CC BY
24
УДК 577.15:579.8
Б01 10.19110/1994-5655-2021-5-72-77
Й.Й. ШУБАКОВ, В.В. ВОЛОДИН, С.О. ВОЛОДИНА, В.В. МАРТЫНОВ
СТУПЕНЧАТЫЙ ОТБОР ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ 00 ЦЕЛЛЮЛА300Й АКТИВНОСТИ КОЛОНИЙ ГРИБА ТШНООЕШ ШШЕ
Институт биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН,
г. Сыктывкар
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
A.A. SHUBAKOV, V.V. V0L0DIN, S.O. VOLODINA, V.V. MARTYN0V
STEP BY STEP SELECTION OF HIGHLY PRODOCTIVE BY CELLOLASE ACTIVITY COLONIES OF FUNGUS TRIERRRERMA
MIRE
Institute of Biology, Federal Research Centre Komi Science Centre, Ural Branch, RAS,
Syktyvkar
Аннотация
В работе представлены результаты проведенного ступенчатого отбора высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10 (F-120). Для получения и отбора колоний Т. viride 13/10 использовали плотные питательные среды, в которых источниками углерода являлись растворимые субстраты (2 % сахароза, 2 % на-трий-карбоксиметилцеллюлоза) и нерастворимые, трудногидролизуемые субстраты (фильтровальная бумага Ватман № 1 и целлюлоза производства «Монди Сыктывкарский ЛПК»). Целлюлазную активность колоний Т. viride 13/10 оценивали по осахариванию фильтровальной бумаги. В результате проведенной по разработанной нами схеме селекции штамма Т. viride 13/10 удалось увеличить целлюлазную активность штамма по сравнению с его исходной активностью в 6,2-7,0 раза. Дальнейшая селекция, особенно с использованием мутагенных факторов, может еще более повысить уровень синтеза целлюлаз культурой гриба Т. viride.
Ключевые слова:
грибы, Trichoderma viride, целлюлазы, селекция
Abstract
The paper presents the results of the stepwise selection of highly productive by cellulase activity colonies of the fungus Trichoderma viride ARCIM 13/10 (F-120). To obtain and select T. viride 13/10 colonies, dense nutrient media were used, in which the carbon sources were soluble substrates (2 % sucrose, 2 % sodium carboxy-methyl cellulose) and insoluble, hardly hydroly-zeble substrates (Whatman No. 1 filter paper and cellulose produced by JSC «Mondi Syktyvkar Timber Industry Complex»). Cellulase activity of T. viride 13/10 colonies was assessed by saccharification of filter paper. As a result of the selection of the T. viride 13/10 strain carried out according to the scheme developed by us, it was possible to increase the cellulase activity of the strain in comparison with its initial activity by 6,2-7,0 times. Further selection, especially with the use of mutagenic factors, can further increase the level of cellulase synthesis by the culture of the fungus T. viride.
Keywords:
fungi, Trichoderma viride, cellulases, selection
Введение
Ферментативный гидролиз целлюлозы происходит в результате последовательно-параллель-ного действия нескольких ферментов, входящих в
состав так называемого целлюлазного комплекса [1-4]. Целлюлазы, катализирующие гидролиз (5-1,4-гликозидных связей целлюлозы, принадлежат к группе гликозидгидролаз и состоят из трех основных типов ферментов: эндоглюканазы (КФ 3.2.1.4), целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91) и р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21). Эндоглюканазы неупорядоченно гид-ролизуют в целлюлозе р-1-4-гликозидные связи с образованием целлоолигосахаридов. Целлобиогидролазы отщепляют целлобиозу с нередуцирующих концов целлоолигосахаридов, а р-глюкозидазы, или целлобиазы, гидролизуют целлобиозу, высвобождая две молекулы глюкозы [1, 5, 6].
Наиболее известными и используемыми в промышленности продуцентами целлюлаз являются грибы рода Тпс1пос1егта (Т. гееэе/, Т. v¡r¡de). Они конвертируют целлюлозную биомассу до глюкозы, которая может быть использована для различных целей, таких как производство биоэтанола, в кормах для животных, в очистке сточных вод и пивоваренной промышленности [7, 8].
Одной из проблем промышленной биотехнологии является то, что многие штаммы-продуценты ферментов, в том числе и целлюлаз, в процессе периодических пересевов снижают свою активность. Это уменьшает выход целевого продукта и отрицательно сказывается на экономике производства. Решением данной проблемы является селекция высокопродуктивных штаммов-продуцентов ферментов [9].
То есть, наряду с поиском новых микроорганизмов с высоким уровнем биосинтеза внеклеточных ферментов, значительное развитие получили исследования по селекции более активных мутантов как новых, так и отобранных ранее [10].
Начало интенсивной селекции штаммов-про-дуцентов гидролитических ферментов было положено в 70-х г. XX в. работами Мандельс с сотрудниками, сообщившими о получении двух мутантов гриба Тпс1юс1егта гееэе/, обладавших высокой цел-люлазной активностью. Авторы использовали традиционный селекционный прием обработки штамма дикого типа мутагенными факторами в сочетании со ступенчатым отбором. В результате общую активность внеклеточных целлюлаз, образуемых этой культурой, удалось повысить сначала в два, а затем еще в 1,4 раза [11, 12].
Для получения высоких уровней активности внеклеточных ферментов целлюлаз проводят оптимизацию параметров ферментации микроорганизмов - продуцентов ферментов, включая состав питательной среды для культивирования, оптимальные время культивирования, рН среды и температура культивирования [13]. Для повышения выхода целлюлаз, их активности и стабильности используют различные методы селекции и мутагенеза [14, 15].
Цель работы - отбор высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний штамма Тпс1по-с1егта ч'1пде ВКПМ Р-13/10 на основе трудногидро-лизуемых целлюлозных материалов - фильтровальная бумага и целлюлоза производства «Монди Сыктывкарский ЛПК».
Материалы и методы
Объект исследования - продуцент целлюло-литических ферментов штамм мицелиального гриба ТпсЬос1егта чШе ВКПМ 13/10 (Р-120). Культуру поддерживали на агаризованной среде Ролена-Тома (РТ) при температуре +4° С.
В качестве посевного материала использовали споровые суспензии Т. ч'1пде 13/10 в стерильной дистиллированной воде. Засев производили в расчете 0,5 мл споровой суспензии на 100 мл жидкой питательной среды. За основу была принята питательная среда Ролена-Тома (РТ) следующего состава (%): С4Н406(МН4)2 - 0,33; КН2Р04 - 0,2; К2304 - 0,02; Мд304х7Н20 - 0,02; кукурузный экстракт - 1,0; раствор микроэлементов - 0,1 мл на 100 мл среды. Раствор микроэлементов имел следующий состав (%): Мп304*5Н20 - 0,008; Си304х 5Н20 - 0,04; гп304х7Н20 - 0,08; Со(Ы03)2х6Н20 -0,01; Ре304х7Н20 - 0,1; (ЫН4)6Мо7024х4Н20 - 0,03; Н3В03- 0,006; СаС12х6Н20 - 0,1.
Другой питательной средой для культивирования Т. У1пде 13/10 служила разработанная нами среда, обозначенная как среда № 1, следующего состава (г/л): (1ЧН4)2304 - 5,0; Мд304*7Н20 - 0,5; КН2Р04 - 2,0; раствор микроэлементов - 0,1 мл на 100 мл среды. Раствор микроэлементов имел состав, аналогичный таковому для среды РТ.
Легкометаболизирумыми источниками углерода в среде для культивирования Т. ч'1пде являлись сахароза (2 %) или Ыа-карбоксиметилцеллю-лоза (Ыа-КМЦ, 2 %). Трудногидролизуемыми лигно-целлюлозными материалами служили фильтровальная бумага Ватман № 1 и целлюлоза производства «Монди Сыктывкарский ЛПК».
При получении плотной агаризованной среды к жидкой среде добавляли 3 % агара.
Культуру гриба выращивали в колбах при перемешивании (220 об/мин) с объемом питательной среды 100 мл при 24° С. Исходное значение рН среды было 5,0 без дальнейшего регулирования в процессе культивирования.
Общую целлюлазную активность по осахари-ванию фильтровальной бумаги (АФБ) определяли по методу Родионовой с соавт. [16]. Полоски фильтровальной бумаги размером 1 смхб см помещали в две стеклянные пробирки, в которые добавляли 1 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера (рН 5,0) и 1 мл соответствующе разбавленного ферментного раствора. Пробирки инкубировали в водяном термостате при 50 °С в течение 1 ч., после чего из каждой пробирки отбирали по 1 мл раствора и определяли в них редуцирующие сахара по методу Нельсона-Шо-моди [17, 18]. За одну единицу АФБ принимали такое количество фермента, которое освобождало при данных условиях из фильтровальной бумаги 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за 1 ч.
Вес сухой биомассы определяли центрифугированием грибных культур в пробирках Эппен-дорфа, после чего пробирки высушивали до постоянного веса при 60 °С.
Цифровые данные в статье представляют собой средние величины, полученные в результате
трех независимо проведенных друг от друга экспериментов.
Результаты и обсуждение
Метод одно- и многоступенчатого отбора, применяемый в научных исследованиях при селекции высокоактивных продуцентов ферментов, довольно трудоемок и для получения штаммов со значительным увеличением активности ферментов требуется продолжительное время. Поэтому для ограничения числа вариантов, проверяемых в ходе отбора, создают селективные условия для первичной оценки мутантов по признаку, легче тестируемому, чем продуктивность культуры в отношении биосинтеза ферментов. В этом случае отбор мутантов проводят на агаризованных средах с трудноме-таболизируемым субстратом, основываясь на признаке размера колоний. У более крупных колоний затем проверяют активность ферментов [11, 19]. Поэтому в нашей работе в процессе ступенчатого отбора высокоактивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride в качестве трудно-метаболизируемых субстратов мы использовали фильтровальную бумагу Ватман № 1 и целлюлозу, произведенную на «Монди Сыктывкарский ЛПК».
Определение исходной целлюлазной активности гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10 (F-120). Исходная культура Т. viride 13/10 в течение более чем 20 лет хранилась в пробирках на скошенной агаризованной среде Ролена-Тома РТ с 2 % сахарозы при температуре +4 °С при регулярных пересевах на свежие питательные среды один раз в два-три месяца. В пробирку с культурой Т. viride
Таблица 1
Исходная общая целлюлазная активность по осахариванию фильтровальной бумаги (АФБ) штамма Trichoderma viride 13/10
Table 1
Initial total cellulase activity for saccharification of filter paper (FPA)of strain Trichoderma viride 13/10
Время, сутки Вес сухой биомассы,г/л АФБ,ед/мл Удельная АФБ,ед/мг с.б.
4 2,7 0,8 0,3
5 3,0 0,9 0,3
Таблица 2
АФБ отобранных no морфологическим показателям роста колоний Trichoderma viride 13/10 через двое суток культивирования в жидкой среде РТ с 2 % сахарозы
Table 2
FPA of Trichoderma viride 13/10 colonies selected according to morphological growth parameters after 2 days of cultivation ina liquid RT medium with 2 % sucrose
Колония Вес сухой биомассы, г/л АФБ, ед/мл Удельная АФБ, ед/мг с.б.
1-1 12,9 1,4 0,11
1-2 11,6 1,3 0,11
2-1 11,9 0,8 0,07
2-2 12,8 0,5 0,04
3-1 11,4 0,1 0,01
3-2 11,3 0,2 0,02
13/10 добавляли 5 мл стерильной дистиллированной воды с целью получения суспензии спор. Из пробирки со споровой суспензией Т. ^¡пде были засеяны колбы со 100 мл жидкой питательной среды РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы. Засев производили из расчета 0,5 мл споровой суспензии на 100 мл среды. Культивирование проводилось на качалке (220 об/мин) при температуре 24 °С. Через 4 и 5 суток были определены вес сухой биомассы и в фильтратах культу-ральной жидкости - общая целлюлазная активность по осахариванию фильтровальной бумаги -АФБ (табл. 1).
Как видно из табл. 1, исходная целлюлазная активность культуры гриба Т. \ziride составляла 0,8-0,9 ед/мл АФБ, а удельная АФБ - 0,3 ед/мг с.б.
Культивирование Т. viride 13/10 на плотной агаризованной среде. На 1-м этапе ступенчатого отбора культуру гриба Т. \ziride рассевали в чашки Петри на поверхности плотной агаризованной среды РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы, с целью получения изолированных колоний. Исходная споровая суспензия гриба была разведена в 10е раз. Затем отбирали по 0,1 мл разведенной споровой суспензии и растирали ее стерильным шпателем Дригальского в чашках Петри по поверхности плотной среды. Выращивание колоний проводили в термостате при 28 °С. Каждая отдельная спора Т. \ziride давала отдельную, изолированную колонию и через семь суток культивирования отбирали колонии визуально по морфологическим признакам (диаметр колонии) с наилучшими, и в качестве контроля - со средними и наихудшими показателями роста. Отобранные колонии были обозначены следующим образом: 1-1, 1-2 - колонии с наилучшими показателями роста; 2-1, 2-2 - со средними показателями; 3-1, 3-2 - колонии с наихудшими показателями роста.
Отобранные колонии Т. \ziride культивировали в жидкой питательной среде РТ с 2 % сахарозы. Предварительно из центра каждой колонии гриба микробиологической иглой были вырезаны диски с культурой, которые были перенесены в соответствующую колбу с жидкой средой РТ. После двух суток культивирования определяли вес сухой биомассы и общую целлюлазную активность (табл. 2).
Как видно из табл. 2, колонии с наилучшими морфологическими показателями роста синтезировали больше всего целлюлаз. АФБ их составляет 1,3-1,4 ед/мл, а удельная АФБ - 0,11 ед/мг сухой биомассы (с.б.). Несколько ниже целлюлазная активность была в фильтратах после культивирования колоний со средними показателями роста: 0,5-0,8 ед/мл АФБ и удельная АФБ -0,04-0,07 ед/мг с.б. Колонии с наихудшими морфологическими показателями роста обладали довольно низкой целлюлазной активностью на порядок ниже по сравнению с колониями с наилучшими морфологическими показателями роста: 0,1-0,2 ед/мл АФБ, удельная АФБ - 0,01-0,02 ед/мг с.б.
Таким образом, АФБ колоний с наилучшими морфологическими показателями роста увеличилась от исходной 0,7-0,8 до 1,3-1,4 ед/мл.
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что у штамма Т. чШе 13/10 обнаруживается взаимосвязь между интенсивностью роста культуры и синтезом целлюлолитических ферментов. Чем более активный рост культуры на плотной среде, тем более интенсивно происходит синтез целлюлаз.
Культивирование Т. у1пс!е 13/10 на плотной агаризованной среде с трудногидролизуемым лигноцеллюлозным материалом. На втором этапе селекции культуры Т. \ziride 13/10, отобранные по морфологическим показателям роста, пересевали из колб в чашки Петри с агаризованной средой РТ, содержащей в качестве источника углерода трудногидролизуемый субстрат - фильтровальную бумагу Ватман № 1 (ФБ) или целлюлозу (Ц) производства «Монди Сыктывкарский ЛПК». В плотной среде вырезали лунки, в которые засевали культуры Т. v¡r¡de (1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1, 3-2): по 0,2 мл культуры из колб в каждую лунку. После этого чашки Петри помещали в термостат для выращивания при 28 °С в течение 10 суток.
Таблица 3
АФБ выросших на плотной среде РТ с трудногидролизуемым субстратом колоний Trichoderma viride 13/10 через пять суток культивирования в жидкой среде РТ с 2 % сахарозы
Table 3
FPA of colonies of Trichoderma viride 13/10 grown on a dense RT medium with a hardly hydrolysable substrate after 5 days of cultivation in a liquid RT medium with 2% sucrose
Колония Субстрат Вес сухой биомассы, г/л АФБ, ед/мл Удельная АФБ, ед/мг с. б.
1-1 ФБ 6,2 2,0 0,32
1-2 ФБ 9,4 2,4 0,26
2-1 ФБ 7,0 0,7 0,10
2-2 ФБ 9,3 0,7 0,08
3-1 ФБ 7,1 0,1 0,01
3-2 ФБ 7,1 0,3 0,04
1-1 Ц 6,1 2,2 0,36
1-2 Ц 8,7 2,5 0,29
2-1 ц 7,7 0,8 0,10
2-2 Ц 7,9 0,9 0,11
3-1 Ц 7,6 0,2 0,03
3-2 Ц 6,9 0,4 0,06
Таблица 4 АФБ выросших на плотной среде № 1 с фильтровальной бумагой колоний Trichoderma viride 13/10 через пять суток культивирования в жидкой среде № 1 с 2 % Na-КМЦ
Table 4
FPA of colonies of Trichoderma viride 13/10 grown on a dense medium No. 1 with filter paper after 5 days of cultivation in a liquid medium No. 1 with 2 % Na-CMC
Колония Вес сухой биомассы, г/л АФБ, ед/мл Удельная АФБ, ед/мг с. б.
Т-1 4,2 2,8 0,67
Т-2 3,8 2,4 0,63
Т-3 4,5 3,3 0,73
Т^ 4,0 2,6 0,65
Т-5 4,1 2,5 0,61
Далее выросшие в лунках колонии пересевали в колбы с жидкой питательной средой РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы. Через пять суток культивирования Т. \ziride на качалке были определены вес сухой биомассы и в фильтратах - общая целлюлазная активность (табл. 3).
Как видно из табл. 3, после выращивания Т. \ziride на плотной среде с трудногидролизуемым субстратом и дальнейшего культивирования колоний на жидкой среде РТ с 2 % сахарозы общая целлюлазная активность несколько увеличилась как в случае фильтровальной бумаги, так и в случае целлюлозы. АФБ колоний, отобранных по наилучшим морфологическим показателям роста, увеличилась до 2,0-2,5 ед/мл, что выше по сравнению с исходной активностью в 2,9-3,1 раза. АФБ других колоний повысилась незначительно.
Для дальнейшей селекции была отобрана колония 1-2 Т. \ziride 13/10, секретирующая в жидкой среде достаточно большое количество целлюлаз (АФБ 2,4 ед/мл).
Колонию 1-2 пересевали из колбы в чашки Петри с агаризованной средой № 1, содержащей в качестве источника углерода фильтровальную бумагу. В плотной среде вырезали лунки, в которые вносили по 0,2 мл жидкой культуры колонии 1-2 Т. \ziride 13/10. Чашки помещали в термостат при 28 С для выращивания колоний в течение 10 суток.
После этого визуально по морфологическим показателям роста и степени деструкции фильтровальной бумаги были отобраны пять колоний Т. у/лсУе: Т-1, Т-2, Т-3, Т-4, Т-5.
Далее отобранные колонии Т. \ziride пересевали в колбы с жидкой питательной средой № 1, содержащей в качестве источника углерода 2 % Ыа-КМЦ. Через пять суток культивирования при 28 °С были определены вес сухой биомассы и в фильтратах - общая целлюлазная активность (табл. 4).
Как видно из табл. 4, общая целлюлазная активность по сравнению с колонией 2-1 не увеличилась для колонии Т-2 (АФБ 2,4 ед/мл), но у остальных четырех колоний активность возросла до 2,5-3,3 ед/мл.
На основании наибольшей целлюлаз-ной активности (АФБ - 3,3 ед/мл, удельная АФБ -0,73 ед/мг с.б.) для дальнейшей селекции была использована колония Т-3 Т. \ziride 13/10.
В последующих пяти проведенных циклах селекции колония Т-3 Т. \ziride 13/10 рас-севалась на плотную среду № 1 с фильтровальной бумагой. На основании степени гидролиза фильтровальной бумаги отбирались
наиболее активные колонии, АФБ которых проверялась при культивировании в колбах на жидкой среде №1 с 2 % Na-КМЦ.
В результате проведенных экспериментов была отобрана колония Т-36, обладающая наибольшей целлюлазной активностью (АФБ - 5,6 ед/мл, удельная АФБ - 1,4 ед/мг с.б.) по сравнению со всеми другими испытанными колониями Т. viride 13/10.
Культура Т. viride с наибольшей целлюлазной активностью была пересеяна в пробирки со скошенной агаризованной средой РТ для хранения при температуре +4 С. Полученная колония Т. viride с высокой целлюлазной активностью в лиофилизиро-ванном состоянии может храниться долгое время без снижения своей продуктивности.
Заключение
На основании проведенных исследований можно заключить, что в результате ступенчатого отбора высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride отобрана колония с высокой целлюлазной активностью. При этом, общая целлюлазная активность отобранной колонии штамма Т. viride ВКПМ F-13/10 по сравнению с исходной активностью была увеличена в 6,2-7,0 раза. Дальнейшая селекция, особенно с использованием мутагенных факторов, может еще больше повысить уровень синтеза целлюлаз культурой гриба Т. viride.
Исследования проведены в рамках темы НИР ГР NsAAAA-A 17-117121270025-1.
Литература
1. Клесов АЛ., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы III. Закономерности образования глюкозы и целлобиозы при действии полиферментных целлюлазных систем на нерастворимую (природную) целлюлозу // Биоорг. химия. 1981. Т. 7. № 10. С. 1538-1552.
2. Fungal cellulases / С.М. Payne, B.C. Knott, H.B. Mayes, H. Hansson, M.E. Himmel, M. Sand-gren, J. Stahlberg, G.T. Beckham // Chem. Rev. 2015. Vol. 115. P. 1308-1448.
3. Roth J.C.G., Michele Hoeltz M., Benitez L.B. Current approaches and trends in the production of microbial cellulases using residual lignocellulosic biomass: a bibliometric analysis of the last 10 years // Arch. Microbiol. 2020. Vol. 202. P. 935-951.
4. An overview on the recent developments in fungal cellulase production and their industrial applications / A. Singh, S. Bajar, A. Devi, D. Pant // Bioresour. Technol. Rep. 2021. Vol. 14. Article 100652.
5. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology / L.R. Lynd, P.J. Weimer, W.H. van Zyl, I.S. Pretorius // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. Vol. 66. № 3. P. 506-577.
6. Kumar A., Gautam A., Dutt D. Bio technological transformation of lignocellulosic biomass in to industrial products: An Overview // Adv. Biosci. Bio technol. 2016. Vol. 7. P. 149-168.
7. An overview on fungal cellulases with an indus-
trial perspective / S. Sajth, P. Priji, S. Sreedevi, S. Behjamin // J. Nutr. Food Sci. 2016. Vol. 6. № 1. P. 1-13.
8. Microbial cellulases: A review on strain development, purification, characterization and their industrial applications / H. Sher, N. Zeb, S. Zeb, A. Ali, B. Aleem, F. Iftikhar, S.U. Rahman, M.H. Rashid //J. Bacterid. Mycol. 2021. Vol. 8. № 5. P. 1-15.
9. Zhang Y.H.P., Himmel M.E., Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies // Biotechnol. Adv. 2006. Vol. 24. № 5. P. 452-481.
10. Селекция мутантного штамма Aspergillus alliaceus — продуцента пектингидролаз / P.В. Михайлова, А.Г. Лобанок, Л.И. Сапунова, Ж.Ф. Шишко, И.Е. Зенкович // Прикл. био-хим. микробиол. 1998. Т. 34. № 1. С. 83-86.
11. Клесов АЛ Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты // Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. 1988. Т. 10. 224 с.
12. Клесов АЛ., Виноградова Л.Г. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы // Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. 1988. Т. 12. 154 с.
13. Enchanced cellulase production of the Trichoderma viride mutated by microwawe and ultraviolet / X.-H. Li, H.-J. Yang, B. Roy, E.Y. Park, L.-J. Jiang, D. Wang, Y.-G. Miao // Microbiol. Res. 2010. Vol. 165. P. 190-198.
14. Mandels M., Weber J., Parizek R. Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride // Appl. Microbiol. 1971. Vol. 21. P. 152-154.
15. Получение и свойства мутантов Penicillium verruculosum с повышенным образованием целлюлаз и ксиланаз / И.В. Соловьева, О.Н. Окунев, В.В. Бельков, А.В. Кошелев, Т.В. Бубнова, Е.Г. Кондратьева, АЛ Скомаровский, А.П. Синицын // Микробиология. 2005. Т. 74. № 2. С. 172-178.
16. Родионова НЛ, Тиунова НЛ., Фениксова Р.В. Методы определения целлюлазной активности // Прикл. биохим. микробиол. 1966. Т. 2. Вып. 2. С. 197-205.
17. Nelson N. A photometric adaptation of the determination of reducing sugars // J. Biol. Chem. 1944. Vol. 153. P. 375-380.
18. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars // J. Biol. Chem. 1945. Vol. 160. P. 61-68.
19. A novel strain of Trichoderma viride shows complete lignocel-lulolytic activities / K. Neethu, M. Rubeena, S. Sajith, S. Sreedevi, P. Priji, K.N. Unni, M.K.S. Josh, V.N. Jisha, S. Pradeep, S. Benjamin // Adv. Biosci. Biotechnol. 2012. Vol. 3. No. 8. P. 1160-1166.
References
1. Klesov АЛ., Grigorash S.Yu. Fermentativnyj gidroliz celljulozy III. Zakonomernosti obrazova-nija gljukozy i cellobiozy pri dejstvii polifer-mentnyh celljulaznyh sistem na nerastvorimuju (prirodnuju) celljulozu [Enzymatic hydrolysis of cellulose III. Regularities of the formation of glucose and cellobiose under the action of
polyenzyme cellulase systems on insoluble (natural) cellulose] // Bioorg. chemistry. 1981. Vol. 7. № 10. P. 1538-1552.
2. Fungal cellulases / C.M. Payne, B.C. Knott, H.B. Mayes, H. Hansson, M.E. Himmel, M. Sand-gren, J. Stahlberg, G.T. Beckham // Chem. Rev. 2015. Vol. 115. P. 1308-1448.
3. Roth J.C.G. Michele Hoeltz M., Benitez L.B. Current approaches and trends in the production of microbial cellulases using residual lignocel-lulosic biomass: a bibliometric analysis of the last 10 years // Arch. Microbiol. 2020. Vol. 202. P. 935-951.
4. An overview on the recent developments in fungal cellulase production and their industrial applications / A. Singh, S. Bajar, A. Devi, D. Pant // Bioresour. Technol. Rep. 2021. Vol. 14. Article 100652.
5. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology / L.R. Lynd, P.J. Weimer, W.H. van Zyl, I.S. Pretorius // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. Vol. 66. № 3. P. 506-577.
6. Kumar A., Gautam A., Dutt D. Biotechnological transformation of lignocellulosic biomass in to industrial products: An Overview // Adv. Biosci. Biotechnol. 2016. Vol. 7. P. 149-168.
7. An overview on fungal cellulases with an industrial perspective / S. Sajth, P. Priji, S. Sreedevi, S. Behjamin // J. Nutr. Food Sci. 2016. Vol. 6. № 1. P. 1-13.
8. Microbial cellulases: A review on strain development, purification, characterization and their industrial applications / H.Sher, N.Zeb, S.Zeb, A. Ali, B. Aleem, F. Iftikhar, S.U. Rahman, M.H. Rashid //J. Bacterid. Mycol. 2021. Vol. 8. № 5. P. 1-15.
9. Zhang Y. H.P., Himmel M.E, Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies // Biotechnol. Adv. 2006. Vol. 24. № 5. P. 452- 481.
10. Selekcija mutantnogo shtamma Aspergillus alliaceus - producenta pektingidrolaz [Selection of a mutant strain of Aspergillus alliaceus - a producer of pectin hydrolases] / RV. Mikhailova, A.G. Lobanok, L.I. Sapunova, Zh.F. Shishko, I.E. Zenkovich // Prikl. biohim. mikrobiol. [Appl. Biochem. Microbiol.]. 1998. Vol. 34. № 1. P. 83-86.
11. Klesov AA. Celljuloliticheskie mikroorganizmy i fermenty [Cellulolytic microorganisms and enzymes] // Itogi nauki i tehniki, serija Biotehno-logija [Results of Science and Technology, Biotechnology series] 1988. Vol. 10. 224 p.
12. Klesov AA., Vinogradova L.G. Biotehnologija fer-mentativnogo prevrashhenija celljulozy [Biotechnology of enzymatic transformation of cellulose] // Itogi nauki i tehniki, serija Biotehnologija [Results of science and technology, Biotechnology series]. 1988. Vol. 12. 154 p.
13. Enchanced cellulase production of the Tricho-derma viride mutated by microwawe and ultraviolet / X.-H Li., H.-J.Yang, B.Roy, E.Y. Park, L.-J. Jiang, D. Wang, Y.-G. Miao // Microbiol. Res. 2010. Vol. 165. P. 190-198.
14. Mandels M., Weber J., Parizek R. Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride II Appl. Microbiol. 1971. Vol. 21. P. 152-154.
15. Poluchenie i svojstva mutantov Pénicillium ver-ruculosum s povyshennym obrazovaniem cellju-laz i ksilanaz [The selection and properties of Pénicillium verruculosum mutants with enhanced production of cellulases and xylanases] / I.V. Solovyeva, O.N. Okunev, V.V. Vel'kov, A.V. Koshelev, T.V. Bubnova, E.G. Kondratyeva, АЛ. Skomarovsky, A.P. Sinitsyn // Mikrobiologija. [Microbiology] 2005. Vol. 74. № 2. P. 172-178.
16. Rodionova NA., Tiunova NA., Feniksova R.V. Metody opredelenija celljulaznoj aktivnosti [Methods for determining cellulase activity] // Prikl. biohim. mikrobiol. [Appl. Biochem. Microbiol.]. 1966. Vol. 2. Issue 2. P. 197-205.
17. Nelson N. A photometric adaptation of the determination of reducing sugars // J. Biol. Chem. 1944. Vol. 153. P. 375-380.
18. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars 11 J. Biol. Chem. 1945. Vol. 160. P. 61-68.
19. A novel strain of Trichoderma viride shows complete lignocel-lulolytic activities / K. Nee-thu, M. Rubeena, S. Sajith, S.Sreedevi, P. Priji, K.N. Unni, M.K.S. Josh, V.N. Jisha, S. Pradeep, S. Benjamin // Adv. Biosci. Biotechnol. 2012. Vol. 3. No. 8. P. 1160-1166.
Статья поступила в редакцию 26.10.2021.
