CC BY
68
УДК 623.19.47
А.В. Тур*, Д.В. Баурин, ИВ. Шакир, В.И. Панфилов
Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 * e-mail: tur.alexandra96@gmail.com
ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ДЕПРОТЕИНИЗИРОВАННОГО
ПОДСОЛНЕЧНОГО ШРОТА
Исследована предварительная комплексная обработка депротеинизированного подсолнечного шрота с помощью последовательного проведения химического и ферментативного гидролиза. Определена зависимость выхода редуцирующих веществ и общих углеводов в полученных гидролизатах. Проведено культивирование Saccharomyces cerevisiae на полученных гидролизатах, в результате титр клеток достиг 1,84-108 кл/мл. Содержание сырого протеина в биомассе составило 28%.
Ключевые слова: биологическая конверсия, переработка отходов растительного сырья, депротеинизированный шрот подсолнечника, кислотный гидролиз, ферментативный гидролиз
По-прежнему актуальной остается проблема поиска оптимального метода комплексной переработки растительного сырья [1].
Депротеинизированный подсолнечный шрот представляет собой отход производства изолята белка подсолнечника, сырье содержит 38% клетчатки, 22% сырого протеина и 23% целлюлозы.Целлюлоза - биополимер Р-глюкозы, является труднодоступным для биодеградации субстратом и требует предварительной обработки. Связываясь с лигнином, она образует лигниноцеллюлозный комплекс, который является основным компонентом клетчатки. Данный комплекс трудно усваивается пищеварительной системой животных. Процесс гидролиза полисахаридов растительной ткани, содержащей преимущественно гемицеллюлозу, осуществляется концентрированной минеральной кислотой при температурах выше 100°С. Концентрированная серная кислота эффективно гидролизует целлюлозу и обладает высокой каталитической активностью при низких температурах, в результате чего концентрация сахаров в гидролизатах в несколько раз выше, чем при гидролизе разбавленными кислотами, так как снижается распад моносахаридов [2]. Так как кислотный химический гидролиз проводится в жестких условиях, что приводит к разложению многих питательных компонентов сырья, а также к образованию антипитательных соединений. Продукты,получаемые в процессе кислотного гидролиза кислотного гидролиза целлюлозы при высоких температурах: целлюлоза - олигомеры -глюкоза - продукты окисления и деструкции. Наиболее ценным, с точки зрения производства, продуктом гидролиза гемицеллюлоз является фурфурол, получаемый посредством следующих реакций гидролиза пентозанов до пентоз[3]:
(С5Н804)„ + пир ^ иС5Н10О5
С5Н10О5 ГЗ^СНО
Исследования показали, что присутствие фурфурола в среде при периодическом культивировании дрожжей снижает скорость роста клеток [4]. Фурфурол тормозит синтез белка и РНК в клетках, тем самым ингибирует их рост. При культивировании Saccharomyces cerevisiae с целью получения этилового спирта, фурфурол воздействует на ключевые ферменты, такие как трифосфатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа, что приводит к снижению продуктивности культуры и уменьшению выхода целевого продукта [5]. Подбор оптимальных «мягких» условий проведения гидролиза позволит достичь наибольшего выхода сахаров, при этом минимизируя образование фурфурола, что в дальнейшем позволит использовать полученные гидролизаты как питательную среду для культивирования дрожжей.
Использование ферментативного гидролиза имеет определенные технологические преимущества по сравнению с кислотным: возможность проведения процесса при низких температурах (4065 °С), увеличение выхода моносахаридов с минимальным образованием антипитательных соединений. Поскольку основными компонентами растительного сырья являются такие биополимеры как целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин, наиболее эффективным является использование
мультиферментных комплексов, которые
обеспечивают эффективный гидролиз
полисахаридов с образованием низкомолекулярных углеводов, что ведет к увеличению усвояемости питательных веществ дрожжами. К ферментам, осуществляющим конверсию
целлюлозосодержащего сырья, относятся эндоглюканазы, целлобиогидролазы, ксиланазы,
которые используются для создания комплексных препаратов и мультиэнзимных композиций. Целлюлолитические ферментные препараты являются преимущественного продуктами микроскопических грибов, например препараты «СеШсС(ее 2» компании (Дания)
производятся на основе грибов Trichoderma, однако,показано, чтокультура гриба
Penicilliumverruculosumможет использоваться для создания альтернативных эффективных ферментных комплексов [6]. Глубокий гидролиз некрахмальных полисахаридов может быть осуществлен посредством совместного действия полиферментных комплексов, представленных целлюлазой, в-глюканазой и ксиланазой. Для них характерно совместное действие, выражающееся во взаимном увеличении глубины и скорости гидролиза полисахаридов до конечных продуктов. В состав гидролизатов, помимо белков, жиров и углеводов, входят витамины, минеральные вещества, пищевые волокна и другие ценные пищевые компоненты. В гидролизатах также могут присутствовать побочные продукты гидролитического расщепления, которые, можно полагать, ингибируют рост дрожжей, однако, использование комплексной предварительной обработки позволит снизить концентрацию антипитательных веществ в гидролизатах. Культура Б cerevisiaeявляется одной из наиболее распространёнными широко используется для получения микробного белка. Клетки дрожжей ассимилируют моносахариды и способны накапливать биомассу на вторичных продуктах растительного сырья. Биомасса хлебопекарных дрожжейсодержит до 40% углеводов идо 60% азотистых веществ от сухого вещества (из них до 50% сырого протеина, а также нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, лецитин). Оптимальная температура выращивания составляет 30-32°С, рН 4,2-5,0, удельная скорость роста 0,2-0,34 ч-1, при этом способны накапливать биомассу, в которой содержание сырого протеина будет достигать 45%.
В данной работе исследованы процессы предварительной обработки растительного сырья для реализации концепции комплексной переработки шрота подсолнечника с получением изолята белка и кормового продукта рассмотрена возможность проведения последовательного химического и ферментативного гидролиза. Ранее на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева были определены условия химического гидролиза [7; 8].
Для проведения двухэтапной обработки на первом этапе гидролиз проводили растворами серной кислотыв автоклаве ВК-75 при рН2,5; температуре 133°С; значение гидромодуля 10;продолжительность обработки составляла30 минут. Необходимое значение рН устанавливали с помощью раствора концентрированнойсерной кислоты,Гидролиз осуществляли. Ферментативный гидролиз полученных гидролизатовпрепаратом «Acellerase 1500» (Оепееог,Финляндия)проводили в лабораторном ферментере «МЫ£эге»(«1п£оге НТ»,
Швейцария) при температуре 50-65 °С, рН 4,0-5,0 и при постоянном перемешивании 500 об./мин. Изменение концентрации общих углеводов (ОУ) и редуцирующих веществ (РВ), перешедших в раствор в ходеферментативного гидролиза представлено на рисунке 1.
40
0
0 ? 10 1? 20 Время, час
Рис. 1. Содержание общих углеводов и редуцирующих веществ (г/л) в процессе гидролиза препаратом «АсеИегаэе 1500»
Полученный гидролизатиспользовали как основу питательной среды для культивирования биомассы
5.cerevisiae,для этогов среду внесли минеральные компоненты в количестве, соответствующем составу среды Ридера. В качестве иноколята использовали суточную культуру Saccharomycescerevisiae. Аэробное культивирование проводили при постоянной температуре и значении рН. (400
06./мин., 30°С, рН 4,8 - 5,0). Для подтитровки использовали 5% раствор серной кислоты и 25% водный раствор аммиака. В процессе ферментации осуществляли отбор проб для анализа РВ и ОУ, а также проводили количественный подсчет клеток в камере Горяева. Выращивание дрожжей продолжали течение 20 часов до стационарной фазы в. Затем полученную биомассу отделяли от культуральной жидкости путем фильтрация на тканевом фильтре, а затемосаждали путем центрифугирования(6000 об./мин. в течение 20 мин. при температуре 4°С). Полученную твердую фракцию объединяли и сушили при температуре 105°С.
Проведенный ферментативный гидролиз ДПШ препаратом «Acellerase 1500» в лабораторном ферментере показал, что максимальная концентрация РВ - 8,36 г/л и ОУ - 36,25 г/л достигается на 19-ый час.
Было сделано предположение о возможности использования дрожжами редуцирующих веществ, полученных в ходе гидролиза, в качестве источника углерода. При этом аммонийный азот ассимилируется и используется для синтеза белковых веществ. По результатам биохимического анализа полученной биомассы, содержание сырого протеина увеличилось до 28%, содержание клетчатки увеличилось до 50%, влажность биомассы составляла 4%. Анализ полученного супернатанта культуральной жидкости показал, что общее содержание белка (по Лоури) составило 9,3 г/л,
сухих веществ - 3,11%, общих углеводов и редуцирующих веществ - 16,52 г/л и 3,5 г/л соответственно.
Потребление РВ составило 41,8%, ОУ - 46,5% на 20-ый час. Количество клеток при этом достигло 1,84-108кл/мл. Данные показывают, что культивирование дрожжей привело к незначительному увеличению сырого протеина в продукте, а содержание белка в жидкой фазе
увеличилось, что может быть обусловлено дополнительной экстракцией белковых веществ подсолнечника в жидкую фазу. Полученные данные позволяют сделать вывод о перспективности предложенного подхода к предварительной обработке и необходимости проведения дополнительных исследований, в том числе культивирования альтернативных штаммов на полученных гидролизатах.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках базовой части государственного задания, проект № 1294.
Тур Александра Владимировна, студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии, РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Баурин Дмитрий Витальевич к.т.н., м.н.с. кафедры биотехнологии, РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Шакир Ирина Васильевна, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии, РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Панфилов Виктор Иванович, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии, РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва.
Литература
1. Сушкова В.И., Воробьева Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества.
Москва: ДеЛи принт, 2008.
2. Шарков В.И. и др. Технология гидролизных производств // М.: Лесн. пром-сть. 1973.
3. Кузнецов Б.Н. Каталитическая химия растительной биомассы // Соровский образовательный журнал. 1996. №
12. С. 47-55.
4. Palmqvist E., Almeida J.S., Hahn-Hagerdal B. Influence of furfural on anaerobic glycolytic kinetics of saccharomyces
cerevisiae in batch culture // Biotechnology and Bioengineering. 1999. Vol. 62. № 4. P. 447-454.
5. Banerjee N., Bhatnagar R., Viswanathan L. Inhibition of glycolysis by furfural in Saccharomyces cerevisiae // European
Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 1981. Vol. 11. № 4. P. 226-228.
6. Чекушина А.В. и др. Ферментные препараты Penicillium verruculosum для биоконверсии растительного сырья -
альтернатива коммерческим препаратам, полученным с помощью грибов рода Trichoderma. // Биотехнология. 2016. № 3. С. 69-80.
7. Baurin D.V.et al. Integrated processing of sunflower meal // 14th SGEM GeoConference on Nano, Bio And Green-
Technologies For A Sustainable Future. 2014. SGEM2014 Conference Proceedings, ISBN 978-619-7105-20-9/ISSN 1314-2704, June 19-25, 2014, Vol. 1. С. 419-426.
8. Dmitry V. Baurin, Mariia G. Gordienko, Irina V. Shakir V.I.Panfilov. Sunflower meal processing for protein isolates and
fodder additive // Chemical Engineering and Biochemical Engineering for a new sustainable process industry in Europe. 2015. Vol. 1. P. 912.
Tur Alexandra V.*, Baurin Dmitry V., Shakir Irina V., Panfilov Victor I.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: tur.alexandra96@gmail.com
PRE-PROCESSING OF DEPROTEINIZED SUNFLOWER MEAL
Abstract
Complex pre-processing of the deproteinized sunflower meal by means of chemical hydrolysis with followed enzymatic hydrolysis was studied in this research. The reducing substances and total carbohydrates yield dependencieswere measured in the obtained hydrolysates. Saccharomyces cerevisiae fermentation was made on the obtained hydrolysates. The concentration of Saccharomyces cerevisiae increased from 1.32-10 7to 1.84-108 cells/ml. Crude protein of the biomass reached 28%.
Key words: plant raw material, bioconversion, deproteinized sunflower meal, acid hydrolysis, enzymatic hydrolysis.
