CC BY
112
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2015, № 1 (12) УДК 577.152.321+579.26
ВЛИЯНИЕ ФТОРИДА НАТРИЯ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ГРИБНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ
А.А. Приставка, И.В. Попова
Иркутский государственный университет,
664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, pristavk@gmail.com
Исследовано влияние фторида натрия на целлюлазные комплексы, продуцируемые грибами рр. Trichoderma и Aspergillus. Установлено, что фториды являются конкурентными ингибиторами и снижают общую целлюлазную активность исследованных комплексов в разной степени: константы ингибирования составили ~15 мг/л для целлюлаз из Trichoderma и ~110 мг/л для Aspergillus. Предложены возможные молекулярные механизмы ингибирования. Показано, что ингибитор способен оказывать смешанное действие на ферменты - подавляет активный центр и адсорбцию ферментов на субстрате (Ki адсорбц.=160 мг/л). Показан эффект активации грибных амилаз в присутствии фторида натрия. Ил. 7. Библиогр. 32 назв.
Ключевые слова: целлюлазы; фториды; константа ингибирования; микромицеты; Trichoderma viride.
INFLUENCE OF SODIUM FLUORIDE ON ENZYMATIC ACTIVITY OF FUNGAL CELLULASES
A.A. Pristavka, I.V. Popova
Irkutsk State University,
1, Karl Marks St., Irkutsk, 664003, Russia, pristavk@gmail.com
The influence of sodium fluoride on the cellulase complex produced by fungi pp. Trichoderma and Aspergillus has been studied. It has been shown that fluorides are competitive inhibitors and they inhibit cellulase activity of the tested complexes to varying degrees. Inhibitory constants are ~15 mg /l for cellulases from Trichoderma and ~110 mg /l for Aspergillus. The possible molecular mechanisms of inhibition are discussed. It has been shown the inhibitor has a mixed effect on enzymes: it inhibits the active site of enzymes and adsorption of cellulases on the substrate (K adsorption a 160 mg /l). Also fluoro-dependent effect of activation of fungal amylase has been found. 7 figures. 32 sources.
Key words: cellulases; fluorides; micromycetes; inhibitory constant; Trichoderma viride.
ВВЕДЕНИЕ
Техногенное загрязнение наземных экосистем, непосредственно соседствующих с промышленными предприятиями, представляет собой серьезную экологическую проблему. Мощнейшим источников загрязнения экосистем Прибайкалья являются предприятия алюминиевой промышленности, выбросы которых содержат разнообразные токсические вещества (тяжелые металлы, ПАУ, фториды и т.д.), оказывающие особое воздействие на почвы и населяющие их микроорганизмы [8]. Почвенные микробные сообщества регулируют широкий спектр экосистемных процессов: первичную и вторичную продуктивность, регенерацию биогенных элементов и др. Целлюлозоразрушаю-щие микромицеты, являясь редуцентами расти-
тельных полимеров, играют огромную роль в деструкции органического вещества почв, переводя его в доступные для автотрофов элементы питания, замыкая, тем самым, круговорот веществ. В связи с этим антропогенное нарушение структуры почвенных микоценозов может сопровождаться негативными экологическими последствиями на уровне региональных экосистем и даже биомов. С другой стороны, количественные характеристики микросообществ можно использовать для биоиндикации качества окружающей природной среды [11, 19].
В последнее время работы, анализирующие влияние компонентов аэровыбросов предприятий алюминиевой промышленности на со-
став и структуру почвенных микроценозов, публикуются регулярно [1,3,4,6,9]. В этих работах отмечается снижение видового богатства и биомассы микромицетов, изменение их ферментативной активности, резкое увеличение доли наиболее толерантных видов и т.д.
Среди комплекса загрязняющих веществ, характерных для алюминиевых производств, особую опасность представляет фторид, соли которого используются в технологическом цикле производства металла [5,10]. При этом механизм токсического действия фторидов исследуется, главным образом, на растениях и животных, и остается дискуссионным: в литературе рассматривается его влияние на сульфгид-рильные группы белков [25]; связывание металлов с переменной валентностью - кофакторов ферментов [12]; накопление в клетках активных форм кислорода [13]; увеличение проницаемости плазматических и митохондриаль-ных мембран [18].
В настоящее время отсутствует информация о непосредственном влиянии фторидов на компоненты целлюлазных комплексов, продуцируемых микроорганизмами. Между тем, подобное влияние (если оно имеется) может определять возникновение обратных связей в системе «загрязнитель - почвенный микроценоз - растительная биомасса». Если фториды способны ингибировать полисахаридгидролазы, то эффективность почвенной редукции будут еще более понижена. В противоположном случае произойдет повышение скорости гидролиза растительных полимеров, способное компенсировать снижение видового богатства и биомассы микромицетов. Таким образом, цель данного исследования: изучить влияние фторида натрия на ферментативную кинетику грибных целлюлаз.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для исследования кинетических характеристик целлюлаз в присутствии фторида натрия использовались четыре источника ферментов:
• ферментный препарат «Целловиридин Г10х», изготовленный на основе Trichoderma viride (остаточная общая целлюлазная активность 18 МЕ/г);
• ферментный препарат «Пектофоетидин П3х», продуцируемый поверхностной культурой Aspergillus foetidus (остаточная активность 3 МЕ/г);
• культуральная жидкость Aspergillus niger на 6 сутки культивирования;
• культуральная жидкость Trichoderma viride на 7 сутки культивирования.
Чистые культуры микромицетов были выделены из почв, расположенных на расстоянии
25 км по факелу выброса от ОАО «ИркАЗ-РусАл». Микромицеты выращивались на жидкой среде Чапека, содержащей 0,5% глюкозы и 0,5% микрокристаллической целлюлозы в качестве индуктора синтеза целлюлаз.
Общая целлюлазная активность определялась по скорости образования восстанавливающих сахаров из фильтровальной бумаги с использованием динитросалицилового реагента. Целлобиазная активность определялась по начальной скорости образования глюкозы из целлобиозы [24]. Измерение эндоглюканазной активности было основано на определении окрашенных растворимых продуктов реакции, образующихся при действии ферментов на нерастворимую окрашенную целлюлозу ОЦ-41 [15]. Активность а-амилазы определялась по убыли концентрации крахмала [16]. Все измерения ферментативных активностей проводились в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,6 и при температуре 45 оС.
Для оценки влияния фторидов на каталитические свойства целлюлаз использовалась серия буферных растворов, содержащая возрастающую концентрацию ЫаР. В зависимости от задач исследований концентрация соли в буфере менялась в диапазоне от 10 мг/л до 1500 мг/л.
Для оценки типа ингибирования использовался метод Диксона, основанный на измерении скорости реакции при варьирующей концентрации ингибитора и постоянной концентрации субстрата [7].
Влияние фторидов на адсорбционные свойства целлюлаз оценивалось косвенно - по динамике сдвига адсорбционного равновесия с использованием двух разных субстратов. Навеску (20-100 мг) микрокристаллической целлюлозы (авицел), суспендировали в 10 мл буфера, затем добавляли раствор фермента и полученная смесь перемешивалась на магнитной мешалке в течении 5 минут для установления адсорбционного равновесия. Затем смесь центрифугировали в течении 5 минут при 5000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость с неадсорбированным ферментом, а осадок дважды промывали 10 мл буфера. К промытому осадку добавляли 4 мл свежего буфера и навеску окрашенного субстрата (10-50 мг). Смесь перемешивали и регистрировали оптическую плотность жидкой фазы при 490 нм через равные промежутки времени, периодически центрифугируя реакционную смесь. Начало регистрации кинетики образования окрашенных продуктов соответствует моменту переноса ферментов с неокрашенного субстрата на окрашенную целлюлозу. Максимальная оптическая плотность раствора пропорциональна ко-
личеству фермента, адсорбировавшегося на авицеле. Для оценки влияния ингибитора, вся процедура повторялась, но в буфер для сус-пендирования микрокристаллической целлюлозы вносились разные количества NaF - 10, 50 и 100 мг/л. По разнице в оптической плотности контрольной и опытных проб можно вычислить, насколько меняется коэффициент адсорбции фермента в присутствии разных концентраций ингибитора.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В почвах экосистем, расположенных вдоль градиента выбросов ОАО «ИркАЗ-РусАл» содержание подвижных фторидов колеблется от 10 мг/кг (25 км от источника воздействия) до 77 мг/кг (5 км от источника воздействия) воздушно-сухой почвы [2]. При этом в почвах всех рабочих площадок, независимо от уровня загрязнения, доминирует гриб Aspergillus niger, а в образцах почв, наиболее удаленных от предприятия, идентифицирован микромицет Trichoderma viride [4], т.е. эти два вида резко различаются по уровню толерантности к промышленному загрязнению. Оказывают ли фториды эффек-торное воздействие на экзоферменты (в первую очередь - целлюлазы), продуцируемые этими видами, и существуют ли видовая специфичность подобного воздействия?
Для ответа на этот вопрос была измерена общая целлюлазная активность в культураль-
0,2 -,
ных жидкостях Aspergillus niger и Trichoderma viride в присутствии фторида натрия (10 мг/л) относительно контроля. Аналогичное исследование было проведено для коммерческих ферментных препаратов, полученных на основе родственных штаммов микромицетов: «Целло-виридин Г10х» и «Пектофоетидин П10х» (рис. 1).
Было показано, что фторид натрия в концентрации 10 мг/л ингибирует целлюлазную активность во всех образцах и, хотя этот эффект проявляется в разной степени (снижение активности от 1,5 до 5 раз), для исследования кинетических параметров ингибирования можно использовать как культуральные жидкости, так и сухие ферментные препараты.
Доказательством того, что наблюдаемый эффект определяется именно фторид-анионом, является эксперимент, в ходе которого в реакционную среду (фермент-субстрат-буфер), содержащую фторид натрия (10 мг/л), добавлялось эквимолярное количество хлорида кальция. После выпадения фторида кальция в осадок происходила частичная реактивация фермента (рис. 2).
При повышении уровня NaF в реакционной среде до 200-250 мг/л отмечено усиление эффекта ингибирования, однако при последующем увеличении концентрации соли неожиданно наблюдается тенденция к восстановлению активности ферментного комплекса (рис. 3).
0,18 -
Ш
0,16 -
.о
8 0,14 х
CQ
I 0,12 H
03
S 0,1 H
X
со m
5 0,08 А Q
Ц
аЗ 0,06 j
! 0,04 ю
0 0,02 -\
В контроль ■ 10 мг/л NaF
Trichoderma Целловиридин Aspergillus niger Пектофоетидин viride Г10х П3х
Рис. 1. Сравнительная оценка влияния фторида натрия на целлюлазную активность ферментных комплексов из разных источников
0
jq 120 -|
13
0
1 100 ш
£ 80 го
п: го
1
го ГО
с;
2 с; с;
CD ZT
п: го
ю О
60 -
40
20 -
в контроле
в присутствии NaF (10 мг/л)
после внесения хлорида кальция
Рис. 2. Реактивация ферментного препарата «Целловиридин Г10х» хлоридом кальция после фторид -зависимого ингибирования целлюлазной активности
120 -|
£
£ 100
о
к
I 20 -
ю О
0 -I-1-1-1—
0 500 1000 1500
Концентрация NaF, мг/л
Рис. 3. Зависимость целлюлазной активности препарата «Целловиридин Г10х» от концентрации ЫаР в реакционной среде
Полученная зависимость неплохо аппроксимируется феноменологической моделью:
Akt (C) = b{ - exp(-a(C - C0))},
где a и b - эмпирические коэффициенты; С - концентрация NaF; С0 - концентрация фторида, при которой ингибирование фермента максимально.
Таким образом, фторид-анион в концентрациях, сопоставимых с его содержанием в
загрязненных почвах, подавляет активность ферментов целлюлазного комплекса.
Целлюлазный комплекс представляет собой гетерогенную систему, состоящую из нескольких типов ферментов с разной субстратной специфичностью [14], и, возможно, разной устойчивостью к действию ингибитора. Чтобы оценить влияние фторидов на разные компоненты целлюлазного комплекса, была исследована зависимость активности сухих ферментных препаратов от концентрации ингибитора, при этом использовались разные субстраты,
лозных цепей в активный центр [32]. Лактоны так же являются ингибиторами реакции, катализируемой целобиазой [17]. Высокой ингиби-рующей способностью обладают синтетические 4-тиоцеллоолигосахариды, причем ингибирую-щие свойства соединений пропорциональны количеству гликозильных единиц [28].
В качестве неконкурентного ингибитора известен этанол. Предположительно, механизм ингибирования объясняется денатурирующими свойствами спирта [22].
Кроме низкомолекулярных органических ингибиторов, установлена способность многих растений синтезировать белковые ингибиторы целлюлаз, с помощью которых растения противостоят воздействию фитопатогенных микроорганизмов [20]. Мощным ингибитором целлюлаз является лигнин - целлюлазы способны адсорбироваться на лигнине так же, как и на целлюлозе, но при этом образуется непродуктивный комплекс, не способный осуществлять гидролиз целлюлозы [27].
Из неорганических ингибиторов целлюлаз известны хлорид палладия, который осуществляет ингибирование по неконкурентному типу [29], катионы ртути и свинца [23]. Кроме этого, ингибиторами целлюлаз могут быть ионы металлов, в том числе трехвалентное железо и ион меди. Показано, что степень ингибирования зависит от окислительного потенциала метал-
ла, что указывает на окислительно-восстановительный характер механизма ингибирования возможно, зависящий от содержания молекулярного кислорода [30].
Среди ферментов подкласса гликозид-гидролаз эффекторная роль некоторых одновалентных анионов ^г, I-, О- и др.) известна для амилаз. Однако эти ионы являются активаторами фермента [26]. На рис. 4, г представлена зависимость амилазной активности препаратов от содержания №Р. Эффекторные свойства фторида проявляются и в этом случае, однако в его присутствии амилазная активность не снижается, а, наоборот, возрастает, причем эффект активации сильнее проявляется для ферментного комплекса из A. foetidus.
Тип ингибирования и значение К были определены для целлюлазных комплексов из двух источников: культуральная жидкость A. п^г и «Целловиридин Г10х» (рис. 5, а и б).
В обоих случаях расположение точек пересечения прямых свидетельствует о конкурентном механизме ингибирования. Однако значения констант ингибирования различаются практически на порядок: ~15 мг/л для ферментов из Tгichodeгma viгide и ~110 мг/л для A. nigeг. Не исключено, что различия в степени ингибиро-вания целлюлазных комплексов фторидамиоп-ределяют (хотя бы частично) разную толерантность видов к данному поллютанту в есте-
а) б)
Рис. 5. Определение типа ингибирования целлюлазных комплексов Т. утбе (а) и А. тдвг (б) фторидом натрия в координатах Диксона
ственных условиях.
Можно предложить два механизма (не обязательно исключающих друг друга), которые объясняют наблюдаемое влияние фторидов на ферментативную активность: воздействие на кислотно-основной катализ и нарушение сорбции ферментов на субстрате.
1. Нарушение процесса кислотно-основного катализа в присутствии фторида натрия
Механизм ферментативного гидролиза 1-4-гликозидной связи разными ферментами имеет много общего: непосредственно в катализе участвуют радикалы дикарбоновых аминокислот - D и E. Один остаток находится в неполярном окружении, содержит протонированную карбоксильную группу и действует как общий кислотный катализатор, поставляя протон кислороду гликозидной связи. Другой остаток расположен на противоположной стороне активного центра в полярном окружении, поэтому находится в депротонированном состоянии и участвует в образовании и стабилизации ин-термедиата - карбоний-иона [14].
Анионы, связываясь со специфичными ли-гандами вблизи активного центра, меняют степень поляризации каталитических аминокислотных остатков и молекул воды [21]. Вероятно, в зависимости от особенностей структурной организации активного центра это может сопровождаться либо активацией, либо ингибиро-ванием фермента.
2. Влияние фторида натрия на сорбцион-ное свойство целлюлаз
Большинство целлюлаз, наряду с каталитическим, обладают адсорбционным доменом, причем, эффективность гидролиза высокоупо-рядоченной целлюлозы определяется прочно-
стью адсорбции фермента на субстрате [14]. Соответственно, разное влияние фторид-аниона на адсорбционные домены ферментов из разных источников может определять различия в степени ингибирования ферментных комплексов.
Константу адсорбции обычно определяют, измеряя соотношение свободного и связанного с субстратом фермента. В данном случае непосредственно измерить количество свободного фермента невозможно, так как неизвестны константы ингибирования индивидуальных компонентов целлюлазных комплексов. Поэтому прочность адсорбции целлюлаз в присутствии разных количеств NaF устанавливалась с использованием двух разных субстратов по сдвигу адсорбционного равновесия (рис. 6).
При повышении концентрации NaF ферментативная активность по окрашенному субстрату закономерно падает, что отражает фторид-зависимое снижение количества адсорбированного фермента, причем, максимум оптической плотности раствора (установление адсорбционного равновесия) достигается через 30 мин. Следовательно, фторид натрия снижает эффективность адсорбции ферментов цел-люлазного комплекса из Trichoderma viride. Однако значение константы ингибирования адсорбции (~160 мг/л), определяемое как отрезок на оси абсцисс, отсекаемый аппроксимирующей прямой, значительно выше, чем константа ингибирования общей целлюлазной активности (рис. 7).
Таким образом, ингибитор действительно-оказывает смешанное действие на фермент: с одной стороны, он снижает эффективность кислотно-основного катализа в активном центре,
0,16 0,14 0,12
S 0,1 х
о „
сп 0
0,06 0,04 0,02
—♦— Контроль --□--10 мг/л - - -А- - - 50 мг/л —к— 100 мг/л
10 15 20
Время, мин
25
30
Рис. 6. Динамика гидролиза окрашенного субстрата препаратом «Целловиридин Г10х», предварительно адсорбированным на авицеле при разных концентрациях ингибитора
0
5
0,16 1
* 0,14
га
ф
0,12 А
Ш 0,1
о со
со 0,08 -\ ф
U 0,06
I 0,04
о
со
^ 0,02
0
0
R2 = 0,9404
50
100
150
200
Концентрация NaF, мг/л Рис. 7. Зависимость сорбционных свойств целлюлаз T. viride от содержания NaF
с другой - препятствует адсорбции фермента на субстрате. Исходя из значений констант ингибирования комплекса в целом (K = 15) и эффективности адсорбции (Kj = 160), можно заключить, что скорость-лимитирующим процессом является ингибирование именно активного центра.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе исследования были впервые установлены эффекторные свойства фторидов по отношению к ферментам подкласса полисаха-ридгидролаз - грибным целлюлазам и амилазам. Ингибирование целлюлаз фторидами протекает по конкурентному механизму, что свидетельствует о взаимодействии ингибитора с ио-ногенными группами активного центра. Константа ингибирования целлюлазного комплекса T. viride значительно ниже, чем аналогичный
показатель для A. niger, что может отражать, с одной стороны, различия в составе и структуре целлюлазных комплексов из разных источников, а с другой - общий характер толерантности микромицетов к фторидам.
Кроме активного центра фториды взаимодействуют с сорбционным доменом целлюлаз, влияя тем самым на адсорбционные свойства ферментов. Подобный двойственный эффект еще более усложняет непростые взаимодействия между разными компонентами целлюлазно-го комплекса, различающимися по субстратной специфичности, константе адсорбции и вкладу в синергический эффект. Не исключено, что суммарный эффект ингибирования гидролиза целлюлозы определяется не только составом целлюлазных комплексов, но также соотношением высокоупорядоченных и аморфных форм целлюлозы в субстрате.
1. Белозерцева И.А. Воздействие техногенных выбросов на почвенный покров верхнего Приангарья (на примере зоны влияния Иркутского Алюминиевого Завода): материалы Российской науч.-практ. конф. «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов». Иркутск, 2002. С. 8-13.
2. Берсенева О.А., Приставка А.А., Сало-варова В.П. Проблемы накопления поллютан-тов на территориях, подверженных влиянию алюминиевого производства (на примере «Ир-кАЗ-РусАл») и показатели безопасности овощных культур. Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и дальнего Востока: I Всерос. научн.-практ. конф. Улан-Удэ, 2010. С.
ЖИЙ СПИСОК
88-91.
3. Берсенева О.А., Саловарова В.П., Приставка А.А. Биоразнообразие почвенных мик-ромицетов в зоне воздействия аэровыбросов ОАО «ИркАЗ-РусАл» // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. № 4. С. 74-77.
4. Берсенева О.А., Саловарова В.П., Приставка А.А., Мелентьев В.А. Видовая структура почвенных микроценозов в серых лесных почвах Прибайкалья, подверженных воздействию аэропромвыбросов алюминиевого производства // Вестник РУДН. Серия Экология и безопасность жизнедеятельности. 2010. № 1. С. 24-29.
5. Гришко В.Н. Влияние загрязнения почв
фтором на структуру микробного ценоза // Почвоведение. 2001. № 12. С. 23-25.
6. Гузев В.С., Левин С.В. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов // Перспективы развития почвенной биологии. 2001. № 5. С. 178-219.
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 2. М., 1982. 418 с.
8. Евдокимова Г.А. Биоэкология: почвенная биота в техногенных зонах // Инженерная экология. 2007. № 4. С. 38-44.
9. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П. Влияние выбросов предприятий цветной металлургии на почву в условиях модельного опыта // Почвоведение. 2000. № 5. С. 630-638.
10. Евдокимова Г.А., Зенкова И.В., Мозгова Н.П. Почва и почвенная микробиота в условиях загрязнения фтором. Апатиты, 2005. С. 135.
11. Лебедева Е.В., Ярмишко М.А., Румянц ева А.В. Микологическая индикация почв Череповецкого промышленного района // Микология и фитопатология. 2006. № 1. С. 39-46.
12. Ложниченко О.В., Волкова И.В., Зайцев В.Ф. Экологическая химия: учеб. пособие. М., 2008. 225 с.
13. Панченко Л.Ф. Маев И.В., Гуревич К.Г. Клиническая биохимия микроэлементов. М., 2004. 216 с.
14. Рабинович М.Л. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 205-266.
15. Рабинович М.Л., Савицкене Р.Ю., Гера-симас В.Б., Мельник М.С., Новикова Т.В., Сте-понавичус Ю.Ю., Денис Г.Й., Клесов А.А. Окрашенный субстрат целлюлаз - области применения // Биоорганическая химия. 1985. Т. 11. С. 1330-1342.
16. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения гидролитических ферментов. М., 1981. 290 с.
17. Синицын А.П., Клёсов А.А. Сравнительная роль экзо-1,4-р-глюкозидазы и целлобиазы при ферментативном гидролизе целлюлозы // Биохимия. 1981. Т. 46. С. 202-213.
18. Шалина Т.И., Васильева Л.С. Общие вопросы токсического действия фтора // Сибирский медицинский журнал. 2009. № 5. С. 5-9.
19. Щелчкова М.В., Стручкова Л.К. Изменение численности почвенных микроорганизмов в условиях моделирования загрязнения мерзлотного чернозема тяжёлыми металлами // Проблемы региональной экологии. 2009. № 2. С.
79-82.
20. Яруллина Л.Г., Ибрагимов Р.И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений кгрибным патогенам. Уфа, 2006. 232 с.
21. Aghajari N., Feller G., Gerday C., Haser R. Structural basis of a-amylase activation by chloride // Protein Sci. 2002. 11(6). Р. 1435-1441.
22. Bezerra R.M., Dias A.A. Enzymatic kinetic of cellulose hydrolysis: inhibition by ethanol and cellobiose // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. 126(1). Р. 49-59.
23. Fayyaz-ur-Rehman M., Tariq M.I., Aslam M., Khadija G., Iram A. Inhibition Studies of Cellu-lolytic Activities Isolated from Planococcus Citri // The Open Enzyme Inhibition Journal. 2009. 2. P. 8-11.
24. Ghose T.K. Measurement of cellulase activity // Pure Appl. Chem. 1987. Vol. 59. P. 257268.
25. Junior A.D., Oliva M.A., Ferreira F.A. Dispersal pattern of airborne emissions from an aluminium smelter in Brazil, as expressed by foliar fluoride accumulation in eight plant species // Ecological Indicators. 2008. № 5. P. 454-461.
26. Levitzki A., Steer M.L. The Allosteric Activation of Mammalian a-Amvlase by Chloride // Eur. J. Biochem. 1974. 41. P. 171-180.
27. Rahikainen J.L., Martin-Sampedro R., Heikkinen H., Rovio S., Marjamaa K., Tamminen T., Rojas O.J., Kruus K. Inhibitory effect of lignin during cellulose bioconversion: The effect of lignin chemistry on non-productive enzyme adsorption // Bioresource Technology. 2013. 133. P. 270-278.
28. Schou C., Rasmussen G., Schulein M., Henrissar B., Drigues H. 4-Thiocellooligosac-charides: Their synthesis and use as inhibitors of cellulases // Journal of carbohydrate chemistry. 1993. Vol. 12(6). P. 543-752.
29. Shultz M.D., Lassig J.P., Gooch M.G., Evans B.R., Woodward J. Palladium - a new inhibitor of cellulase activities // Biochem Biophys Res Commun. 1995. 209(3). Р. 1046-52.
30. Tejirian A., Xu F. Inhibition of cellulase-catalyzed lignocellulosic hydrolysis by iron and oxidative metal ions and complexes // Appl. Environ. Microbiol. 2010. 76(23). P. 7673-82.
31. Weinstein L.H., Davison A. Fluorides in the Environment: Effects on Plants and Animals. CABI. 2004. 287 p.
32. Zhao Yue, Wu Bin, Yan Baixu, Gao Peiji Mechanism of cellobiose inhibition in cellulose hydrolysis by cellobiohydrolase // Science in China. Ser. C Life Sciences. 2004. Vol. 47 (1). P. 18-24.
REFERENCES
1. Belozertseva I.A. Vozdeistvie tekhnogen- Priangar'ya (na primere zony vliyaniya Irkutskogo nykh vybrosov na pochvennyi pokrov verkhnego Alyuminievogo Zavoda) [The influence of techno-
logical emissions to soils of top Priangarie (the zone influence Irkutsk Aluminium plant for example)]. Materialy Rossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii "Okhrana okruzhayushchei sredy i racional'noe ispol'zovanie prirodnykh resursov" [Proc. Russ. Conf. "Environmental protection and rational use of natural resources"]. Irkutsk, 2002, pp. 8-13.
2. Berseneva O.A., Pristavka A.A., Salovarova V.P. Problemy nakopleniya pollyutan-tov na territoriyah, podverzhennykh vliyaniyu alyuminievogo proizvodstva (na primere «IrkAZ-RusAl») i pokazateli bezopasnosti ovoshchnykh kul'tur [The problems of pollution accumulation at the areas exposure aluminum plant ("IrkAZ-RusAl" for example) and safety of vegetable crops]. Materialy I Vseross. nauchn.-prakt. konf. "Biotekh-nologiya v interesakh ekologii i ekonomiki Sibiri i Dal'nego Vostoka" [Proc. I-st All Russian Conference "Biotechnology for environmental and economy of Siberia and Far East"]. Ulan-Ude, 2010, pp. 88-91.
3. Berseneva O.A., Salovarova V.P., Pristav-ka A.A. Bioraznoobrazie pochvennykh mikromi-tsetov v zone vozdeistviya aerovybrosov OAO «IrkAZ-RusAl» [Biodiversity of the soil micromy-cetes at the zone exposure "IrkAZ-RusAl"]. Vestnik Buryatskogo gosudarstvennogo universi-teta - The herald of BSU, 2009, no. 4, pp. 74-77.
4. Berseneva O.A., Salovarova V.P., Pristavka A.A., Melent'ev V.A. Vidovaya struktura pochvennykh mikrotsenozov v serykh lesnykh pochvakh Pribaikal'ya, podverzhennykh vozdeis-tviyu aeropromvybrosov alyuminievogo proizvod-stva [Species structure of the soil microcenoses in the grey forest soils exposure emission of aluminum plant]. Vestnik RUDN. Seriya: Ekologiya i bezopasnost' zhiznedeyatel'nosti - PFUR Bulletin: Ecology and safety of living, 2010, no. 1, pp. 24-29.
5. Grishko V.N. Pochvovedenie - Eurasian Soil Science, 2001, no. 12, pp. 23--25. (In Russ.)
6. Guzev V.S., Levin S.V. Tekhnogennye izmeneniya soobshchestva pochvennykh mikroor-ganizmov [The technological change of the community soil microorganisms]. Materialy Vserossiiskoi konferentsii "Perspektivy razvitiya pochvennoi biologii" [Proc. All Russ. Conf. "The perspectives of development soil biology"]. 2001, vol. 5, pp. 178-219.
7. Dikson M., Uebb Je. Fermenty [Enzimes]. Moscow, 1982, vol. 2, 418 p.
8. Evdokimova G.A. Inzhenernaya ekologiya -Environmental engineering, 2007, no. 4, pp. 3844. (In Russ.)
9. Evdokimova G.A., Mozgova N.P. Pochvovedenie - Eurasian Soil Science, 2000, no 5, pp. 630—638. (In Russ.)
10. Evdokimova G.A., Zenkova I.V., Mozgova N.P. Pochva i pochvennaya mikrobiota v usloviyakh zagryazneniya ftorom [The soil and soil microbiota in fluoride pollution]. Apatity, 2005, 135 p.
11. Lebedeva E.V., Yarmishko M.A., Rumyan-tseva A.V. Mikologiya i fitopatologiya - Mycology and plant pathology, 2006, no. 1, pp. 39-46
(In Russ.)
12. Lozhnichenko O.V., Volkova I.V., Zaitsev V.F. Ekologicheskaya khimiya [Environmental Chemistry]. Moscow, 2008, 225 p.
13. Panchenko L.F., Maev I.V., Gurevich K.G. Klinicheskaya biokhimiya mikroelementov [Clincal biochamistry of the microelements]. Moscow, 2004, 216 p.
14. Rabinovich M.L. Uspekhi biologicheskoi khimii - Biochemistry. Biological chemistry reviews, 2000, vol. 40, pp. 205-266.
15. Rabinovich M.L., Savitskene R. Yu., Gerasimas V.B., Mel'nik M.S., Novikova T.V., Steponavichus Yu.Yu., Denis G.J., Klesov A.A. Bioorganicheskaya khimiya - Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 1985, vol. 11, pp. 13301342.
16. Rukhlyadeva A.P., Polygalina G.V. Metody opredeleniya gidroliticheskikh fermentov [The methods of research of hydrolytic enzymes]. Moscow, 1981, 290 p.
17. Sinitsyn A.P., Klesov A.A. Biokhimiya - Biochemistry, 1981, vol. 46, pp. 202-213.
18. Shalina T.I., Vasil'eva L.S. Sib. med. zhurn. - Siberian journal of Medicine, 2009, no. 5, pp. 5-9. (In Russ.)
19. Shchelchkova M.V., Struchkova L.K. Problemy regional'noi ekologii - Problems of regional ecology, 2009, no. 2, pp. 79-82. (In Russ.)
20. Yarullina L.G., Ibragimov R.I. Kletochnye mekhanizmy formirovaniya ustoichivosti rastenii k gribnym patogenam [Cellular mechanisms of plant resistance to fungal pathogens]. Ufa, 2006, 232 p.
21. Aghajari N., Feller G., Gerday C., Haser R. Structural basis of a-amylase activation by chloride. Protein Sci., 2002, 11(6), pp. 1435-1441. doi: 10.1110/ps.0202602.
22. Bezerra R.M., Dias A.A. Enzymatic kinetic of cellulose hydrolysis: inhibition by ethanol and cellobiose. Appl. Biochem. Biotechnol., 2005, no. 126(1), pp. 49-59.
23. Fayyaz- ur-Rehman M., Tariq M.I., Aslam M., Khadija G., Iram A. Inhibition Studies of Cellu-lolytic Activities Isolated from Planococcus Citri. The Open Enzyme Inhibition Journal, 2009, no. 2, pp. 8-11.
24. Ghose T.K. Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, vol. 59, pp. 257268.
25. Junior A.D., Oliva M.A., Ferreira F.A. Dispersal pattern of airborne emissions from an aluminum smelter in Brazil, as expressed by foliar fluoride accumulation in eight plant species. Ecological Indicators, 2008, no. 5, pp. 454-461.
26. Levitzki A., Steer M.L. The Allosteric Activation of Mammalian a-Amvlase by Chloride. Eur. J. Biochem., 1974, vol. 41, pp. 171-180.
27. Rahikainen J.L., Martin-Sampedro R., Heikkinen H., Rovio S., Marjamaa K., Tamminen T., Rojas O.J., Kruus K. Inhibitory effect of lignin during cellulose bioconversion: The effect of lignin chemistry on non-productive enzyme adsorption. Bioresource Technology, 2013, vol. 133, pp. 270278.
28. Schou C., Rasmussen G., Schulein M., Henrissar B., Drigues H. 4-Thiocellooligo-sacchari-des: Their synthesis and use as inhibitors of
cellulases. Journal of carbohydrate chemistry, 1993, vol. 12(6), pp. 543-752.
29. Shultz M.D., Lassig J.P., Gooch M.G., Evans B.R., Woodward J. Palladium - a new inhibitor of cellulase activities. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, vol. 209(3), рp. 1046-52.
30. Tejirian A., Xu F. Inhibition of cellulase-catalyzed lignocellulosic hydrolysis by iron and oxidative metal ions and complexes. Appl. Environ. Microbiol, 2010, vol. 76(23), рp.7673-82. doi: 10.1128/AEM.01376-10.
31. Weinstein L.H., Davison A. Fluorides in the Environment: Effects on Plants and Animals. CABI, 2004, 287 p.
32. Zhao Yue, Wu Bin, Yan Baixu, Gao Peiji Mechanism of cellobiose inhibition in cellulose hydrolysis by cellobiohydrolase. Science in China. Ser. C: Life Sciences, 2004, vol. 47(1), pp.18-24.
Поступила в редакцию 18 февраля 2015 г.
После переработки 6 марта 2015 г.
