатами, полученными при измерении каждого индивидуального маркера в соответствующей иммуноферментной системе, а также с результатами, полученными в системе на основе планарных микрочипов «ОМ-биочип».
На значительном массиве образцов сыворотки крови показано, что по сравнению с системами, использующими единичные маркеры, новая система позволяет достоверно увеличить диагностическую эффективность при разграничении больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы.
Таблица 4
Результаты оценки диагностической эффективности системы «Панель-ОМ1» посредством определения площади под ROC-кривой: разграничение больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы
Маркер Площадь под ROC-кривой p
отличия от LR6 отличия от LR7
АФП 0,553 (0,442—0,660) < 0,001 < 0,001
СА 125 0,602 (0,491—0,706) < 0,001 < 0,001
СА 15-3 0,539 (0,428—0,647) < 0,001 < 0,001
СА 19-9 0,634 (0,523—0,735) 0,002 < 0,001
РЭА 0,787 (0,686—0,868) 0,046 < 0,003
Пролактин 0,591 (0,480—0,696) 0,001 < 0,001
Возраст пациента 0,676 (0,566—0,773) 0,027 < 0,001
LR6 0,856 (0,764—0,922) — 0,040
LR7 0,920 (0,841—0,967) — —
LR6 — АФП + СА125 + СА 15-3 + СА 19-9 + РЭА + пролактин; LR7 — то же + возраст пациента.
Таблица 5
Чувствительность и специфичность РЭА и комбинаций маркеров, полученных с помощью логистического регрессионного анализа при разграничении на больных со злокачественными новообразованиями и пациентов контрольной группы
Маркер Чувствительность, % Специфичность, %
РЭА 89,83 31,25
LR6 89,83 48,44
LR7 90,74 68,75
Полученные нами результаты и данные литературы свидетельствуют в пользу того, что применение мультиплексных диагностических систем в формате планарных и суспензионных микрочипов для анализа опухолевых маркеров позволит существенно улучшить диагностику рака, а это в конечном счете приведет к повышению эффективности лечения онкологических больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абелев Г. И. Иммунология опухолей человека // Канцерогенез / Под ред. Д. Г. Заридзе.— М.: Медицина, 2004. — С. 474—482.
2. Optimal combination of seven tumor markers in prediction of advanced stage at first examination of patients with non-small cell lung cancer / Ando S., Kimura H., Iwai N., Shima М., Ando М., Kuriyama T. // Anticancer Res. — 2001. — Vol. 21. — P. 3085—3092.
3. The predictive value of a combination of tumor markers in monitoring patients with ovarian cancer / Lahousen М., Stettner H., Pickel H., Urdl W., Purstner P. // Cancer. — 1987. — Vol. 60, N 9. — P. 2228—2232.
4. Clinical significance of the number of positive tumor markers in assisting the diagnosis of lung cancer with multiple tumor marker assay / Muzushima Y., Hirata H., Isumi S., Hoshino K., Konishi K., Mori-kage T., Maruyama M., Yamashita N. and Yano S. // Oncology. — 1990. — Vol. 47. — P. 43—48.
5. Мирзабеков А. Д., Рубина А. Ю., Паньков С. В. Композиция для полимеризационной иммобилизации биологически значимых соединений и способ ее осуществления /Пат. W0 03/033539 // Бюл. изобр. — 2003. — № 32.
6. Vignali D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays // J. Immunol. Methods. — 2000. — Vol. 243, N 1—2. — P. 243—255.
7. Диагностика рака с использованием системы в формате микрочипа для одновременного количественного определения шести опухолевых маркеров / Рябых Т. П., Соколова З. А., Паклин Н. Б., Осипова Т. В. // ДАН. — 2011. — Т. 437, № 5. — С. 1—4.
8. Биологический микрочип для одновременного количественного иммунологического анализа маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека / Саватеева Е. Н., Дементьева Е. И., Цыбульская М. В., Осипова Т. В., Рябых Т. П., Турыгин А. Ю., Юра-сов Р. А., Заседателев А. С., Рубина А. Ю. // Бюл. экспер. биол. — 2009. — Т. 147, № 6. — С. 679—683.
9. Zweig M. H., Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine // Clin. Chem. — 1993. — Vol. 39. — P. 561—577.
10. Паклин Н., Орешков В. Бизнес-аналитика: от данных к знаниям. — СПб.: Питер, 2009. — 624 c.
11. Diamandis E. P. Tumor markers: past, present, and future // Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical Applications / Diamandis E. P., Fritsche H. A., Lilja H., Chan D. W., Schwartz M. K. (eds.). — Washington, DC: AACC Press, 2002. — P. 3—8.
12. Voorzanger-Rousselot N., Garnero P. Biochemical markers in oncology. Part I: Molecular basis. Part II: Clinical uses // Cancer Treatment Rev. — 2007. — Vol. 33. — P. 230—283.
13. Биочипы для медицинской диагностики / Чечеткин В. Р., Про-
копенко Д. В., Макаров А. А., Заседателев А. С. // Рос. нанотехнол. — 2006. — Т. 1, № 1—2. — С. 13—28.
14. Осипова Т. В., Рябых Т. П., Барышников А. Ю. Диагностические микрочипы: их применение в онкологии // Рос. биотер. журн. — 2006. — Т. 5, № 3. — С. 72—81.
15. Hensley M. L. A step forward for two-step screening for ovarian cancer // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28, N 13. — P. 2128—2130.
16. Development of a multimarker assay for early detection of ovarian cancer / Yurkovetsky Z., Skater S., Lomakin A., Nolen B., Pulsipher T., Modugno F., Marks J., Godwin A., Gorelik E., Jacobs I., Menon U., Lu K., Badgwell D., Bast Jr R. C., Lokshin A. E. // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28, N 13. — P. 2159—2166.
17. A multy-analyte serum test for the detection of non-small cell lung cancer / Farlow E. C., Vercillo M. S., Coon J. S., Basu S., Kim A. W., Fa-
ber L. P., Warren W. H., Bonomi P., Liptay M. J., Borgia J. A. // Br. J. Cancer. — 2010. — Vol. 103. — P. 1221 — 1228.
18. Multiplexed immunobead-based assay for detection of oral cancer protein biomarkers in saliva / Arrelano-Garcia M. E., Hu S., Wang J., Henson B., Zhou H., Chia D., Wong D. T. // Oral Dis. — 2008. — Vol. 14, N 8. — P. 705—712.
19. Sharma R. K., Rogojina A. T., Chalam K. V. Multiplex immunoassay analysis of biomarkers in clinically accessible quantities of human aqueous humor // Mol. Vision. — 2009. — Vol. 15. — P. 60—69.
20. Опухолевые маркеры и их обследование. — Immunotech. A Beckman Coulter Company. Info Line, 1998. — С. 1—27.
Поступила 18.03.2011
Tatiana Pavlovna Ryabykh1, Tatiana Vladimirovna Osipova2, Zinaida Alexandrovna Sokolova3, Nikolay Borisovich Paklin4, Vladimir Ivanovich Grabko5
ASSESSMENT OF DIAGNOSTIC POTENTIALS OF A COMMERCIAL MULTIPLEX SUSPENSION MICROCHIP-BASED SYSTEM FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROTEIN TUMOR MARKERS
1 MD, PhD, DSc, Leading Researcher, Tumor Experimental Diagnosis and Biotherapy Laboratory, Tumor
Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS
(24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
2 MD, PhD, Leading Researcher, Tumor Experimental Diagnosis and Bio therapy Laboratory, Tumor
Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS
(24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
3 Junior Researcher, Tumor Experimental Diagnosis and Biotherapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
4 PhD, Associate Professor, Chair of General, Theoretical Physics and Physics Teaching Methodology,
S. A. Esenin RSU (46, ul. Svobody, Ryazan, RF, 390000)
5 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Biologically Active Nanostructure Laboratory, N. F. Gamaleya Epidemiology and Microbiology Research Institute (18, ul. Gamaleyi, Moscow, RF, 123098)
Address for correspondence: Ryabykh Tatiana Pavlovna, Tumor Experimental Diagnosis and Biotherapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478; e-mail: [email protected]
New microchip-based diagnostic systems are used to measure several tumor markers simultaneously that may help to improve considerably cancer diagnosis. Ninety five sera from cancer patients and control individuals were used to assess diagnostic potentials of a new commercial suspension microchip-based system WideScreen™Human Cancer Panel 1 (Tumor Markers) (Novagen, USA). Tumor marker measurements were compared with those obtained using a Russian multiplex system OM-biochip and conventional single marker enzyme immunoassays. Data obtained with the new system correlated with results of each individual marker measurement made with a respective enzyme immunoassay (r 0.616 to 0.978; p < 0.0001) and results obtained using a planar microchip-based system OM-biochip (r 0.768 to 0.828; p < 0.0001). The patient population was divided into cancer and control groups on the basis of ROC- and logistic regression analyses. Assessment of diagnostic sensitivity and specificity and measurement of area under the ROC curve demonstrated that the new 6-marker age-specific system has a significantly higher diagnostic efficacy as compared to single-marker systems (areas under ROC curves 0.920 and 0.553—0.787, respectively; p < 0.003). It is therefore may be expect that multiplex microchip-based diagnostic systems for tumor marker measurement may help to improve considerably cancer diagnosis.
Key words: biologic microchips, tumor markers, diagnosis, ROC-analysis.
