CC BY
48
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ 2020 Том 10 N 2 PROCEEDINGS OF UNIVERSITIES. APPLIED CHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY 2020 Vol. 10 No. 2
Оригинальная статья / Original article УДК 577.152.321+579.26
DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-2-261 -273
Гидролиз целлюлозы ферментным комплексом Trichoderma viride в присутствии фторида натрия: влияние структуры субстрата и сорбционной активности целлюлаз
© Е.Р. Чашина, З.А. Ефременко, В.П. Саловарова, Д.Е. Гавриков, А.А. Приставка
Иркутский государственный университет, г. Иркутск, Российская Федерация
Резюме: Исследована зависимость активности целлюлаз Trichoderma viride от трех факторов -вида субстрата, сорбционных свойств ферментов и концентрации фторида натрия (NaF). Изучено влияние четырех водонерастворимых субстратов: два нативных (древесина березы и пшеничная солома) и два модельных (микрокристаллическая целлюлоза и фильтровальная бумага). Дополнительно исследован водорастворимый субстрат - Na-карбоксиметил-целлюлоза, специфичный к эндоглюканазной активности. Целлюлазный комплекс T. viride из препарата «Целловиридин Г3х» был разделен методом аффинной хроматографии на фракции, различающиеся сорбционными свойствами. Измерена целлюлазная активность исходного комплекса и полученных фракций по отношению ко всем субстратам при разной концентрации NaF - от 0 до 1000 мг/л. Качественные различия в белковом составе препарата и фракций исследованы методом SDS-диск-электрофореза. При внесении NaF (100-500 мг/л) активность исходного целлюлазного комплекса возрастала по отношению ко всем субстратам, особенно повысилась скорость гидролиза модельных образцов (до 100 %). Сравнение активности хроматографических фракций относительно модельных субстратов показало, что NaF оказывает противоположное действие на каталитические и сорбционные свойства целлюлаз: активность высокоаффинных фракций, содержащих целлобиогидролазы и низкомолекулярные эндоглюканазы, в присутствии фторида снижалась по отношению ко всем субстратам на 35-90 %. Слабосорбирующиеся фракции (эндоглюканазы I, II + целлобиаза) в этих же условиях ингибировались на 15-20 % по отношению к целлюлозе с высокой степенью кристалличности (МКЦ), но активировались в 1,3-3 раза относительно водорастворимого субстрата (Na-КМЦ) и субстрата с меньшей кристалличностью (фильтровальная бумага). Таким образом, суммарное действие фторидов на ферментативный гидролиз растительного субстрата определяется степенью кристалличности целлюлозы, а также соотношением сильно-и слабосорбирующихся компонентов в целлюлазном комплексе. Рассмотрены возможные молекулярные механизмы этих эффектов.
Ключевые слова: Trichoderma viride, целлюлазный комплекс, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, фториды, цветная металлургия
Информация о статье: Дата поступления 20 декабря 2019 г.; дата принятия к печати 29 мая 2020 г.; дата онлайн-размещения 30 июня 2020 г.
Для цитирования: Чашина Е.Р., Ефременко З.А., Саловарова В.П., Гавриков Д.Е., Приставка А.А. Гидролиз целлюлозы ферментным комплексом Trichoderma viride в присутствии фторида натрия: влияние структуры субстрата и сорбционной активности целлюлаз / Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2020. Т. 10. N 2. С. 261-273. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-2-261-273
Cellulose hydrolysis by Trichoderma viride enzyme complex in the presence of sodium fluoride: effect of substrate structure and cellulase sorption activity
Ekaterina R. Chashina, Zinaida A. Efremenko, Valentina P. Salovarova, Dmitrii E. Gavrikov, Aleksey A. Pristavka
Irkutsk State University, Irkutsk, Russian Federation
Abstract: The dependence of cellulase activity of the Trichoderma viride fungus on three factors - substrate type, enzyme sorption properties and sodium fluoride (NaF) concentration - was studied. The four studied water-insoluble substrates were based on two native (birch wood and wheat straw) and two model (micro-crystalline cellulose and filter paper) materials. In addition, a water-soluble Na-carboxymethyl-cellulose substrate specific for endoglucanase activity was studied. The T. viride cellulase complex from the "Celloviridin G3x" preparation was separated into fractions differing in sorption properties using the affinity chromatog-raphy method. The cellulase activity of the initial complex and obtained fractions was measured with respect to all substrates at different concentrations of NaF ranging from 0 to 1000 mg/L. Qualitative differences in the protein composition of the preparation and fractions were studied by SDS electrophoresis. With the introduction of NaF (100-500 mg/L), the initial cellulase complex activity increased with respect to all substrates. The hydrolysis rate of model samples was observed to increase by up to 100 %. Comparison of chromatographic fraction activity relative to model substrates demonstrated the NaF to have the opposite effect on the catalytic and sorption properties of cellulases. The activity of high affinity fractions containing cellobiohydrolases and low molecular weight endoglucanases in the presence of fluoride decreased by 35-90 % in relation to all substrates. Although weakly adsorbing fractions (endoglucanases I, II + cellobiasis) under the same conditions were inhibited by 15-20 % with respect to cellulose with a high degree of crystallinity (MCC), these were activated 1.3-3 times slower with respect to a water-soluble substrate (Na-CMC) and a substrate with less crystallinity (filter paper). Thus, the total effect of fluorides on the enzymatic hydrolysis of the plant substrate is determined by the crystallinity degree of the cellulose substrate, as well as by the ratio of strongly-and weakly-sorbed components in the cellulase complex. Possible molecular mechanisms of these effects are additionally proposed.
Keywords: Trichoderma viride, cellulase complex, endoglucanases, cellobiohydrolases, fluorides, non-ferrous metallurgy
Information about the article: Received December 20, 2019; accepted for publication May 29, 2020; available online June 30, 2020.
For citation: Chashina ER, Efremenko ZA, Salovarova VP, Gavrikov DE, Pristavka AA. Cellulose hydrolysis by Trichoderma viride enzyme complex in the presence of sodium fluoride: effect of substrate structure and cellulase sorption activity. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2020;10(2):261-273. (In Russian) https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-2-261-273
ВВЕДЕНИЕ
Загрязнение экосистем аэровыбросами промышленных предприятий представляет собой серьезную экологическую проблему. Одним из мощнейших источников эмиссии поллютантов в ряде регионов России, включая Прибайкалье, являются предприятия алюминиевой промышленности, выбросы которых содержат разнообразные токсичные вещества (тяжелые металлы, полициклические ароматические углеводороды, фториды и др.), оказывающие негативное воздействие на разные компоненты биогеоценозов [1, 2].
Важнейшим звеном биотического круговорота углерода являются почвенные микроорганизмы, разлагающие растительные полимеры, в том числе целлюлозу. В результате накопления поллютантов в почве нарушается структура почвенных микроценозов, снижается видовое богатство микроорганизмов, меняется их ферментативная активность, угнетается жизнедеятельность даже наиболее толерантных видов [3-6]. Вследствие этого нарушается процесс редукции растительных остатков, что
сопровождается негативными экологическими последствиями как минимум на уровне региональных экосистем.
Среди поллютантов, характерных для алюминиевой промышленности, серьезную опасность представляет фторид, соли которого используются в технологическом цикле производства металла [7-9]. Эффекты и механизмы токсического действия фторидов на живые организмы неоднократно обсуждались в научной литературе, однако, данные о непосредственном влиянии фторидов на активность целлюлазных комплексов, продуцируемых конкретными видами микромицетов, были впервые получены авторами работы [10], где были описаны и обсуждены эффекты, которые фторид оказывает на каталитические и сорбцион-ные свойства целлюлаз, продуцируемых грибами рр. Trichoderma и Aspergillus, и высказано предположение, что суммарное влияние фторида на целлюлазный комплекс определяется, с одной стороны, соотношением прочно- и слабосорбирующихся ферментов в целлюлаз-ном комплексе, а с другой - соотношением
аморфных и кристаллических участков целлюлозы в субстрате. Однако эти эффекты были показаны, во-первых, при использовании модельных субстратов, состоящих из чистой целлюлозы, в то время как в природных условиях субстратом для микробных целлюлаз являются лигноцеллюлозные комплексы; во-вторых, для объединенных целлюлазных комплексов, которые на самом деле состоят из карбогидраз четырех типов - эндоглюканаз (ЕС), целлобиогид-ролаз (СВН), целлобиаз (р-глюкозидаз) и экзо-глюкозидаз, различающихся молекулярными характеристиками, каталитической активностью, константой адсорбции и субстратной специфичностью [11-13].
Целью настоящей работы являлось изучение влияния фторида натрия на активность отдельных компонентов целлюлазного комплекса, продуцируемого грибом Trichoderma viride, по отношению к целлюлозосодержащим субстратам с различной устойчивостью к ферментативному гидролизу.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве модельного целлюлазного комплекса использовался коммерческий ферментный препарат «Целловиридин Г3х» на основе целлюлаз, продуцируемых Trichoderma viride (производство ОАО «ВОСТОК», Москва) с остаточной общей целлюлазной активностью 14,5 МЕ/г а.с.в.
На первом этапе была изучена ферментативная активность препарата по отношению к нескольким целлюлозосодержащим субстратам при различной концентрации фторида натрия, которую варьировали в диапазоне от 10 до 1000 мг/л в зависимости от задач исследования.
Всего было исследовано четыре не растворимых в воде субстрата: два нативных, измельченных до мелкодисперсного состояния и содержащих, помимо углеводных компонентов, лигнин в разных соотношениях; два модельных субстрата, состоящих только из полисахаридов. Каждая пара субстратов различалась соотношением кристаллической и аморфной целлюлозы. Также была измерена эндоглю-каназная активность по водорастворимому субстрату Na-карбоксиметилцеллюлозе (Na-КМЦ) (таблица).
Содержание лигнина в нативных субстратах определяли весовым методом после кислотного гидролиза и отделения углеводного
2
компонента .
Далее, в соответствии с рабочей гипотезой о связи сорбционных свойств целлюлаз с эффектами, которые фторид оказывает на их активность, было проведено хроматографиче-ское разделение ферментов целлюлазнного комплекса по их аффинным свойствам. Компоненты, различающиеся по степени адсорбции на целлюлозе, были исследованы на общую целлюлазную и эндоглюканазную активности в тех же условиях, что и исходный препарат.
Качественные различия в составе полученных аффинных комплексов были исследованы методом электрофореза.
Общая целлюлазная активность определялась с использованием динитросалицилово-го реагента по скорости образования восстанавливающих сахаров из навески целлюлозо-содержащего субстрата (50 мг) [18]. Соотношение субстрата и жидкой фазы в реакционной среде составило 1:20 (W/V), а количество ферментного препарата - 3 МЕ/г субстрата (по фильтровальной бумаге).
Таблица 1
Характеристика целлюлозосодержащих субстратов, использованных в работе
Table 1
Characterization of cellulose-containing substrates applied in research
Субстрат Доля лигнина, % Степень кристалличности, % (по данным рентгенодифракционного анализа)
Пшеничная солома Древесина березы Фильтровальная бумага (ФБ) Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) марки Avicel (Sigma) Na-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ), марка 250000M.W (НеваРеактив). 12+0,9 25+1,4 50-521 60-621 63-68 [14, 15] 75-80 [16, 17]
1 Kargarzadeh H., Ahmad I., Thomas S., Dufresne A. (eds.) Characterization of Various Kinds of Nanocellu-lose. Handbook of Nanocellulose and Cellulose Nanocomposites. John Wiley & Sons. 2017. Vol. 1. loelo-vich M. Chapter 2. P. 51-100.
2 TAPPI Test Method T222 om-02. Acid-Insoluble Lignin in Wood and Pulp. 2002.
Чашина Е.Р., Ефременко З.А., Саловарова В.П. и др. Гидролиз целлюлозы . Chashina E.R., Efremenko Z.A., Salovarova V.P. et al. Cellulose hydrolysis ...
Активность эндоглюконаз измерялась по начальной скорости уменьшения вязкости 1,5 %-го раствора №-карбоксиметилцеллюло-зы [19]. Для этого использовался вискозиметр Оствальда с объемом верхнего резервуара 1 мл и диаметром капилляра 0,6 мм. Все измерения активности проводились в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, при температуре 45 °С, рН = 4,6.
Разделение компонентов целлюлазного комплекса осуществлялось в стеклянной хро-матографической колонке (30х1,5 см) на аффинном сорбенте (МКЦ, Avicel), который предварительно был уравновешен №-ацетатным буфером (0,05 М, pH = 4,6). Скорость потока подвижной фазы составляла 1,5 мл/мин. После выхода несорбирующихся компонентов ферменты, связанные с носителем, элюирова-лись дистиллированной водой. Элюируемые белки детектировались на спектрофотометре IMPLEN Р330; элюат распределялся по фракциям объемом 1 мл.
Состав фракции с различной аффинностью к целлюлозе был исследован посредством SDS-диск-электрофореза в полиакрил-амидном геле при концентрации разделяющего геля 12,5 %.
Все эксперименты по исследованию фто-ридзависимой активности целлюлаз проводились минимум в трех повторностях, для полу-
ченных выборок рассчитывалось математическое ожидание и стандартная ошибка среднего. Сравнение выборок осуществлялось U-критерием. Калибровочные графики были получены линейной аппроксимацией экспериментальных данных с оценкой достоверности коэффициентов регрессии при p < 0,05. Достоверность влияния вида субстрата и сорбционных свойств ферментов на относительную активность целлюлаз (отношение активности в контроле к активности в присутствии NaF) оценивалась с помощью двухфакторного непараметрического метода PERMANOVA при p < 0,05. Все расчеты проводились в программе Past v. 4.01.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В работе [10] показано, что фторид натрия в низких концентрациях (в пределах 10-100 мг/л) ингибирует активность по фильтровальной бумаге (FPA) целлюлазного комплекса из T. viride примерно в 2 раза, однако дальнейшее повышение концентрации фторида приводило к реактивации ферментного препарата.
Результаты измерений активности ферментного комплекса по отношению к различным субстратом в присутствии высоких концентраций NaF представлены на рис. 1. В контроле эффективность начального гидролиза для разных субстратов различается: наиболее
0.25
X
С-
9 »-
П
et
0.1
0.15
г: ■
g
с
I
0.1
3 б о
0.05
к
г
МКЦ
% 1.5
I ■
s
ас Я)
ее л>
I 1
<; 4» к s
О X
5 0.5
солома древесина
И
ФБ
МКЦ
] контроль ES 100 мг/л ЕЗ 500 мг/л П1000 мг/л
b
i
1
солома древесина
Рис. 1. Влияние высоких концентраций фторида натрия на эффективность начального гидролиза целлюлозосодержащих субстратов целлюлазным комплексом: а - активность, выраженная в абсолютных единицах; b - активность в относительных показателях (отношение активности в присутствии NaF к активности в контроле)
Fig. 1. Effect of high concentrations of sodium fluoride on the effectiveness of the initial hydrolysis of cellulose-containing substrates by the cellulase complex. a - activity in absolute units; b - activity in relative terms: the ratio of activity in the presence of NaF to activity in the control stud
a
глубокая (и примерно одинаковая) степень гидролиза характерна для ФБ и соломы, то есть субстратов с пониженным содержанием кристаллической целлюлозы. Высококристаллическая МКЦ более устойчива к действию целлюлазного комплекса, а древесина гидро-лизуется с наименьшей эффективностью, так как в ней высокое содержание лигнина, который создает барьер для ферментов.
При внесении в реакционную среду ЫаР в концентрации 100 мг/л скорость гидролиза всех субстратов повышалась, но количественно этот эффект проявлялся по-разному. Сильнее всего он был выражен для модельных объектов ФБ и МКЦ (увеличение активности в 1,5 и 2 раза соответственно). Глубина гидролиза нативных субстратов менялась сходным образом, хотя и в меньших масштабах: 15 % -для соломы, 19 % - для древесины, то есть эффект активации пропорционален степени кристалличности целлюлозы в обеих группах субстратов. Но для ряда «солома-древесина» эта связь менее заметна, так как в нативных субстратах доля целлюлозы в целом ниже, а также в них присутствуют неуглеводные компоненты.
При повышении концентрации ЫаР еще на порядок скорость гидролиза большинства субстратов снижалась: по отношению к модельным объектам фермент оставался в зоне активации, а для многокомпонентных субстратов наблюдалось ингибирование, особенно заметное для древесины, более чем на треть.
Эндоглюканазная активность препарата, измеренная с помощью Ыа-КМЦ, также зависит от концентрации фторида (рис. 2). При низких концентрациях соли (до 50 мг/л) активность снижалась почти в 2 раза, а при повышении
уровня ЫаР до 250 мг/л происходила реакти-
|
100 I
90 \
80 V.
70
60 \ __
вация эндоглюканаз. Эта зависимость имеет сходный характер с аналогичными результатами, полученными для общей целлюлазной активности [10], и аппроксимируется предложенным в той же работе феноменологическим уравнением.
Для эффективного гидролиза сложных целлюлозосодержащих субстратов необходили «полноценный» целлюлазный комплекс, в который входят как прочнособирующиеся ферменты, отвечающие за разрушение кристаллической целлюлозы, так и слабосорби-рующиеся компоненты, основной субстрат которых - аморфный полисахарид [20]. Возможно, эффекторные свойства фторидов по-разному проявляются для ферментов с высокой и низкой аффинностью к субстрату, и именно этим объясняются различия в суб-стратзависимой активности ферментного комплекса. С другой стороны, целлюлазный комплекс T. viride включает, как минимум, пять эн-доглюканаз, которые различаются по молекулярной массе, структуре и способности адсорбироваться на субстрате [21]. Нелинейный характер зависимости эндоглюканазной активности от концентрации ЫаР также может определяться соотношением прочно- и слабосорби-рующихся ферментов с Ыа-КМЦ-азной активностью.
Аппроксимирующая функция записывается выражением
AktEG = Ь<1-е~а(С~С0>),
где а и Ь - эмпирические коэффициенты; С - концентрация NaF; С0 - концентрация фторида, при которой ингибирование фермента максимально; а = 0,06; Ь = 1; С0 = 50 мг/л.
m к»
та
£ 50
х JL
9.
5 40
г 0 50 100 150 200 250
<Т)
Концентрация NaF, мг/л
-аппроксимирующая кривая ♦ эмпирические значения
Рис. 2. Зависимость эндоглюканазной активности препарата «Целловиридин ГЗх» от концентрации NaF в реакционной среде
Fig. 2. Relationship between the «Celloviridin G3x» endoglucanase activity and NaF concentration in the reaction medium
Чашина Е.Р., Ефременко З.А., Саловарова В.П. и др. Гидролиз целлюлозы . Chashina E.R., Efremenko Z.A., Salovarova V.P. et al. Cellulose hydrolysis ...
Для проверки этого предположения компоненты ферментного комплекса были разделены по их аффинным свойствам на три основные фракции (рис. 3):
- Р1 - белки, не сорбирующиеся на носителе и выходящие в потоке исходной подвижной фазы в диапазоне 4-6 мл;
- Р2 - слабосорбирующиеся компоненты, покидающие неподвижную фазу сразу после смены элюента (максимум при 30 мл);
- Р3 - прочносорбирующиеся компоненты, выходящие из колонки после продолжительной
7
отмывки сорбента (70-72 мл).
Удельная целлюлазная активность этих фракций была ниже, чем у исходного препарата в 10-15 раз, что объясняется нарушением синергических взаимосвязей между компонентами целлюлазного комплекса в результате разделения. В присутствии ЫаР каждая из фракций характеризовалась собственной, отличной от исходного фермента, зависимостью относительной активности от вида субстрата (рис. 4).
F1
F3
t F2
4 W
20 40 60
Объем подвижной фазы, мл
80
Рис. 3. Хроматограмма разделения целлюлазного комплекса T. Viride на аффинном носителе (МКЦ).
Стрелкой указан момент смены подвижной фазы
Fig. 3. Affinity chromatography of the T. viride cellulase complex on microcrystalline cellulose (MCC). The arrow indicates the moment of change of the mobile phase
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
£
Е F1 F2 F3
ФБ МКЦ Солома В Древесина
Рис. 4. Влияние фторида на активность аффинных фракций по отношению к разным целлюлозосодержащим субстратам. По оси ординат - отношение целлюлазной активности в присутствии NaF (100 мг/л) к активности в контроле (без фторида)
Fig. 4. Effect of fluoride on activity of affinity fractions in relation to different cellulose-containing substrates.
4
Двухфакторный PERMANOVA свидетельствует, что вид субстрата и аффинные свойства фракций значимо влияют на относительную активность. В присутствии NaF активность несорбирующегося комплекса ^1) достоверно выше контроля по отношению к модельному (ФБ) и нативному (солома) субстратам с низкой степенью кристалличности. Для двух других субстратов наблюдается ингибирование фермента на 15-20 %. По мере увеличения аффинности фракций к целлюлозе ингибиру-ющее действие фторидов усиливается, и активность фракции F3 снижается по отношению ко всем субстратам на 35-65 % от контроля.
Полученные результаты можно интерпретировать с точки зрения противоположного или, как минимум, различного действия фторида на каталитические и сорбционные свойства целлюлаз. Если предположить, что NaF ингибирует целлюлозосвязывающий домен (ЦСД) фермента и активирует каталитический (КД), то фторид-индуцированное увеличение активности фракции F1 по отношению к субстратам с пониженной кристалличностью целлюлозы объясняется усилением способности слабосорбирующихся ферментов атаковать аморфную целлюлозу без прочной адсорбции на ней. Для ферментов, разрушающих кристаллическую целлюлозу, обязательное условие эффективной работы - адсорбция на субстрате. Если ЦСД ингибируется фторидом, то будет наблюдаться снижение эффективности гидролиза: а) высокоупорядоченных субстратов во всех фракциях (так как доля аморфной целлюлозы низка, а адсорбция на субстрате подавлена фторидом); б) всех субстратов в прочносорбирующейся фракции ^3). В случае нативных субстратов на эти взаимодействия накладывается влияние лигнина, который снижает доступность целлюлозы для ферментов. Вероятно, поэтому гидролиз в парах «ФБ-солома» и «МКЦ-древесина» в одинаковых условиях идет сходным образом, хотя кристалличность целлюлозы в нативных субстратах ниже (см. таблицу). В итоге результирующий эффект NaF на активность целлюлазного комплекса определяется, с одной стороны, степенью кристалличности субстрата, с другой - соотношением сильно- и слабосорбирую-щихся компонентов в целлюлазном комплексе. В пользу этого свидетельствует характер фто-ридзависимых активностей отдельных аффинных фракций по отношению к модельным субстратам (рис. 5).
Общая целлюлазная и эндоглюканаз-ная активности подавляются фторидом натрия пропорционально усилению сорбционных свойств ферментов. Если максимум ингибиро-вания эндоглюканазной активности исходного препарата не превышает 45 % (см. рис. 2),
то для слабосорбирующейся фракции ^2) он составляет б5 %, а для прочносорбирую-щихся эндоглюканаз ^3) - более 90 % (рис. 5, с). Общая целлюлазная активность фракции F3 также снижается в присутствии фторида более чем в два раза, и этот эффект сильнее проявляется для МКЦ (рис. 5 а, Ь). Несор-бирующиеся целлюлазы ^1) в меньшей степени ингибируются относительно МКЦ, а по отношению к остальным субстратам наблюдается активирующий эффект NaF: FPA увеличивается более чем в три раза по сравнению с контролем (см. рис. 5, а), а эндоглюканазная активность возрастает на 25-30 % с последующим снижением до исходного уровня при повышении концентрации фторида до 250 мг/л (рис. 5, с).
После попарного объединения фракций в композицию, в которой один из компонентов -несорбирующийся фермент, а другой - слабо-или прочносорбирующаяся эндоглюканаза, зависимость активности от концентрации фторида приближается (с учетом статистической погрешности) к аналогичной зависимости исходного препарата (рис. 5, d). Однако при этом не наблюдается реактивации фермента, что, вероятно, связано с неполным восстановлением эндоглюканазного комплекса Т. viride при объединении всего лишь двух фракций.
Качественные различия в белковом составе аффинных комплексов были исследованы методом DSN-электрофореза в полиакри-ламидном геле (рис. 6). В несорбирующейся ^1) и слабосорбирующей ^2) фракциях в заметных количествах преобладает, судя по молекулярной массе, р-глюкозидаза (75 кДа). Данный фермент гидролизует короткие целло-олигосахариды и, не имея целлюлозосвязы-вающего домена, обладает низким сродством к высокомолекулярной целлюлозе. Кроме цел-лобиазы эти фракции содержат эндоглюканазы I и II (40-55 кДа), которые, несмотря на наличие ЦСД, достаточно легко десорбируются с нерастворимого субстрата. Фракция F3 отличается заметным содержанием целлюлобио-гидролаз I и II (60-68 кДа) и низкомолекулярных белков (20-25 кДа), возможно, эндоглюканаз IV и/или V. Преобладание целлобиогид-ролаз (особенно CBH I) в составе прочносор-бирующихся комплексов согласуется с предыдущими данными о более сильной сорбции этих ферментов на нерастворимых субстратах по сравнению с другими целлюлазами [22].
Если предположение о противоположном влиянии NaF на каталитические и сорбцион-ные свойства целлюлаз верно, то преобладание целлобиогидролаз (и, возможно, низкомолекулярных эндоглюканаз) в F3 объясняет фторид-опосредованное снижение активности этой фракции по отношению ко всем целлюло-
зосодержащим субстратам, а доминирование целлобиаз и слабосорбирующихся эндоглю-каназ обуславливает повышение эффективности гидролиза аморфной части субстрата комплексом Р1.
Влияние фторида на каталитический домен целлюлаз можно объяснить его вмешательством в процесс кислотно-основного катализа: взаимодействуя со специфическими ли-
гандами вблизи активного центра, анион, вероятно, меняет степень поляризации аминокислотных остатков (й, Е) и молекул воды. В зависимости от особенностей пространственной организации активного центра это может сопровождаться изменением активности фермента, как это происходит, например, при активации некоторых а-амилаз хлоридом [23].
Рис. 5. Фторидзависимые активности фракций, различающихся адсорбционными свойствами по отношению к нерастворимым и водорастворимым субстратам (за 100 % принята активность в контроле): a - целлюлазная активность по фильтровальной бумаге (FPA); b - целлюлазная активность по МКЦ; c - эндоглюканазная активность отдельных фракций; d - эндоглюканазная активность объединенных фракций в сравнении с исходным ферментом
Fig. 5. Fluoride-dependent enzymatic activity of fractions differing in adsorption property, in relation to insoluble and water-soluble substrates (activity in the control study was accepted for 100%): a - cellulase activity by filter paper (FPA); b - cellulase activity by MCC; c - endoglucanase activity of individual fractions; d - endoglucanase activity of the combined fractions in comparison with the starting enzyme
Рис. 6. Электрофорез целлюлазных фракций в сравнении с исходным целлюлазным комплексом: М - маркерные белки: 1 - бычий сывороточный альбумин (68 кДа); 2 - холинэстераза(Homo sapiens; 58 кДа);
3 - Трипсин (24 кДа); 4 - Лизоцим (14 кДа). Е - ферментный препарат: ßG - ß-глюкозидаза (целлобиаза); СВН - целлобиогидролазы: EG - эндоглюканазы I и II; EGlmw- низкомолекулярные минорные эндоглюканазы
Fig. 6. Electrophoresis of cellulase fractions in comparison with the initial cellulase complex. M - marker proteins: 1 - Bovine serum albumin (68 kDa); 2 - Cholinesterase (Homo sapiens; 58 kDa);
3 - Trypsin (24 kDa); 4 - Lysozyme (14 kDa). E - an enzyme preparation; ßG - ß-glucosidase (cellobiase); СВН - cellobiohydrolases: EG - main endoglucanases; EGLMW - low molecular weight minor endoglucanases
Механизм влияния фторидов на сорбци-онный центр менее очевиден. Известно, что адсорбция целлобиогидролазы I из Т. viride на субстрате осуществляется за счет взаимодействий между тремя остатками тирозина ЦСД и остатками глюкозы на поверхности целлюлозы [24]. Возможно, в присутствии фторида нарушаются «стэкинг»-взаимодействия между ароматическими кольцами аминокислот и пи-ранозными кольцами гликозильных остатков в системе «фермент-субстрат», что приводит к снижению константы адсорбции целлюлоз.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ферментный состав хроматографических фракций, различающихся аффинностью к целлюлозному субстрату, зависимость их активностей от степени кристалличности целлюлозы и содержания NaF свидетельствуют о том, что фторид может оказывать разнонаправленное действие на активность целлюлаз, которое определяется соотношением в целлюлазном комплексе ферментов с высоким и низким коэффициентом адсорбции на субстрате. Чем сильнее эффективность разложения растительного субстрата зависит от способности фермента адсорбироваться на целлюлозе, тем ярче проявляется ингибирующее действие
фторида, и наоборот - гидролиз аморфной целлюлозы, не требующий прочного взаимодействия ЦСД с субстратом, протекает более эффективно в присутствии NaF. В итоге суммарный результат будет определяться составом целлюлазного комплекса, степенью кристалличности целлюлозы и содержанием лигнина в субстрате.
В литературе уже отмечалось, что интенсивность разложения растительных остатков не зависит от загрязнения среды соединениями фтора, но на этот процесс влияет состав субстрата [25]. С другой стороны, степень кристалличности нативной целлюлозы зависит от типа растительной биомассы, увеличиваясь в ряду: травянистые растения < древесина < лубяные волокна < хлопковые волокна [17]. Поэтому не исключено, что для нативных целлю-лазных комплексов, продуцируемых почвенными микромицетами, эффекторная роль фторидов в целом может оказаться положительной, и это компенсирует снижение скорости редукции растительного субстрата, вызванное нарушением видовой структуры почвенных микоценозов, длительное время обитающих в условиях постоянного воздействия аэропром-выбросов алюминиевых производств.
1. Каницкая Л.В., Колмогоров А.В. Влияние газовых выбросов при производстве алюминия на состояние окружающей среды // Успехи современного естествознания. 2009. 8. С. 17-18.
2. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П. Оценка загрязнения почв и растений в зоне воздействия газовоздушных выбросов алюминиевого завода // Теоретическая и прикладная экология. 2015. N 4. С. 64-68. https://doi.org/10.25750/ 1995-4301-2015-4-064-068
3. Берсенева О.А., Саловарова В.П., Приставка А.А., Мелентьев В.А. Видовая структура почвенных микроценозов в серых лесных почвах Прибайкалья, подверженных воздействию аэропромвыбросов алюминиевого производства // Вестник РУДН. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. 2010. N 1. С. 24-29.
4. Евдокимова Г.А., Корнейкова М.В., Лебедева Е.В. Сообщества микромицетов в почвах в зоне воздействия алюминиевого завода // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41. N 1. С. 20-28.
5. Благодатская Е.В., Семенов М.В., Якушев А.В. Активность и биомасса почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях окружающей среды. М.: Изд-во ООО «Товарищество научных изданий КМК», 2016. 243 с.
6. Katiyar P., Pandey N., Sahu K.K. Biological approaches of fluoride remediation: potential for environmental clean-up // Environmental Science and Pollution Research. 2020. Vol. 27. P. 13044-13055. https://doi.org/10.1007/s11356-020-08224-2
7. Евдокимова Г.А., Зенкова И.В., Мозгова Н.П., Переверзев В.Н. Почва и почвенная мик-робиота в условиях загрязнения фтором. Апатиты: Изд-во Кольского научного центра РАН, 2005. 135 с.
8. Макарова А.П., Буковская Н.Е., Напрас-никова Е.В. Воздействие аэротехногенных выбросов алюминиевых производств в Иркутской области на почвенную микробиоту // Известия Иркутского государственного университета. Серия: Биология. Экология. 2017. Т. 19. С. 57-62.
9. Горностаева Е.А., Фукс С.Л. Влияние фторсодержащих соединений на живые организмы (обзор) // Теоретическая и прикладная экология. 2017. N 1. С. 14-24. https://doi.org/ 10.25750/1995-4301-2017-1-014-024
10. Приставка А.А., Попова И.В. Влияние фторида натрия на ферментативную активность грибных целлюлаз // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2015. N 1 (12). С. 36-46.
11. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I. Активность и
КИЙ СПИСОК
компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников // Биоорганическая химия. 1980. Т. 6. N 8. С. 1225-1242.
12. Sinitsyn A.P., Osipov D.O., Rozhkova A.M., Bushina E.V., Dotsenko G.S., Sinitsyna O.A., et al. The production of highly effective enzyme complexes of cellulases and hemicellulases based on the Penicillium verruculosum strain for the hydrolysis of plant raw materials // Applied Biochemistry and Microbiology. 2014. Vol. 50. Issue 8. P. 761-772. https://doi.org/10.1134/ S0003683814080055
13. Beheraa B.C., Sethib B.K., Mishra R.R., Dutta S.K., Thatoi H.N. Microbial cellulases -Diversity & biotechnology with reference to mangrove environment: A review // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2017. Vol. 15. Issue 1. P. 197-210. https://doi.org/10.1016/jJg eb.2016.12.001
14. Thygesen A., Oddershede J., Lilholt H., Thomsen A.B., Stahl K. On the determination of crystallinity and cellulose content in plant fibres // Cellulose. 2005. Vol. 12. Issue 6. P. 563-576. https://doi.org/10.1007/s10570-005-9001-8
15. Kaschuk J.J., Frollini E. Effects of average molar weight, crystallinity, and hemicelluloses content on the enzymatic hydrolysis of sisal pulp, filter paper, and microcrystalline cellulose // Industrial Crops and Products. 2018. Vol. 15. P. 280289. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.02.011
16. Ahvenainen P., Kontro I., Svedstrom K. Comparison of sample crystallinity determination methods by X-ray diffraction for challenging cellulose I materials // Cellulose. 2016. Vol. 23. Issue 2. P. 1073-1086. https://doi.org/10.1007/s10570-016-0881-6
17. Иоелович М.Я. Модели надмолекулярной структуры и свойства целлюлозы // Высокомолекулярные соединения, Серия A. 2016. Т. 58. N 6. С. 604-624. https://doi.org/10.7868/ S2308112016060109
18. Ghose T.K. Measurement of cellulase activity // Pure and Applied Chemistry. 1987. Vol. 59. P. 257-268. https://doi.org/10.1351/pac1987590 20257
19. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Бере-зин И.В. Кинетика действия целлюлолитиче-ских ферментов из Geotrihum candidum. Виско-зиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы // Биоорганическая химия. 1977. Т. 3. N 3. С. 405-414.
20. Klyosov A.A., Mitkevich O.V, Sinitsyn A.P. Role of the activity and adsorption of cellulases in the efficiency of the enzymic hydrolysis of amorphous and crystalline cellulose // Biochemistry. 1986. Vol. 25. Issue 3. P 540-542. https://doi. org/10.1021/bi00351a003
21. Saloheimo M., Nakari-Setala T., Ten-kanen M., Penttila M. cDNA cloning of a Tricho-
derma reesei cellulase and demonstration of en-doglucanase activity by expression in yeast // European Journal of Biochemistry. 1997. Vol. 249. Issue 2. P. 584-591. https://doi.org/10.1111/ j.1432-1033.1997.00584.x
22. Pristavka A.A., Salovarova V.P., Zacchi G., Berezint I.V., Rabinovich M.L. Enzyme Recovery in High-Solids Enzymatic Hydrolysis of Steam-Pretreated Willow: Requirements for the Enzyme Composition // Applied Biochemistry and Microbiology. 2000. Vol. 36. Issue 3. P. 237-244. https://doi.org/10.1007/BF02742572
23. Aghajari N., Feller G., Gerday C., Haser R. Structural basis of a-amylase activation by chloride // Protein Science. 2002. Vol. 11. Issue 6.
P. 1435-1441. https://doi.org/10.1110/ps.0202602
24. Linder M., Mattinen M.L., Kontteli M., Lindeberg G., Stihlberg J., Drakenberg T., et al. Identification of functionally important amino acids in the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I // Protein Science. 1995. Vol. 4. Issue 6. P. 1056-1064. https://doi. org/10.1002/pro.5560040604
25. Evdokimova G.A., Mozgova N.P., Pereverzev V.N. Transformation of plant residues in the soil of a zone exposed to emissions from an aluminum smelter // Eurasian Soil Science. 2013. Vol. 46. Issue 8. P. 908-917. https://doi.org/ 10.1134/S1064229313060033
REFERENCES
1. Kanitskaya LV, Kolmogorov AV. Impact of gas emissions from aluminum production on the environment. Uspekhi sovremennogo estestvo-znaniya. 2009;8:17-18. (In Russian)
2. Evdokimova GA, Mozgova NP. Soil and plant pollution assessment in the zone of exposure to gas-air emissions from an aluminum smelter. Teoreticheskaya i prikladnaya ekologiya = Theoretical and Applied Ecolody. 2015;4:64-68. (In Russian) https://doi.org/10.25750/1995-4301-2015-4-064-068
3. Berseneva OA, Salovarova VP, Pristavka AA, Milentyev VA. Specific structure of the soil mycocenoses in grey forest soil of pribaikalye subject to influence of emissions of Irkutsk aluminium plant. Vestnik RUDN. Seriya Ekologiya i be-zopasnost' zhiznedeyatel'nosti = RUDN Journal of Ecology and Life Safety. 2010;1:24-29. (In Russian)
4. Evdokimova GA, Korneykova MV, Le-bedeva EV. Micromycete communities in soils in an aluminum smelter impact area. Mikologiya i Fitopatologiya = Mycology and Phytopathology. 2007;41 (1):20-28. (In Russian)
5. Blagodatskaya EV, Semenov MV, Yaku-shev AV. Activity and biomass of soil microorganisms in changing environmental conditions. Moscow: Tovarishchestvo nauchnykh izdanii KMK; 2016. 243 p. (In Russian)
6. Katiyar P, Pandey N, Sahu KK. Biological approaches of fluoride remediation: potential for environmental clean-up. Environmental Science and Pollution Research. 2020;27:13044-13055. https://doi.org/10.1007/s11356-020-08224-2
7. Evdokimova GA, Zenkova IV, Mozgova NP. Soil and soil microbiota under fluorine pollution. Apatity: Kol'skii nauchnyi tsentr RAN; 2005. 135 p. (In Russian)
8. Makarova AP, Bukovskaja NE, Napras-nikova EV. The Impact of Aerotechnogenic Emissions from Aluminum Smelters in the Irkutsk Region on the Soil Microbiota. Izvestiya Irkutskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya Biologiya.
Ecologiya = The Bulletin of Irkutsk State University. Series Biology. Ecology. 2017;19:57-62. (In Russian)
9. Gornostaeva EA, Fuks SL. The effect of fluorinated compounds on living organisms (review). Teoreticheskaya i prikladnaya ekologiya = Theoretical and Applied Ecolody. 2017;1:14-24. (In Russian)
10. Pristavka AA, Popova IV. Influence of sodium fluoride on enzymatic activity of fungal cellu-lases. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Bio-tekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2015;1:36-46. (In Russian)
11. Klyosov AA, Rabinowitch ML, Sinitsyn AP, Churilova IV, Grigorash SYu. Enzymatic hydrolysis of cellulose. I. Activity and composition of cellulase complexes from various sources. Bioor-ganicheskaya Khimiya = Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 1980;6(8):1225-1242. (In Russian)
12. Sinitsyn AP, Osipov DO, Rozhkova AM, Bushina EV, Dotsenko GS, Sinitsyna OA, et al. The production of highly effective enzyme complexes of cellulases and hemicellulases based on the Penicillium verruculosum strain for the hydrolysis of plant raw materials. Applied Biochemistry and Microbiology. 2014;50(8):761-772. https://doi. org/10.1134/S0003683814080055
13. Beheraa BC, Sethib BK, Mishra RR, Dut-ta SK, Thatoi HN. Microbial cellulases - Diversity & biotechnology with reference to mangrove environment: A review. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2017;15(1):197-210. https://doi.org/10.1016/jJgeb.2016.12.001
14. Thygesen A, Oddershede J, Lilholt H, Thomsen AB, Stahl K. On the determination of crystallinity and cellulose content in plant fibres. Cellulose. 2005;12(6):563-576. https://doi.org/ 10.1007/s10570-005-9001-8
15. Kaschuk JJ, Frollini E. Effects of average molar weight, crystallinity, and hemicelluloses content on the enzymatic hydrolysis of sisal pulp,
filter paper, and microcrystalline cellulose. Industrial Crops and Products. 2018;15:280-289. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.02.011
16. Ahvenainen P, Kontro I, Svedstrom K. Comparison of sample crystallinity determination methods by X-ray diffraction for challenging cellulose I materials. Cellulose. 2016;23(2):1073-1086. https://doi.org/10.1007/s10570-016-0881-6
17. Ioelovich MYa. Models of supramolecular structure and properties of cellulose. Vysoko-molekulyarnye soedineniya, Seriya A. = Polymer Science, Series A. 2016;58:925-943. (In Russian) https://doi.org/10.1134/S0965545X16060109
18. Ghose TK. Measurement of cellulase activity. Pure and Applied Chemistry. 1987;59:257-268. https://doi.org/10.1351/pac198759020257
19. Rabinowitch ML, Klyosov AA, Berezin IV. Kinetics of the action of cellulolytic enzymes from Geotrihum candidum. Viscometric analysis of the kinetics of carboxymethyl cellulose hydrolysis. Bioorganicheskaya khimiya = Russian Journal of Bioorganic Chemistry 1977;3(3):405-414. (In Russian)
20. Klyosov AA, Mitkevich OV, Sinitsyn AP. Role of the activity and adsorption of cellulases in the efficiency of the enzymic hydrolysis of amorphous and crystalline cellulose. Biochemistry. 1986:25(3):540-542 https://doi.org/10.1021/bi003 51a003
Критерии авторства
Чашина Е.Р., Ефременко З.А., Саловарова В.П., Гавриков Д.Е., Приставка А.А. выполнили экспериментальную работу. Авторы совместно обобщили результаты, написали рукопись, имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Чашина Екатерина Руслановна,
студент магистратуры, Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, Российская Федерация, e-mail: chashina-ek@mail.ru
21. Saloheimo M, Nakari-Setälä T, Tenkanen M, Penttilä M. cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast. European Journal of Biochemistry. 1997;249(2):584-591. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1997.00584.x
22. Pristavka AA, Salovarova VP, Zacchi G, Berezint IV, Rabinovich ML. Enzyme Recovery in High-Solids Enzymatic Hydrolysis of Steam-Pretreated Willow: Requirements for the Enzyme Composition. Applied Biochemistry and Microbiology. 2000;36(3):237-244. https://doi.org/10.10 07/BF02742572
23. Aghajari N, Feller G, Gerday C, Haser R. Structural basis of a-amylase activation by chloride. Protein Science. 2002;11(6):1435-1441. https://doi.org/10.1110/ps.0202602 •
24. Linder M, Mattinen ML, Kontteli M, Lindeberg G, Stihlberg J, Drakenberg T., et al. Identification of functionally important amino acids in the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I. Protein Science. 1995;4(6):1056-1064. https://doi.org/10.1002/ pro.5560040604
25. Evdokimova GA, Mozgova NP, Perever-zev VN. Transformation of plant residues in the soil of a zone exposed to emissions from an aluminum smelter. Eurasian Soil Science. 2013;46(8):908-917. https://doi.org/10.1134/S106 4229313060033
Contribution
Ekaterina R. Chashina, Zinaida A. Efremenko, Valentina P. Salovarova, Dmitrii E. Gavrikov, Aleksey A. Pristavka carried out the experimental work. The authors on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. All authors have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
The final manuscript has been read and approved by all the co-authors.
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Ekaterina R. Chashina,
Master Student,
Irkutsk State University,
1, Karl Marx St., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
e-mail: chashina-ek@mail.ru
Ефременко Зинаида Александровна,
аспирант,
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, Российская Федерация, e-mail: makar.efremenko@mail.ru
Саловарова Валентина Петровна,
д.б.н., профессор,
заведующая кафедрой физико-химической биологии, биоинженерии и биоинформатики, Иркутский государственный университет, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, Российская Федерация, e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Гавриков Дмитрий Евгеньевич,
к.б.н., доцент кафедры естественнонаучных дисциплин, Педагогический институт Иркутского государственного университета, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, Российская Федерация, e-mail: dega.irk@gmail.com
Приставка Алексей Александрович,
к.б.н., доцент кафедры физико-химической биологии, биоинженерии и биоинформатики, Иркутский государственный университет, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, Российская Федерация, e-mail: pristavk@gmail.com
Zinaida A. Efremenko,
Postgraduate Student,
Irkutsk State University,
1, Karl Marx St., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
e-mail: makar.efremenko@mail.ru
Valentina P. Salovarova,
Dr. Sci. (Biology), Professor,
Head of the Department of Physico-Chemical
Biology, Bioengineering and Bioinformatics
1, Karl Marx St., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Dmitrii E. Gavrikov,
Cand. Sci. (Biology), Associate Professor, Department of Natural Sciences, Pedagogical Institute, Irkutsk State University, 1, Karl Marx St., Irkutsk, 664003, Russian Federation, e-mail: dega.irk@gmail.com
Aleksey A. Pristavka,
Cand. Sci. (Biology), Associate Professor, Department of Physico-Chemical Biology, Bioengineering and Bioinformatics, Irkutsk State University, 1, Karl Marx St., Irkutsk, 664003, Russian Federation, e-mail: pristavk@gmail.com
