CC BY
36
УДК 602.3:579.8
Епишкина Ю.М., Тур А.В, Баурин Д.В, Шакир И.В., Панфилов В.И.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ TRICHODERMA VIRIDE НА СОДЕРЖАНИЕ СЫРОЙ КЛЕТЧАТКИ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ
Епишкина Юлия Михайловна, студентка 2 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии, e-mail: [email protected]
Тур Александра Владимировна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Баурин Дмитрий Витальевич к.т.н., м.н.с. кафедры биотехнологии;
Шакир Ирина Васильевна, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Панфилов Виктор Иванович, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии,
Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева,
125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В данной работе исследована способность Trichoderma viride продуцировать целлюлолитические ферменты на различных питательных средах, в присутствии ионов металлов (Fe2+, Mg2+) и лактозы в качестве индуктора. Наибольшая ферментативная активность была определена на обогащенной среде и достигла 1,39 МЕ/мл. Была исследована возможность применения культуральной жидкости Trichoderma viride для предобработки депротеинизированного шрота подсолнечника с целью снижения содержания сырой клетчатки в сырье. В результате ферментативной обработки содержание клетчатки уменьшилось на 13,1%
Ключевые слова: целлюлолитические ферменты, ферментативная активность, Trichoderma viride, сырая клетчатка, депротеинизированный шрот подсолнечника, ферментативная предобработка
TRICHODERMA VIRIDE CELLULASES FOR CRUDE FIBRE REDUCTION IN PLANT RAW MATERIALS
Epishkina J.M., Tur A.V., Baurin D.V., Shakir I.V., Panfilov V.I. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
In this paper the ability of Trichoderma viride to produce cellulolytic enzymes in various medium with the presence of metal ions (Fe2+, Mg2+) and lactose as an inducer has been studied. The highest enzymatic activity was obtained in enriched medium and reached 1.39IU/mL. The method of using of Trichoderma viride culture liquid for preprocessing of deproteinized sunflower meal to reduce the content of crude fiber was developed. As the result, the content of crude fiber after enzymatic pretreatment decreased by 13.1%.
Keywords: cellulolytic enzymes, enzymatic activity, Trichoderma viride, crude fiber, deproteinized sunflower meal, enzymatic pretreatment
Поиск новых экономичных методов предобработки растительного сырья для дальнейшей биоконверсии, согласующихся с принципами зеленой химии, остаётся актуальной задачей. Одним из видов возобновляемого растительного сырья является экстракционный шрот подсолнечника. Шрот является ценным вторичным продуктом, образующимся после экстракции масла и может быть использован, как высокобелковая кормовая добавка для сельскохозяйственных животных. Белки подсолнечника сбалансированы по
аминокислотному профилю, не содержат токсичных и антипитательных компонентов в отличие от многих других растительных культур (рапс и соя). Однако использование подсолнечного шрота и других растительных компонентов в рационе сельскохозяйственных животных ограничено из-за высокого содержания клетчатки. В шроте подсолнечника содержание клетчатки варьирует в пределах 32-39% в зависимости от сорта, степени извлечения и метода экстракции масла [1].
Клетчатка - основной компонент клеточной стенки растений, который не подвергается
гидролизу в пищеварительном тракте моногастричных животных. Клетчатка состоит из полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлозы) и лигнина [2]. Содержание клетчатки во вторичном сырье может быть уменьшено путём удаления шелухи перед экстракцией и методами сухого фракционирования растительного сырья [3]. Существует несколько методов предобработки, среди них наиболее распространёнными являются химический и ферментативный гидролиз. Ферментативные методы обработки имеют преимущества перед химическими, так как являются менее энергозатратными, экологически безопасными и высокоэффективными. Кроме того возможность формирования фурфурола и его производных сведена к минимуму, что является важным аспектом для дальнейшей биоконверсии. Большинство коммерческих препаратов состоят из мультиферментных комплексов, например препарат CellicCtec3 компании Novozymes (Дания) основан на целлюлолитической активности гриба Trichoderma reesei и содержит целлобиогидролазы, эндоглюканазы и ß-глюкозидазы. Ферментный
препарат ЦеллоЛюксА компании Сиббиофарм (Россия) производится путём культивирования Trichoderma viride и обладает высокой эндоглюканазной, целлюлазной и ß-глюканазной активностями. Для предобработки растительного сырья целесообразно применение полиферментных препаратов, так как они способны наиболее эффективно гидролизовать связи, основываясь на специфичности ферментов, входящих в состав препарата.
Грибы рода Trichoderma занимают основную позицию среди микроорганизмов, применяемых в качестве продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз в промышленности из-за широкой субстратной специфичности, способности продуцировать широкий спектр целлюлолитических ферментов (целлюлазы, ß-глюкозидазы, эндо- и экзоглюканазы)
[4]. Известно об использовании грибов рода Trichoderma при производстве кормовых добавок.
[5].
В данной работе была изучена возможность применения культуральной жидкости Trichoderma viride для предобработки депротеинизированного подсолнечного шрота с целью снижения содержания сырой клетчатки без применения коммерческих препаратов целлюлаз. Депротеинизированный шрот подсолнечника (ДПШ) имеет низкую питательную ценность из-за невысокого содержания белка 1219% и высокого содержания клетчатки 39,2%. Целлюлолитическая активность Trichoderma viride была увеличена при помощи обогащения среды источниками углерода, азота, а также солями металлов. Содержание пептона и дрожжевого экстракта было уменьшено, так как в высоких концентрациях они способны замедлять рост микроорганизмов.
Для эксперимента культивирование Trichoderma viride проводили в колбах Эрленмейера (250мл) с рабочим объёмом 100мл при температуре 25°С при постоянном перемешивании 220 об/мин в течение 5 суток. Каждые 2 часа производился отбор проб для определения целлюлолитической активности и значений pH. В качестве питательных сред использовали среду Чапека, обогащённую среду Чапека со следующим составом: KCl - 0.5 г/л; NaNO3 - 2г/л; K2HPO4 - 1 г/л; MgSO^^O - 0.5 г/л; FeSO4 7H2O - 0.1 г/л; глюкоза - 30 г/л; пептон - 2 г/л; дрожжевой экстракт - 0.5 г/л, (NH4)2SO4 - 3 г/л., и обогащенную среду, содержащую лактозу в качестве индуктора в концентрации 0,15 г/л. Целлюлолитическую активность определяли колориметрическим методом с 3,5 -динитросалициловой кислотой, направленным на определение количества высвобождаемых сахаров в результате расщепления биополимера под действием ферментов.
Рисунок 1. Целлюлолитическая активность Тг1сНо&гша \iride в среде Чапека, с повышенным содержанием ионов
металлов (Ре2+, М§2+): А- кривая целлюлолитической активности в среде Чапека содержащей ионы металлов , В - кривая целлюлолитической активности в среде Чапека
Наличие металлов в питательной среде способно как активировать, так и ингибировать целлюлолитическую активность из-за образования связей с амино- или карбоксильной группами аминокислот. Зависимость ферментативной активности от времени культивирования в среде, содержащей ионы двухвалентных металлов ^е2+, Mg2+), показана на рисунке 1. Максимальная ферментативная активность была определена в среде с концентрацией Fe2+- 0,4 г/л, Mg2+- 0,7 г/л и составила 0,257 МЕ/мл на 53 час культивирования. Также проводилось культивирование на стандартной среде Чапека, пик активности был достигнут на 72 час культивирования и составил 0,177 МЕ/мл.
На рисунке 2 показана зависимость ферментативной активности от времени культивирования в среде, содержащей лактозу в качества индуктора. Целлюлолитическая активность увеличилась, была определена на 112 часе культивирования и достигла 0,325 МЕ/мл. Оптимальная концентрация лактозы в среде была определена на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И Менделеева ранее.
Рисунок 2. Целлюлолитичекская активность Trichoderma \iride в среде Чапека, с содержанием лактозы 0,15 г/л: А-кривая целлюлолитической активности в среде Чапека, содержащей лактозу , В - кривая целлюлолитической активности в среде Чапека
Лактоза не является легкодоступным источником углерода для микрогрибов рода Trichoderma, однако её наличие в среде привело к увеличению активности. В третьем эксперименте было рассмотрено влияние первого и второго фактора на изменение целлюлолитической активности Trichoderma viride.. Полученные результаты представлены на рисунке 3. Максимальная активность 1,39 МЕ/мл была определена на обогащённой среде и достигла своего пика на 52 час культивирования.
Рисунок 3. Целлюлолитичекская активность ТпеНоЛегша
хкШе в обогащённой среде Чапека: А- кривая целлюлолитической активности в обогащённой среде, В -кривая целлюлолитической активности в среде Чапека
Также было исследовано влияние ферментов, выделяемых культурой Trichoderma viride на содержание сырой клетчатки в ДПШ. Перед ферментативной обработкой субстрата
культуральная жидкость была отделена от клеток с помощью центрифугирования (4°С, 8000 об/мин) в течение 10 мин. После центрифугирования надосадочная жидкость была отфильтрована и использована для дальнейшей предобработки субстрата. Предобработку производили в соотношении 1:5( ДПШ: раствор, содержащий ферменты соответственно). Раствор был приготовлен смешением культуральной жидкости с ацетатным буфером в различных
соотношениях. Предобработка производилась при 50°С в течение 24 часов. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Анализ полученных данных показал, что содержание лактозы и ионов двухвалентных металлов приводит к увеличению ферментативной активности Trichoderma viride. Максимальная активность определялась на обогащенной среде и составила 1,39 МЕ/мл. Как и предполагалось, обработка депротеинизированного шрота подсолнечника культуральной жидкостью Trichoderma viride приводит к значительному понижению содержания сырой клетчатки в субстрате. Наименьший процент содержания сырой клетчатки наблюдался в результате обработки субстрата раствором ацетатного буфера и культуральной жидкости, взятых в соотношении 1:1, что связано со стабилизацией целлюлаз под влиянием ацетатного буфера. Данный метод может быть использован как альтернативный метод предобработки без использования коммерческих препаратов целлюлаз.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-38-00628\18.
Список литературы
1. Kargopoulos A. и др. Use of Sunflower Cake in the Diet of ISA Brown Pullets // J. Agric. Sci. Technol. 2017. Т. 7. С. 129-134.
2. Madadi M., Tu Y., Abbas A. Pretreatment of Lignocelollusic Biomass Based on Improving Enzymatic Hydrolysis // Int. J. Appl. Sci. Biotechnol. 2017. Т. 5, № 1. С. 1-11.
3. Kaczmarek P. и др. Chemical composition of rapeseed products and their use in pig nutrition // Polish J. Nat. Sci. Wydawnictwo Uniwersytetu Warminsko-Mazurskiego w Olsztynie, 2016. Т. 31, № 4. С. 545562.
4. Bailey M.J., Tahtiharju J. Efficient cellulase production by Trichoderma reesei in continuous cultivation on lactose medium with a computer-controlled feeding strategy // Appl. Microbiol. Biotechnol. Springer, 2003. Т. 62, № 2-3. С. 156-162.
5. Sadykova V. S. et al. Production of a feed additive based on selenium-containing mycelium of fungi of the genus Trichoderma //Russian agricultural sciences. - 2012. - Т. 38. - №. 3. - С. 234-238.
Таблица 1. Содержание сырой клетчатки в ДПШ после
Объём Объём Сырая
ацетатного культуральной клетчатка,%
буфера (pH 5.0), мл жидкости Trichoderma viride, мл
75 25 28.4
50 50 25.1
25 75 35.1
0 100 34.8
100 0 38.2
