CC BY
583
Вестник ДВО РАН. 2014. № 1
УДК 577.114.083
И.М. ЕРМАК, А.О. БЯНКИНА (БАРАБАНОВА), Е.В. СОКОЛОВА
Структурные особенности и биологическая активность каррагинанов -сульфатированных полисахаридов красных водорослей дальневосточных морей России
Приводятся данные о влиянии эндогенных и экзогенных факторов на структуру и свойства каррагинанов — сульфатированных полисахаридов красных водорослей дальневосточных морей. Рассматриваются макромо-лекулярная организация и разносторонняя биологическая активности каррагинанов и созданной на их основе биологически активной добавки.
Ключевые слова: каррагинаны, стадия развития водорослей, первичная и надмолекулярная структура, им-муномодулирующая и антикоагулирующая активности, терапевтическое действие.
Structural peculiarities and biological activity of carrageenans — sulphated polysaccharides from red algae collected from the Russian Pacific coast. I.M. YERMAK, A.O. BYANKINA (BARABANOVA), E.V. SOKOLOVA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The data on the influence of endogenic and exogenous factors on the structures and properties of carrageenans — sulphated polysaccharides of red algae from the Far Eastern seas are presented in this paper. Macromolecular organization and diverse biological potency of carrageenans as well as biologically active additives created on their bases are considered.
Key words: carrageenans, life stages of algae, basic and supra-molecular .structure, immunomodulatory and anticoagulant potency, therapeutic effect.
В пищевых целях и медицинской практике морские водоросли используются человечеством более шести столетий, но только с середины прошлого века начался интенсивный поиск и выделение из них биологически активных веществ. Красные водоросли содержат в значительных количествах своеобразные сульфатированные полисахариды -галактаны, в частности каррагинан и агар, которые не имеют аналогов среди других растительных полисахаридов.
Впервые термин «каррагин» появился в 1837 г. для обозначения используемых в пище морских водорослей Irish moss (Chondrus crispus), произрастающих вблизи местечка Каррагин на южном побережье Ирландии [33]. Позже каррагином стали называть желирую-щее вещество, выделяемое водной экстракцией из этих водорослей [22]. В 1871 г. был запатентован процесс экстракции каррагина. В 40-х годах прошлого столетия началось индустриальное производство каррагинана - продукта, принадлежащего к классу полисахаридов [22, 33, 36]. В конце прошлого столетия годовое производство каррагинана в мире составляло около 15 тыс. т [17]. В 2007-2008 гг. его мировое производство, не считая Китая, увеличилось до 50 тыс. т [28].
* ЕРМАК Ирина Михайловна - доктор химических наук, главный научный сотрудник, БЯНКИНА (БАРАБАНОВА) Анна Олеговна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, СОКОЛОВА Екатерина Владимировна - кандидат биологических наук, младший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: [email protected]
Интерес к каррагинану обусловлен его способностью к повышению вязкости и же-лированию водных растворов, что обеспечивает его широкое использование в пищевой, легкой и аграрной промышленности. Разносторонняя биологическая активность карраги-нана в сочетании с его физико-химическими свойствами позволяет все шире использовать его и в медицинской практике [50]. Так, каррагинаны применяются для создания систем с контролируемым высвобождением активных веществ, обеспечивающих пролонгирование необходимой концентрации действующего вещества и улучшающих биодоступность лекарственного препарата [31]. На основе каррагинанов получают микрокапсулированные и таблетированные формы лекарственных препаратов [44], эффективные комплексообразо-ватели для некоторых транквилизаторов и антибиотиков [38, 46].
Большое количество научных публикаций, посвященных поиску новых источников каррагинана, вопросам его химической модификации, взаимосвязи химической структуры с его биологической активностью, разработке новых подходов к использованию карра-гинана в медицине, свидетельствует о непрекращающемся научном интересе исследователей к этому полисахариду.
Структура каррагинанов
Каррагинаны - семейство сульфатированных гидроколлоидов, полимерная цепь которых построена из остатков галактозы (G) и ее производных с чередующимися а-1^-3- и ß-l^-4-связями [25, 36]. Каррагинаны классифицируются по местоположению и количеству сульфатных групп (S) в моносахаридных остатках и присутствию 3,6-анги-дрогалактозы (DA) в 4-О-замещенных остатках. Так, три широко используемых в промышленности типа, обозначенные как каппа- (к, DA-G4S), йота- (i, DA2S-G4S), так называемые желирующие типы, и лямбда- (X, D2S6S-G2S, нежелирующий тип) каррагинаны содержат, соответственно, одну, две или три сульфатные группы на одно повторяющееся дисахаридное звено [32].
Природные полисахариды редко имеют регулярную структуру. Чаще всего это смесь различных типов каррагинанов, выстроенных в полимерную цепь сложной гибридной структуры. В процессе многоступенчатого биосинтеза полисахаридов в клеточной стенке водоросли может образовываться комбинация различных идеальных каррабиозных звеньев, распределенных вдоль полимерной цепи, что и приводит к образованию гибридных структур. В так называемых каппа- и йота-каррагинанах могут содержаться не только каппа- и йота-каррабиозные звенья, но и их биосинтетические предшественники мю- (д, D6SG4S) или ню- (v, D2S6S-G4S), соответственно [27, 32].
Биосинтез каррагинанов зависит как от экзогенных, определяемых условиями обитания водорослей, так и эндогенных факторов, связанных с их физиологией, в частности со стадией развития макрофитов [18, 25]. Последний фактор особенно важен, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий чередование вегетативного, полового и бесполого размножения.
Первые работы по установлению структуры каррагинанов проводились в основном на образцах полисахаридов, выделенных из смеси различных форм водоросли, что значительно затрудняло интерпретацию полученных результатов и приводило к получению неоднозначных данных. Учет фазы жизненного цикла водоросли позволил выявить новые структуры каррагинанов и оценить влияние этого фактора на биосинтез полисахарида. Так, тщательный анализ выделенных полисахаридов показал, что карпоспорофиты Gigartina skottsbergii и Gymnogongrus torulosus продуцируют желирующие k/i-карраги-наны, цистокарпы Iridaea undulosa - k/i- и частично циклизированные д^-каррагинаны, в то время как в тетраспорофитах последней водоросли синтезируются X-каррагинаны, желирующие при высокой концентрации KCl [26, 43]. В то же время в тетраспорофитах Gigartina atropurpurea продуцируется комплекс полисахаридов, полимерная цепь которых
содержит смесь не только нежелирующих X-, 9- и р-каррагинанов, но также несульфатиро-ванных 3,6-ангидрогалактозных звеньев [27]. Желирующие полисахариды, представленные i/a-каррагинанами, образуются цистокарпами водоросли Stenogramme interrupta, в то время как тетраспорофит этого макрофита содержит нежелирующие 9- и X-каррагинаны [20]. Однако представители семейств Soleriaceae, Hyoneaceae и Furcellariaceae синтезируют только k- и 9-каррагинаны, независимо от фазы развития водоросли [25].
Каррагинаны красных водорослей дальневосточных морей
Большой вклад в исследование сульфатированных полисахаридов красных водорослей дальневосточных морей внес профессор А.И. Усов (г. Москва), который изучил состав и строение полисахаридов нескольких десятков водорослей. Итогом проведенных им в середине прошлого столетия исследований стало обнаружение среди красных водорослей Японского моря восьми источников каррагинанов. Шесть из них (Chondrus pinnulatus, C. armatus, C. yendoi, Gigartina ochotensis, G. unalaskensis, Rhodoglossum hemisphaericum) являются представителями семейства Gigartinaceae, один (Tichocarpus crinitus) принадлежит к семейству Tichocarpaceae, еще один (Turnella mertensiana) - к семейству Soleriaceae [11].
В поисках новых источников каррагинанов нами были исследованы водоросли западного побережья зал. Петра Великого Японского моря. Высокое содержание этого полисахарида было обнаружено в водорослях Mastacarpus pacific и Irideae cornucopiae (представителях семейств Phyllophoraceae и Gigartinaceae, соответственно), а также в трех ранее изученных видах водорослей рода Chondrus [51].
Промысловые водоросли в морях Дальнего Востока - представители семейств Gigartinaceae (C. armatus и C. pinnulatus) и Tichocarpaceae (T. crinitus). Хотя было показано, что Т. crinitus и C. pinnulatus являются каррагинанофитами [11, 51], только таксономическое положение водоросли не давало полной информации о структуре синтезируемого в ней полисахарида. До начала наших исследований не было известно, изменяется ли структура полисахаридов при переходе от одной стадии развития этих видов водорослей к другой и как условия обитания макрофита влияют на структуру каррагинана. В то же время информация по этим вопросам может дополнить и уточнить общую концепцию биосинтеза полисахаридов в процессе онтогенеза водорослей. Кроме того, она может быть полезна для рационального использования водорослей, в том числе их плантационного культивирования и промышленного производства каррагинанов.
Как известно, высокая степень вариабельности структуры природных сульфатирован-ных полисахаридов, получаемых из разных партий водорослей, часто приводит к неоднозначности их фармакологического действия. Это серьезно мешает использованию природных полимеров по медицинскому назначению. В связи с этим особое внимание должно быть уделено исследованию факторов, влияющих на биосинтез полимеров, с целью получения полисахаридов со стандартными характеристиками, отвечающими требованиям медицинской безопасности.
В Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН на протяжении нескольких лет изучаются структура и свойства каррагинанов в зависимости не только от видовой принадлежности водоросли, но и от стадии ее жизненного цикла и условий обитания.
Chondrus pinnulatus. В дальневосточных морях наибольшее экономическое значение имеют красные водоросли рода Chondrus (семейство Gigartinaceae). Он представлен видами: C. armatus (Harv.) Okam., C. platynus (Ag.) J. Ag. и C. pinnulatus (Harv.) Okam. C. armatus отмечается в Японском и Охотском морях, но чистых зарослей не образует, перемежаясь с другими видами красных водорослей. C. pinnulatus, хондрус перистый, растет в зонах литорали и сублиторали, распространен в Японском море (от зал. Посьета
до зал. Чихачева), у восточного и западного побережий Сахалина, у Курильских островов, в Охотском море. По экспертной оценке, запасы хондруса перистого по всему ареалу составляют 50-75 тыс. т, C. armatus - 100-150 тыс. т [8].
Мы исследовали химическую структуру полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной (с цистокарпами) форм водоросли C. pinnulatus, собранной в одном месте, на разных стадиях развития. Общее содержание полисахаридов в стерильной водоросли в 2 раза превосходило его количество в репродуктивной. Согласно данным спектроскопии ЯМР 13С и ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием, полисахариды желирую-щих фракций из разных форм C. pinnulatus имеют идентичную структуру, относящуюся к каппа/йота (кЛ)-каррагинанам (DA-G4S и DA2S-G4S, соответственно). Различие в структуре этих полисахаридов заключается в соотношении к- и i-звеньев. Максимальное (80 %) содержание k-звеньев отмечается в образце полисахарида, выделенного из репродуктивной формы водоросли.
Наряду с этим в полисахаридах были идентифицированы гетеродисперсные биосинтетические мю- или ню-предшественники (д, D6SG4S; v, D2S6S-G4S), количество которых было доминирующим в полисахаридах из стерильной водоросли. По данным седимента-ционного анализа, каррагинан из водорослей репродуктивной фазы имеет молекулярную массу в 2 раза большую, чем из стерильной (420 и 220 кДа, соответственно), и формирует гели более высокой прочности. По данным спектроскопии ЯМР 13C и ИК-спектроскопии, нежелирующий полисахарид из C. pinnulatus представляет собой Л-каррагинан (D2S6S-G2S) с примесью других каррабиозных звеньев и проявляет в концентрированных растворах конформацию неупорядоченной спирали («random coil») в диапазоне температур от 20 до 65 °С [49].
Tichocarpus crinitus. Ареал распространения этого вида водоросли охватывает Японское и Охотское моря, а также Тихоокеанское побережье островов Хонсю и Хоккайдо. Запасы тихокарпуса по всему ареалу российского побережья составляют 75-100 тыс. т [8]. Благодаря своему быстрому росту, крупным размерам и особенностям развития эта водоросль может рассматриваться как перспективная для промышленного получения полисахаридов.
Первые сведения о том, что T. crinitus содержит полисахариды группы каррагинана, были опубликованы А.И. Усовым. Методами химического анализа им было установлено, что фракция полисахарида, образующая гели в присутствии KCl, имеет строение не полностью сульфатированного каррагинана. Для растворимой в KCl фракции была предложена свойственная Х-каррагинанам структура углеводной цепи с чередованием ß-(1—>4)- и а-(1—3)-связей между остатками D-галактопиранозы [9, 10]. Каковы особенности структуры этого полисахарида и изменяется ли она при переходе водоросли из одной стадии развития в другую, как влияет среда обитания макрофита на характеристики выделенного полисахарида, оставалось неизвестным.
Для уточнения структуры полисахарида нами были собраны водоросли T. crinitus в одном месте на разных стадиях их жизненного роста (стерильной и репродуктивной), с тетраспорофитами и цистокарпами. Общее количество полисахаридов, выделенных из водоросли репродуктивной формы, было в 1,8 раза больше, чем из стерильной. При этом в репродуктивной форме с цистокарпами накапливаются преимущественно желирующие типы полисахаридов. Данные спектроскопии ЯМР и ИК-спектроскопии показали, что желирующие типы полисахаридов, выделенные из репродуктивной и стерильной форм T. crinitus, имеют структуру, типичную для каппа/бета-каррагинанов, и образуют гели меньшей прочности, чем каппа/йота-каррагинан из C. pinnulatus. Необходимо было выяснить, представляют ли выделенные полисахариды смесь каппа- и бета-каррагинанов или они имеют гибридную структуру.
Данные центрифугирования, гель-хроматографии, а также идентичность ИК-спек-тров различных полисахаридных фракций, полученных дробным осаждением с помощью
солей специфических ионов (KCl и CaCl2), свидетельствовали больше в пользу гибридной структуры полисахаридов [1]. Однако доказать это удалось только с помощью ферментативного гидролиза полисахаридов с использованием рекомбинантной каппа-каррагиназы из Pseudoalteromonas carrageenovora.
Сравнительный анализ низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза стандартного каппа-каррагинана из Eucheuma spinosum и каппа/бета-каррагинана из T. crinitus методом ВЭЖХ показал, что смесь олигомеров последнего состоит из блоков как регулярного каппа-, так и гибридного каппа/бета-каррагинана. Кроме олигосахаридов была выделена фракция (молекулярная масса 190 кДа), устойчивая к действию фермента, которая, по данным спектроскопии ЯМР 13С и ИК-спектроскопии, представляет собой каппа/ бета-каррагинан с преобладающим содержанием ß-звеньев. Применение масс-спектроме-трии с ионизацией электрораспылением и МАЛДИ-ИЭР подтвердило гибридную структуру полисахарида из T. crinitus и то, что основными компонентами его полимерной цепи являются каппа-каррабиоза, каппа-тетраоза, гекса- и октасахариды с различной последовательностью чередования каппа- и бета-звеньев: ß—-ß—-к—-к, ß—-к—-ß—-к, к—-ß—-ß—-к, к—>ß—>к—>к, к—»ß—»ß—»ß—»к, ß—»ß—»K—»ß—»к, к—>ß—>к—>ß—>к, к—>ß—>ß—>K—>K [13].
Имея одинаковую гибридную k/ß-структуру, желирующие полисахариды из репродуктивной (с цистокарпами) и стерильной форм водоросли T. crinitus различаются между собой соотношением дисахаридных к- и ß-звеньев: 60 : 40 и 80 : 20, соответственно. Кроме того, в полимерной цепи полисахарида, выделенного из репродуктивной формы водоросли, обнаружены в небольшом количестве сульфатированные дисахаридные звенья, соответствующие предшественникам k-каррагинанов [1]. Каррагинан подобной гибридной структуры, состоящей из к- и ß-каррабиозных звеньев, был выделен из Furcellaria lumbricalis [45], однако его желирующие свойства значительно слабее, чем k/ß-карраги-нана из T. crinitus. Это может объясняться различиями в соотношении и распределении каррабиозных звеньев вдоль полимерной цепи этих полисахаридов.
Сравнительный анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахаридов под действием каппа-каррагиназы из Alteromonas carrageenovora показал, что они действительно имеют различные молярные соотношения kß-каррабиоз - 61 : 39 и 57 : 42 для полисахаридов из T. crinitus и F. lumbricalis, соответственно. Более того, для полисахарида из F. lumbricalis характерно хаотичное чередование каппа- и бета-блоков, в то время как для каррагинана из T. crinitus наблюдается более регулярное построение блочной полимерной цепи [23].
Сложнее оказалось определить структуру нежелирующего полисахарида из стерильной водоросли T. crinitus. По данным частичного восстановительного гидролиза, он содержит только каррабиозные звенья. Поскольку спектры ЯМР этого каррагинана были сложны для интерпретации, полисахарид был обработан щелочью, что позволило получить хорошо разрешенные спектры. Установлено, что в основе полисахарида лежит повторяющееся дисахаридное звено, состоящее из остатков 2,4-дисульфата 3^-0-галактопиранозида и 1,4-связанного 3,6-ангидро-а-0-галактопиранозида.
Полисахарид был отнесен к новому типу каррагинана, обозначенного нами как икс (Х)-каррагинан [15]. Анализ спектров вязкости (при низкой скорости сдвига) показал, что этот каррагинан в растворах имеет конформацию неупорядоченного клубка («random coil») только при высоких температурах, в отличие от других нежелирующих типов кар-рагинанов, что, вероятно, обусловлено присутствием 3,6-ангидрогалактозы в его полимерной цепи.
Из репродуктивной формы T. crinitus, представленной тетраспорофитами, удалось выделить только нежелирующий полисахарид. Использование специфических ионов для осаждения определенных типов каррагинанов не привело к фракционированию экстрагируемого полисахарида. По данным спектроскопии ЯМР, ИК-спектроскопии и масс-спек-трометрии, полисахарид имеет нерегулярную структуру и содержит главные блоки,
построенные из 2,4-дисульфата 1,3-связанного P-D-галактопиранозида и 1,4-связанного 3,6-ангидро-а-0-галактопиранозида, вдоль полимерной цепи которого хаотично распределены остатки 6-сульфата 4-связанного галакгопиранозида. В результате щелочной обработки выделенный полисахарид приобретает регулярную структуру, соответствующую икс-типу каррагинана [19].
Таким образом, переход водоросли T. crinitus из одной стадии развития в другую сопровождается изменениями в структуре синтезируемого в ней полисахарида.
Влияние экзогенных факторов
на качественные и количественные характеристики каррагинанов
Условия обитания водорослей также играют немаловажную роль в биосинтезе основных структурных компонентов клеточной стенки макрофитов. Один из важных параметров среды обитания водоросли - интенсивность падающего света. В связи с этим нами было изучено влияние освещенности, или фотосинтетически активной радиации (ФАР), на количественные и качественные характеристики полисахаридов из трех видов красных водорослей - T. crinitus, C. pinnulatus и I. cornucopia.
Общее содержание полисахаридов в талломах стерильных форм водорослей T. crinitus и C. pinnulatus менялось в зависимости от освещенности. Максимальное количество каррагинана (до 40 %) было получено при низкой фотосинтетической активности (10 % ФАР). С увеличением интенсивности падающего света до 80 % ФАР количество синтезируемого полисахарида уменьшалось в 2,5 раза. Напротив, световые условия обитания водоросли I. cornucopia практически не влияли на содержание полисахарида.
Более подробно влияние интенсивности света и температуры воды на полисахаридный состав было изучено на примере водоросли T. crinitus, способной долгое время находиться в вегетативном состоянии. Установлено, что водоросли адаптируются к световым условиям обитания как через изменения морфологических и анатомических характеристик, так и через биохимические процессы, связанные с биосинтезом полисахаридов.
Общее содержание полисахарида в талломах водоросли хорошо коррелирует с ростовыми процессами. Наибольшая скорость роста и высокое содержание каррагинана зафиксированы для водоросли, растущей при 10-15 % ФАР и температуре воды 24 °С. С увеличением освещенности до 30-35 % ФАР количество выделяемого полисахарида уменьшалось в 1,5 раза, тогда как при понижении температуры воды содержание полисахарида не зависело от интенсивности падающего света.
С изменением интенсивности падающего света изменялся и качественный состав полисахарида: содержание желирующего к/р-каррагинана в водоросли, растущей при низкой освещенности, было постоянным, тогда как содержание нежелирующего типа постепенно уменьшалось. При этом с уменьшением интенсивности света с 30-35 до 10-15 % ФАР количество р-звеньев в полимерной цепи гибридного каррагинана увеличивалось в 2,4 раза, что может быть связано с дополнительным десульфатированием полисахарида при низкой освещенности. У водоросли, выращенной при 10-15 % ФАР, преобладающим становится содержание нежелирующих полисахаридов [48].
На качественный и количественный состав извлекаемого полисахарида может влиять и способ заготовки сырья. Каррагинаны содержат сульфатные группы и могут подвергаться автогидролизу в процессе хранения водоросли. В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ полисахаридов, выделенных из свежих и высушенных водорослей T. crinitus, собранных как в одном, так и в разных местах их обитания. В процессе хранения водорослей изменений в структуре выделенных из них каррагинанов не происходило, но наблюдалось уменьшение величины их молекулярной массы от 450 до 236 кДа [2].
Известно, что водоросли могут использоваться как индикаторы загрязнения окружающей среды, в частности для мониторинга уровня тяжелых металлов в морской среде.
По этой причине важно знать, как влияют экологические условия произрастания макро-фитов на характеристики синтезируемого ими полисахарида. Проведенный элементный анализ показал, что экстракты полисахаридов из водорослей Т. сгтгШ, собранных в различных по своим биотопическим характеристикам и степени антропогенного воздействия районах зал. Петра Великого (мыс Фальшивый, бухты Тихая, Рисовая), различаются по содержанию белков и глюкозы, а также микро- и макроэлементов.
Следует отметить, что во всех исследуемых полисахаридах содержание тяжелых металлов не превышает допустимой нормы (СанПиН 2.3.2.1078, индекс 1.3.7) и водоросли из этих районов можно использовать в качестве источников биологически активных добавок. Выход полисахаридов составляет 30-36 % массы сухого сырья и не зависит от места сбора водорослей. Структуры выделенных полисахаридов идентичны и соответствуют к/р-каррагинанам [14].
Физико-химические свойства каррагинанов
Структурное разнообразие каррагинанов играет существенную роль в проявлении их физиологического действия. Известно, что биологическая активность природных полимеров определяется не только первичной структурой, но и их макромолекулярной организацией. Для изучения физико-химических свойств и надмолекулярной структуры каррагинанов, имеющих как регулярную, так и гибридную структуру, нами были использованы методы электрокинетических и вискозиметрических измерений, высокоэффективной жидкостной хроматографии, светорассеяния, электронной и атомно-силовой микроскопии.
В табл. 1 представлены структуры повторяющихся дисахаридных звеньев изученных нами каррагинанов, в табл. 2 - их физико-химические характеристики.
Как видно из данных табл. 2, все исследуемые полисахариды полидисперсны по молекулярной массе (200-500 кДа). Наибольший отрицательный поверхностный потенциал имеет икс-каррагинан, содержащий 3,6-ангидрогалактозу и две сульфатные группы на одно дисахаридное звено, наименьший - каппа/бета-каррагинан, в котором в среднем одна сульфатная группа приходится на два дисахаридных звена.
Проведенные нами исследования позволили выявить различия в ультраструктуре полисахаридов. Так, согласно данным электронной микроскопии, к-каррагинан, имеющий регулярное строение полимерной цепи, при концентрации 0,5 мг/мл формирует длинные
Таблица 1
Структуры повторяющихся дисахаридных звеньев каррагинанов красных водорослей семейств Gigartinaceae и ТкИосаграсеае
Вид водоросли Тип каррагинана Структура повторяющегося звена
3-р-0-галактопиранозное звено 4-а-Д-галактозное звено
СаШсЫкуя агшаШя лямбда (X) О28 Б28, 68
Т1сИосагри. сптЫя икс (Х) О28, 48 БЛ
С. агшаЫя каппа (к) О48 БЛ
Скопйги. ртпиШия каппа/йота (к/!) О48/О48 БЛ/БЛ28
Т. сппИи. каппа/бета (к/р) О48/О БЛ/БЛ
40 СН2ОН У^Х^-О СН2ОН о О НО \ СН2ОН
ОН ^""ОН ОН
О О О ОА ОН
Примечание. О - 1,3-р-0-галактоза; Б - 1,4-а-0-галактоза; БЛ - 1,4-3,6-ангидро-Д-галактоза; 8 - сульфатная группа.
Таблица 2
Физико-химические характеристики полисахаридов из красных водорослей
Тип каррагинана М*, кДа П** • ю-3, мл/мг Электрокинетический потенциал, мВ (0,1 М NaCl)
С = 0,5 мг/мл | С = 0,05 мг/мл
Х-каррагинан 247 0,41 -40,0 ± 2,0 -
к/р-каррагинан 380 0,61 -28,0 ± 1,0 -24,0 ± 0,6
к/1-каррагинан 160 0,28 -30,0 ± 2,0 -33,0 ± 2,0
Х-каррагинан 527 0,82 -36,4 ± 2,0 -34,0 ± 4,0
к-каррагинан 376 0,62 -33,0 ± 2,0 -
* Средневязкостная молекулярная масса. ** Характеристическая вязкость.
переплетенные фибриллы шириной до 16 нм, состоящие из параллельных нитей, которые при высоких концентрациях образуют волокнисто-сетчатую структуру. В отличие от него к/р-каррагинан проявляет морфологическую неоднородность, что обусловлено блочным строением его полимерной цепи [4]. Результаты атомно-силовой микроскопии (АСМ), которая впервые использовалась для исследования полисахаридов гибридной структуры, подтверждают эти данные. Каппа- и каппа/йота-каррагинаны при низких концентрациях (10 мкг/мл) формируют двуспиральные структуры (высота 0,73 ± 0,15 нм), в то время как к/р-каррагинан образует разнообразные изолированные короткие волокна (0,6 нм). При высоких концентрациях (50 мкг/мл) эти желирующие структурные типы каррагинанов создают трехмерные волокнисто-сетчатые структуры, состоящие из макромолекулярных ассоциатов (см. рисунок). Высота последних (3,87-4,65 нм) и анализ трехмерного изображения указывают на характер межмолекулярной ассоциации полисахаридов по типу «бок-к-боку». Лямбда-каррагинан, который характеризуется более высокой степенью сульфатирования и отсутствием 3,6-ангидрогалактозы, в разбавленных растворах имеет конформацию неупорядоченного клубка, при высоких концентрациях образует сотопо-добные структуры [39].
0 С.5 1.0 1.5 иг (1 D.t L.-5 i.t
АСМ-изображения к/р-каррагинана на свежесколотой поверхности слюды при концентрациях: а - 0,01; б - 0,05 мг/мл; в - трехмерное изображение к/р-каррагинана при концентрации 0,1 мг/мл
Первичная структура Х-каррагинана сочетает в себе элементы как к- и к/р- (3,6-ан-гидрогалактоза), так и Х-карагинанов (высокое содержание сульфатных групп). Согласно АСМ-изображению, Х-каррагинан образует двуспиральные структуры, формирующие с увеличением концентрации полисахарида упорядоченные сотоподобные структуры [39].
Биологические свойства каррагинанов
Среди полисахаридов водорослей каррагинаны являются наиболее изученными с точки зрения токсичности, пирогенности и аллергенности, и безопасность их использования в пищевых и медицинских целях подтверждена многочисленными исследованиями
различных научных групп в экспериментах in vivo [29]. Каррагинаны относятся к растворимым пищевым волокнам и внесены в список пищевых компонентов [12] при строгом соответствии определенным параметрам, регламентированным Международным экспертным комитетом пищевых добавок (IECFA). Несмотря на признание каррагинана безопасным, биологическая активность этих полисахаридов изучена в основном на стандартных образцах, выпускаемых фирмой «Sigma», и результаты этих исследований не дают полной картины физиологического эффекта природных каррагинанов, имеющих более сложную структуру.
Хотя в последнее время довольно активно изучается влияние сульфатированных полисахаридов на иммунную систему организма, информация о связи структурных особенностей этих полимеров с иммуномодулирующим эффектом практически отсутствует. Известно, что сульфатированные полисахариды способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток и оказывают разнонаправленное влияние на механизмы регуляции клеточного и гуморального иммунного ответа [42]. Предполагается, что иммуномодулирующее действие каррагинанов инициируется a-Gal-(1^3) Gal эпитопами [16]. По некоторым данным, низкомолекулярные производные каррагинана обладают большей иммуностимулирующей активностью в сравнении с высокомолекулярными соединениями [53]. Вопрос о том, что же доминирует в проявлении иммуномодули-рующей активности каррагинанов - молекулярная масса, плотность заряда, химическая структура или все это вместе, остается нерешенным.
При изучении влияния структурных особенностей каррагинанов на их иммуномо-дулирующую активность в экспериментах ex vivo нами было показано, что все исследуемые каррагинаны обладают иммуномодулирующей активностью. Одним из важных показателей иммуностимулирующей активности веществ служит их способность влиять на продукцию синтеза активных медиаторов иммунной системы организма - цитокинов. Особым условием при использовании веществ в иммунокоррегирующей терапии, учитывающей существующий в организме баланс про- и противовоспалительных интерлей-кинов, являются показатели избирательности данного вещества в отношении продукции этих цитокинов.
Нами установлено, что все исследуемые каррагинаны обладают иммуномодулирую-щей активностью, стимулируя синтез цитокинов мононуклеарными клетками крови человека. Наименее сульфатированный K/ß-каррагинан действует избирательно, усиливая синтез противовоспалительного цитокина ИЛ-10 при низкой концентрации (10 нг/мл) и не проявляя активности в отношении индукции синтеза провоспалительных ФНОа и ИЛ-6 цитокинов. В отличие от него Х-каррагинан показывает выраженное действие на макрофаги, усиливая процесс формирования активных форм кислорода в макрофагах [52]. Иммуномодулирующие свойства полисахаридов могут обеспечивать их потенциальное применение для стимулирования иммунного ответа или контроля активности иммунных клеток, в частности смягчения таких негативных эффектов, как воспаление [47].
Среди сульфатированных полисахаридов продолжается поиск веществ, проявляющих выраженное антитромбическое действие, не вызывающих кровотечения [35]. Мы изучили влияние каррагинанов на активацию тромбоцитов, играющих основную роль в системе первичного гемостаза организма. Как показали результаты, каррагинаны обладают ан-титромботической активностью, замедляя скорость образования фибринового сгустка и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, ингибируя их адгезию к коллагену, опосредованную специфичным к нему гликопротеином VI. При этом наибольшую анти-агрегационную активность имеют каррагинаны с высокой степенью сульфатирования и большей молекулярной массой. В то же время менее сульфатированный K/ß-каррагинан является наиболее сильным ингибитором агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином и коллагеном, и слабым индуктором их адгезии к фибриногену, что позволяет рассматривать этот полисахарид в качестве перспективного антитромботического агента [40].
Известно, что каррагинаны имеют широкий спектр антивирусной активности при низких концентрациях и оказывают in vitro ингибирующее влияние на репликацию ряда ДНК- и РНК-вирусов человека и животных [21]. Нами впервые показано действие карра-гинанов на фитопатогенные вирусы, что проявлялось в ингибировании вируса табачной мозаики. Наибольшую антивирусную активность демонстриуют желирующие типы - к- , к/р- и к/1-каррагинаны. Их активность уменьшается с уменьшением молекулярной массы полимеров [30, 37]. В то же время при экспериментальной хантавирусной инфекции наибольшую вирус-ингибирующую активность в опытах in vivo на культуре чувствительных клеток Vero E6 проявляет Х-каррагинан при низких дозах [5]. Для к-каррагинана увеличение антивирусной активности происходит с ростом концентрации полисахарида, что, вероятно, обусловлено его способностью, как было показано выше, образовывать волокнисто-сетчатую структуру, способствующую обволакиванию вируса и ингибированию его прикрепления к клеткам.
В последние годы появились данные о том, что полисахариды, в том числе из морских водорослей, могут перехватывать свободные радикалы in vitro и выполнять функцию ан-тиоксидантов, смягчающих окислительное повреждение в живых организмах [24]. Механизмы действия антиоксидантов могут быть различными: от непосредственного участия в связывании свободнорадикальных групп до повышения устойчивости клеточных структур к их повреждающему действию. Нами установлена потенциальная антиоксидантная активность всех исследуемых каррагинанов, что проявляется в способности перехватывать оксид азота, гидроксил-радикал, супероксид-анион. Антиоксидантная активность каррагинанов уменьшается с ростом pH, зависит от моносахаридного состава, количества и местоположения сульфатных групп в полисахаридах и не связана с их восстанавливающей способностью [41].
На уровне целостного организма нами впервые показано, что каррагинаны усиливают устойчивость организма против токсического действия эндотоксинов (ЛПС) грамотрица-тельных бактерий [7]. С появлением бактериальных патогенов, устойчивых к действию основных классов антибиотиков, использование каррагинанов может способствовать повышению неспецифической резистентности организма и восстановлению его иммунной системы.
В ТИБОХ ДВО РАН разработана БАД «Каррагинан-ДВ», предложенная в качестве дополнительного источника пищевых волокон (Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.11.3.У675.2.10 от 08.02.2010 г.). Изучение терапевтического эффекта БАД при пищевых токсикоинфекциях сальмонеллезной этиологии, проведенное на базе Клинической инфекционной больницы № 2 (г. Москва), показало положительное влияние каррагинана, используемого перорально в комплексной терапии больных, на биохимические показатели, а также на параметры иммунной системы и гемостаза пациентов. При этом действие каррагинана носит регуляторный характер: у больных с гиперкоагуляцией отмечено снижение агрегационной активности тромбоцитов, а у больных с гипокоагуля-цией - возрастание степени агрегации [3]. Эти результаты позволяют надеяться на перспективность практического использования каррагинанов для снижения уровня токсемии, наблюдающейся при развитии инфекционного процесса, вызванного грамотрицательны-ми бактериями.
На базе клиники Медицинского объединения ДВО РАН (г. Владивосток) мы исследовали возможность применения БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии пациентов с ишемической болезнью сердца. Известно, что сердечно-сосудистые заболевания связаны с воспалительными процессами, обусловленными высоким содержанием холестерина и липопротеинов низкой плотности, что приводит к атеросклеротическим осложнениям, в связи с чем показатели липидограмм широко используются в медицинской практике в качестве биомаркеров данного заболевания [34]. Анализ амбулаторных карт 60 больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями показал ускоренную нормализацию показателей
иммунного статуса и биохимических показателей (липидного профиля и параметров хронического воспаления) у пациентов, принимавших БАД «Каррагинан-ДВ» в комплексной терапии [6].
Полученные в экспериментах in vitro и ex vivo данные по иммуномодулирующей, ан-тиоксидантной и антикоагулирующей активности каррагинанов открывают перспективы их использования в медицинской практике и позволяют говорить о положительном полифункциональном эффекте каррагинана при включении его в качестве вспомогательного вещества в комплексную терапию.
С глубокой признательностью посвящаем обзор памяти основателя химии углеводов на Дальнем Востоке, дорогого Учителя академика Юрия Семеновича Оводова.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барабанова А.О., Ермак И.М., Глазунов В.П., Исаков В.В., Титлянов Э.А., Соловьева Т.Ф. Сравнительная характеристика каррагинанов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 430-437.
2. Барабанова А.О., Тищенко И.П., Глазунов В.П., Яковлева И.М., Соловьёва Т.Ф., Зарубина Н.В., Блохин М.Г., Ермак И.М. Химический состав полисахаридов красной водоросли Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae), собранной в разных районах залива Петра Великого Японского моря // Биология моря. 2010. Т. 36. С. 200-206.
3. Ермак И.М., Давыдова В.Н., Аминин Д.Л., Барабанова А.О., Соколова Е.В., Богданович Р.Н., Полякова А.М., Соловьева Т.Ф. Иммуномодулирующая активность каррагинанов из красных водорослей дальневосточных морей // Тихоокеан. мед. журн. 2009. № 3. С. 40-45.
4. Ермак И.М., Реунов А. В., Лапшина Л. А., Бянкина (Барабанова) А. О., Братская С.Ю., Соколова Е.В. Физико-химическое и электронно-микроскопическое исследование каррагинанов - сульфатированных полисахаридов красных водорослей семейств Tichocarpaceae и Gigartinaceae // Химия природ. соединений. 2013. Т. 49. С. 509-511.
5. Максема И.Г., Компанец Г.Г., Барабанова А.О., Ермак И.М., Слонова Р.А. Противовирусное действие каррагинанов из красной водоросли при экспериментальной хантавирусной инфекции // Тихоокеан. мед. журн. 2011. № 1. С. 32-34.
6. Соколова Е.В., Иванова Т.Б., Крыжановский С.П., Богданович Л.Н., Барабанова А.О., Ермак И.М. Влияние биологической активной добавки на основе полисахаридов красной водоросли на липидный обмен пациентов с ишемической болезнью сердца // Тихоокеан. мед. журн. 2012. № 1. С. 26-29.
7. Средство, повышающее неспецифическую сопротивляемость организма к бактериальным эндотоксинам: пат. 2351351 Российская Федерация / И.М. Ермак, Э.И. Хасина, А.О. Барабанова, Т.Ф. Соловьева; ТИБОХ ДВО РАН; опубл. 10.04.2009, Бюл. № 10.
8. Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы морей Дальнего Востока: биология, распространение, запасы, технология переработки. Владивосток: ТИНРО-Центр, 2006. 243 с.
9. Усов А.И., Архипова В.С. Полисахариды водорослей // Биоорган. химия 1981. Т. 7. С. 385-390.
10. Усов А.И., Рехтер М.А., Кочетков Н.К. Полисахариды водорослей. 3. Выделение и предварительное исследование ^-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. // Журн. общ. химии. 1969. Т. 39. С. 905-911.
11. Усов А.И. Химическое исследование полисахаридов красных морских водорослей: автореф. дис. ... д-ра хим. наук. М., 1976. 44 с.
12. Addendum 10. FAO Food and Nutrition Pipe, Compendium of food additives specifications // Joint FAO/WHO expert committee on food additives. 2008. Vol. 59. P. 65-85.
13. Anastyuk S.D., Barabanova A.O., Correc G., Nazarenko E.L., Davydova V.N., Helbert W., Dmitrenok P.S., Yermak I.M. Analysis of structural heterogeneity of kappa/beta-carrageenan oligosaccharides from Tichocarpus crinitus by negative-ion ESI and tandem MALDI mass spectrometry // Carbohyd. Polym. 2011. Vol. 86. P. 546-554.
14. Barabanova A.O., Tishchenko I.P., Glazunov V.P., Solov'eva T.F., Ermak I.M. Characteristics of polysaccharides and protein associated with them from dried and freshly collected red alga Tichocarpus crinitus // Химия природ. соединений. 2010. Т. 46. С. 509-513.
15. Barabanova A., Shashkov A., Glazunov V., Isakov V., Nebylovskaya T., Helbert W., Solov'eva T., Yermak I. Structure and properties of carrageenan-like polysaccharide from the red alga Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // J. Appl. Phycol. 2008. Vol. 20. P. 1013-1020.
16. Bhattacharyya S., Liu H., Zhang Z., Jam M., Dudeja P.K., Michel G., Linhardt R.J., Tobacman J.K. Carrageenan-induced innate immune response is modified by enzymes that hydrolyze distinct galactosidic bonds // J. Nutr. Biochem. 2010. Vol. 10. P. 906-913.
17. Bixler H.J. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan // Hydrobiologia. 1996. Vol. 326/327. P. 35-37.
18. Bulboa C.R., Macchiavello J.E. The effects of light and temperature on different phases of the life cycle in the carrageenan producing alga Chondracanthus chamissoi (Rhodophyta, Gigartinales) // Bot. Mar. 2001. Vol. 44. P. 371-374.
19. Byankina (Barabanova) A.O., Sokolova E.V., Anastyuk S.D., Isakov V.V., Glazunov V.P., Volod'ko A.V., Yakovleva I.M., Solov'eva T.F., Yermak I.M. Polysaccharide structure of tetrasporic red seaweed Tichocarpus crinitus // Carbohyd. Polym. 2013. Vol. 98. P. 26-35.
20. Caceres P.J., Carlucci M.J., Damonte E.B., Matsuhiro B., Zuniga E.A. Carrageenans from chilean samples of Stenogramme interrupta (Phyllophoraceae): structural analysis and biological activity // Phytochemistry. 2000. Vol. 53. P. 81-86.
21. Carlucci M.J., Ciancia M., Matulewicz M.C., Cerezo A.S., Damonte E.B. Antherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types // Antivir. Res. 1999. Vol. 43. P. 93-102.
22. Chapman V.J., Chapman D.J. Seaweeds and their uses. N.Y.: Chapman and Hall, 1980. 334 p.
23. Correc G., Barabanova A., Tuvikene R., Truus K., Yermak I., Helbert W. Comparison of the structures of hybrid K-/p-carrageenans extracted from Furcellaria lumbricalis and Tichocarpus crinitus // Carbohyd. Polym. 2012. Vol. 88. P. 31-36.
24. Costa L.S., Fidelis G.P., Cordeiro S.L., Oliveira R.M., Sabry D.A., Ciara R.B.G., Nobre L.T.D.B., Costa M.S.S.P., Almeida-Lima J., Farias E.H.C., Leite E.L., Rocha H.A.O. Biological activities of sulfated polysaccha-rides from tropical seaweeds // Biomed. Pharmacother. 2010. Vol. 64. P. 21-28.
25. Craigie J.S. Cell wall // Biology of the Red Algae / eds K.M. Cole, R.G. Sheath. Cambridge: Univ. Press, 1990. P. 221-257.
26. Estevez J.M., Ciancia M., Cerezo A.S. Carrageenans biosynthesized by carposporophytes of red seaweeds Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae) and Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae) // J. Phycol. 2002. Vol. 38. P. 344-358.
27. Falshaw R., Bixler H.J., Johndro K. Structure and performance of commercial kappa-2 carrageenan extracts. Pt III. Structure analysis and performance in two dairy applications of extracts from the New Zealand red seaweed // Food Hydrocolloids. 2003. Vol. 17. P. 129-139.
28. Guiry M.D. // Seaweed site. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway, 2008. -http://www.seaweed.ie/ (accessed Apr. 5, 2011).
29. Holdt S.L., Kraan S. Bioactive compounds in seaweed: functional food applications and legislation // J. Appl. Phycol. 2011. Vol. 23. P. 543-597.
30. Kalitnik A.A., Barabanova A.B., Nagorskaya V.P., Reunov A.V., Glazunov V.P., Solov'eva T.F., Yermak I.M. Low molecular weight derivatives of different carrageenan types and their antiviral activity // J. Appl. Phycol. 2013. Vol. 25. P. 65-72.
31. Keppeler S., Ellis A., Jacquier J.C. Cross-linked carrageenan beads for controlled release delivery systems // Carbohydr. Polym. 2009. Vol. 78. P. 973-977.
32. Knutsen S.H., Myslaodski D.E., Larsen B., Usov A.I. A modified system of nomenclature for red algal galactans // Bot. Mar. 1994. Vol. 37. P. 163-169.
33. Lewis G., Stanley N., Guist G. Commercial production and applications of algal hydrocolloids // Algae and Human Affairs / ed. C. Lembi. Seattle: Univ. of Washington, 1998. P. 206-232.
34. Lottenberg A.M.P., Fan P.L.T., Buonacorso V. Effects of dietary fiber intake on inflammation in chronic diseases // Einstein. 2010. Vol. 8. P. 254-258.
35. Pomin V. Structural and functional insights into sulfated galactans: a systematic review // Glycoconj. J. 2010. Vol. 27. P. 1-12.
36. Rees D.A. The carrageenans system of polysaccharides. 1. The relation between the X- and K-components // J. Chem. Soc. 1963. Vol. 1. P. 1821-1832.
37. Reunov A., Nagorskaya V., Lapshina L., Yermak I., Barabanova A. Effect of K/p-carrageenan from red alga Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae) on infection of detached tobacco leaves with tobacco mosaic virus // J. Plant Diseases Protec. 2004. Vol. 111. P. 165-170.
38. Schmidt A.G., Wartewig S., Picker K.M. Potential of carrageenans to protect drugs from polymorphic transformation // Eur. J. Pharm, Biopharmar. 2003. Vol. 56. P. 101-110.
39. Sokolova E.V., Chusovitin E.A., Barabanova A.O., Balagan S.A., Galkin N.G., Yermak I.M. Atomic force microscopy imaging of carrageenans from red algae of Gigartinaceae and Tichocarpaceae families // Carbohyd. Polym. 2013. Vol. 93. P. 458-465.
40. Sokolova E.V., Byankina A.O., Kalitnik A.A., Kim Y.H., Bogdanovich L.N., Solov'eva T.F., Yermak I.M. Influence of red algal sulfated polysaccharides on blood coagulation and platelets activation in vitro // J. Biomed. Mater. Res. Ser. A. 2014. In press.
41. Sokolova E.V., Barabanova A.O., Bogdanovich R.N., Khomenko V.A., Solov'eva T.F., Yermak I.M. In vitro antioxidant properties of red algal polysaccharides // Biomed. Preven. Nut. 2011. Vol. 1. P. 161-167.
42. Stephanie B., Eric D., Sophie F., Christian B., Yu G. Carrageenan from Solieria chordalis (Gigartinales): Structural analysis and immunological activities of the low molecular weight fractions // Carbohyd. Polym. 2010. Vol. 8. P. 448-450.
43. Stortz C., Bacon B., Cherniak R., Cerezo A. High field NMR spectroscopy of cystocarpic and tetrasporic carrageenans from Iridaea undolosa // Carbohyd. Res. 1994. Vol. 261. P. 317-326.
44. Thommes M., Kleinebudde P. Use of K-carrageenan as alternative pelletisation aid to microcrystalline cellulose in extrusion/spheronisation. I. Influence of type and fraction of filler // Eur. J. Pharm., Biopharmar. 2006. Vol. 63. P. 59-67.
45. Tuvikene R., Truus K., Robal M., Volobujeva O., Mellikov E., Pehk T., Kollist A., Kailas T., Vaher M. The extraction, structure, and gelling properties of hybrid galactan from the red alga Furcellaria lumbricalis (Baltic Sea, Estonia) // J. Appl. Phycol. 2010. Vol. 22. P. 51-63.
46. Velde F., Lourenjo N.D., Pinheiro H.M., Bakker M. Carrageenan: A Food Grade and Biocompatible Support for Immobilisation Techniques // Adv. Syn. Cat. 2002. Vol. 344. P. 815-835.
47. Wijesekara I., Pangestuti R., Kim S.-K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae // Carbohyd. Polym. 2011. Vol. 84. P. 14—21.
48. Yakovleva I.M., Yermak I.M., Titlyanov E.A., Barabanova A.O., Glazunov V.P., Skriptsova A.V. Changes in growth rate, anatomy and polysaccharide content of a sterile form of Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr.(Rhodophyta, Tichocarpaceae) grown under differing photon irradiances in the Sea of Japan, Russia // Bot. Mar. 2001. Vol. 44. P. 493—500.
49. Yermak I.M., Barabanova A.O., Glazunov V.P., Isakov V. V., Kim Yong Hwan, Shin Kwang Soon, Titlynova T. V., Solov'eva T.F. Carrageenan from cystocarpic and sterile plants of Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae, Rhodophyta) collected from the Russian Pacific coast // J. Appl. Phycol. 2006. Vol. 18. P. 361—368.
50. Yermak I.M., Khotimchenko Y.S. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red algae // Recent Advances in Marine Biotechnology. 2003. Vol. 23. P. 207—255.
51. Yermak I.M., Kim Y.H., Titlynov E.A., Isakov V.V., Solov'eva T.F. Chemical structure and gel properties of carrageenans from algae belonging to the Gigartinaceae and Tichocarpaceae, collected from the Russian Pacific coast // J. Appl. Phycol. 1999. Vol. 11. P. 41—48.
52. Yermak I.M., Barabanova A.O., Aminin D.L., Davydova V.N., Sokolova E.V., Solov'eva T.F., Kim Y.H., Shin K.S. Effects of structural peculiarities of carrageenans on their immunomodulatory and anticoagulant activities // Carbohyd. Polym. 2012. Vol. 87. P. 713—720.
53. Zhou G., Sun Y., Xin H., Zhang Y., Li Z., Xu Z. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus // Pharmacol. Res. 2004. Vol. 50. P. 47—53.
