CC BY
213
УДК 615.37:577.114:[615.322:582.273]
И.М. Ермак1, В.Н. Давыдова1, Д.Л. Аминин1, А.О. Барабанова1, Е.В. Соколова1, Р.Н. Богданович2, А.М. Полякова3, Т.Ф. Соловьева1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),
2 Медицинское объединение ДВО РАН (690022 г. Владивосток, ул. Кирова, 95), 3 Центральный НИИ эпидемиологии (111123 г. Москва, ул. Новогиреевская, 3)
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ КАРРАГИНАНОВ ИЗ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ
Ключевые слова: каррагинаны, цитокины, фагоцитоз, иммунный статус.
В клинике и эксперименте изучено иммуномодулирующее действие сульфатированных полисахаридов — кар-рагинанов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae Японского моря. На основе данных, полученных in vitro, показана зависимость иммуномодулирующей активности от структуры полисахаридов. Наиболее ярко выраженным биологическим эффектом обладал лямбда-каррагинан. Под его влиянием увеличивалась концентрация ионов кальция в мышиных лимфоцитах, усиливалось формирование активных форм кислорода в макрофагах и индукция апоптоза в клетках карциномы Эрлиха. Более высокая способность индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов обнаружена у каппа- и каппа/йота каррагинанов, установлена концентрационная зависимость цитокининдуцирующей активности от концентрации полисахаридов. На основе клинических испытаний отмечено положительное влияние каррагинана, используемого в комплексной терапии больных острыми кишечными инфекциями, на состояние иммунной системы и параметры гемостаза.
В ряду веществ, способных восстанавливать функциональную активность иммунокомпетентных клеток, особое место отводится растительным полисахаридам, которые могут не только модулировать различные свойства иммунной системы, но и обладают способностью к сорбции радионуклидов, тяжелых металлов и бактерий, нормализации липидного обмена, активации секретирующей и моторной функций кишечника [8, 9, 11]. Реакция иммунной системы на пероральное введение полисахаридов не носит общего характера. Иммунотропное действие некоторых растительных полисахаридов можно отнести к феномену пищевой толерантности, а ряда других — к явлению усиления иммунного ответа [2, 10].
Сульфатированные полисахариды красных водорослей — каррагинаны — относятся к растворимым пищевым волокнам и внесены в список пищевых и медицинских продуктов [6, 14]. Среди разнообразной биологической активности каррагинанов в настоящее время наибольший интерес привлекают противоязвенная, антикоагулирующая, противоопухолевая и противовирусная [9, 14]. Биологические свойства каррагинанов находятся в тесной связи с их физико-химическими свойствами и структурой, которая отличается большим разнообразием (к настоящему времени описано около 20 типов этих со-
Ермак Ирина Михайловна — д-р хим. наук, в.н.с. лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН; тел.: 8 (4232) 31-07-19; e-mail: iren@piboc.dvo.ru.
единений) и блочным строением полимерной цепи, что определяется родовой принадлежностью водоросли и условиями ее произрастания [7, 9, 14]. Такие полисахариды полиионной природы, как карраги-наны, способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, что может обеспечивать модуляцию различных звеньев иммунной системы. В экспериментах in vivo показано, что каррагинаны влияют на синтез иммуноцита-ми провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли и являются индукторами интерферона — важного неспецифического фактора защиты организма от инфекции [12]. Каррагинанам присущи также свойства иммуноадъювантов: они способны оказывать как иммуностимулирующий, так и иммуносупрессорный эффекты [4, 9]. Однако имеющиеся литературные данные о физиологической активности каррагинанов приведены в основном для коммерческих образцов и в большинстве своем не учитывают структурные особенности этих сульфатированных полисахаридов.
Данная работа посвящена анализу иммуномодулирующего действия каррагинанов различных структурных типов, выделенных из красных водорослей дальневосточных морей.
Материалы и методы. Водоросли Chondrus armatus, Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae) и Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae) были собраны в Японском море (залив Петра Великого, м. Фальшивый). Полисахариды выделяли, фракционировали, идентифицировали методами инфракрасной и 13С-ядерно-магнитно-ре-зонансной спектроскопии [1, 13]. Способность кар-рагинанов вызывать индукцию синтеза фактора некроза опухоли и интерлейкинов в опытах in vitro была определена на основе методики J. Bienvenu at al. [5] и по схеме, описанной нами ранее [15].
Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей линии BALB/С, которых выводили из эксперимента методом перивисцеральной дислокации. Перитонеальную жидкость инкубировали (37°С, 1 час) в чашках Петри до полного прикрепления макрофагов ко дну чашек, клеточный монослой трижды промывали фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) и снимали с поверхности чашек. Рабочая концентрация составляла 5х106 клеток/мл. Лимфоциты (спле-ноциты) получали из селезенки мышей, которую измельчали в фосфатно-солевом буферном растворе
(pH 7,4). Клеточную суспензию пропускали через нейлоновый газ и полученную взвесь клеток трижды отмывали фосфатно-солевым буфером, затем центрифугировали (1500 об./мин, 5 мин) и ресуспензи-ровали в необходимом количестве буфера. Конечная концентрация в растворе — 2—5х106 клеток/мл.
Для определения лизосомальной активности в макрофагах с помощью флуоресцентного зонда в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 10 мкл вещества и по 100 мкл суспензии клеток и инкубировали смесь при 37°С в течение 1 часа. После этого в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора акридинового оранжевого и инкубировали смесь при 37°С в течение 30 мин). Флуоресценцию измеряли при X =485 нм и X =538 нм.
г ех ет
Кальций, являясь одним из основных вторичных посредников в передаче и усилении внутриклеточных сигналов, функционирует как универсальный ион и ключевой элемент в огромном разнообразии внутриклеточных процессов, в том числе и в активации иммунологических реакций. Для определения активности ионов кальция в лимфоцитах к суспензии клеток добавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера, 10 мкл флуоресцентного зонда Са1сшт^гееп-1/АМ и инкубировали при перемешивании 1 час в темноте. Затем лимфоциты отмывали от свободного зонда, центрифугируя их трижды (1500 об./мин, 5 мин). Ре-суспензировали клетки раствором фосфатно-солевого буфера и раскапывали по 10 мкл вещества и по 100 мкл клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Флуоресценцию измеряли при Хех=485 нм и X =518 нм.
ет
Для детекции активных форм кислорода (перекиси водорода и синглетного кислорода) в перитонеальных макрофагах с помощью флуоресцентного зонда в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 10 мкл вещества и 100 мкл суспензии клеток, инкубировали 1 час. После этого в лунки добавляли раствор зонда дигидрородамина-123 и снова инкубировали при 37°С 10 мин. Флуоресценцию измеряли при X =485 нм и X =518 нм.
г ех ет
Цитотоксическую активность каррагинанов и их влияние на конденсацию хроматина изучали на модели мышиной карциномы Эрлиха. Клетки карциномы (200 мкл в каждой лунке 96-луночного планшета, содержащей по 20 мкл тестируемых соединений, инкубировали при 37°С 1 час. Затем к клеточной суспензии добавляли 10 мкл концентрированного раствора Hoechst 33342 (конечная концентрация 5 мкМ) и через 5 мин измеряли флуоресценцию при Xex=355 нм и Xem=460 нм. Параллельно в смесь суспензии клеток и тестируемых веществ вносили по 10 мкл водного раствора этидиума бромида (концентрация 2,5 мкг/ мл), инкубировали при 37°С 10 мин. Интенсивность флуоресценции измеряли при Xex=485 нм, Xem=620 нм. Заключение об индукции апотоза в клетках делали на основании сравнительного измерения интенсивностей флуоресценций.
Использовали растворы Эрла и Хэнкса, DMEM, RPMI-1640, HEPES, EGTA (Sigma, США), трипано-вый синий (Flow, США), Fluorescein diacetate, Acridine orane, Hoechst 33342, Dihydrorhodamine 123, Calcium Green-1/AM (Molecular Probes, США), фосфатно-солевой буферный раствор («Биолот», Россия).
Изучение терапевтического эффекта каррагинана при пищевых токсикоинфекциях сальмонеллезной этиологии проведено на базе Клинической инфекционной больницы № 2 (г. Москва). Основанием для клинических испытаний было разрешение Государственного комитета РФ по стандартизации, метрологии и сертификации (№ 035/002158 от 21.06.1999 г.) на применение каррагинана в качестве пищевой добавки и согласие этического комитета ЦНИИ эпидемиологии. Проведено динамическое обследование 42 больных (мужчины и женщины, средний возраст — 31 год) с выраженным интоксикационным синдромом. Пациенты поступали в стационар на 1-3-и сутки болезни с признаками интоксикации и обезвоживания: температура тела — до 38-39°С, озноб, головная боль, частый (10—15 раз в сутки) жидкий стул, тошнота, многократная рвота. Каррагинан (смесь каппа- и лямбда-соединений — 3:1) в течение первых двух суток вводили per os с раствором хлосоль в дозе 150 мл за 3 приема 22 больным. Контрольную группу составили пациенты, получавшие базовую терапию (солевые растворы). Результаты оценивали по клиническим данным и результатам исследования параметров систем гемостаза и ммунитета.
Гемостаз характеризовали следующие показатели: протромбиновое время, тромбиновое время, активированное парциальное тромбопластиновое время и уровень фибриногена F. Для характеристики системы иммунитета подсчитывали относительное и абсолютное количество лимфоцитов. С помощью кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation — CD) определяли Т-лимфоциты ^D3+), В-лимфоциты ^D19+), а также иммунорегуляторные субпопуляции: Т-хелперы (CD4+) и цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+). Исследования проводили методом проточной цитометрии на цитометре EPICS XL (Beckman Coulter) с использованием моноклональных антител IO-Test (двойная метка). Функциональную активность нейтрофилов венозной крови определяли с помощью спонтанного и стимулированного теста с нитросиним тетразолием (НСТ-теста) и выражали в условных единицах.
Результаты исследования. Полисахариды были выделены из красных водорослей, представителей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae и фракционированы на желирующие и нежелирующие типы. Согласно данным спектроскопии, желирующие типы полисахаридов из водоросли C. armatus относятся к каппа-каррагинану, а из T. crinitus и C. pinnulatus — к гибридным каппа/бета- и каппа/йота-структурам соответственно [1, 13]. Нежелирующие полисахариды были представлены как лямбда-каррагинаном,
Структура каррагинанов из водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae
Таблица 1
1 ж — желирующие (KCL-нерастворимые фракции) и н/ж — нежелирующие (KCL-растворимые фракции) типы каррагинанов.
180- S % X
1 а 160 — а g
1 £140- 0 1
б § 120гг I 1
о. 5 £ loos' К/1 I I
1
180 —
I 160л §
I" 140—|
*
I 120—| |
1 10°-
-53
Ч о
к/р
Образцы (концентрация 100 мг/мл)
Образцы (концентрация 100 мг/мл)
Рис. 1. Влияние каррагинанов на концентрацию Ca2+ в ци- Рис. 2. Влияние каррагинанов на лизосомальную актив-
топлазме лимфоцитов селезенки мышей.
ность макрофагов.
так и новым структурным типом — икс-каррагинаном. Молекулярные массы использованных в работе полисахаридов находились в пределах 246—420 кДа (табл. 1). Для исследования иммуномодулирующего действия каррагинанов разных структурных типов использовали различные экспериментальные системы.
Присутствие лямбда-каррагинана в инкубационной среде в течение 5 мин вызывало увеличение концентрации кальция в цитоплазме мышиных сплено-цитов почти в два раза (рис. 1). Полумаксимальная эффективная концентрация этого полисахарида, рассчитанная графическим способом, равнялась 61 мкг/мл. Лямбда-каррагинан оказывал выраженное воздействие и на макрофаги, активируя процесс формирования активных форм кислорода на 30% интенсивнее по сравнению с контролем.
В экспериментах, позволяющих оценить влияние препаратов на отдельные стороны поглотительной
способности (фагоцитоза) иммунокомпетентных клеток, были использованы каррагинаны в концентрации 100 мкг/мл и в качестве образца — липополи-сахарид из Escherichia coli. Среди исследованных веществ каппа/бета-каррагинан показал наибольшую эффективность. Он увеличивал активность лизосом макрофагов мыши на 30%, что выражалось в увеличении размеров органелл, их количестве и степени закисления. Эффективная концентрация этого кар-рагинана, вызывающая полумаксимальный эффект, была равна 37 мкг/мл. Остальные каррагинаны не проявляли активности в этом тесте (рис. 2).
Способность каррагинанов активировать клетки и вызывать в них синтез цитокинов была соотнесена с активностью митогена — липополисахарида, цитокин-индуцирующая активность которого была принята за 100%. Все исследованные образцы каррагинанов проявляли цитокининдуцирующую активность, стимулируя
Контроль 1 2 3 4 5 6 Контроль 1 2 3 4 5 6
И II і II і
10 мкг/мл 1 мкг/мл 100 нг/мл 10 нг/мл 1 нг/мл Рис. 3. Пpoдyкция фaктopa нeкpoзa oпyxoли-a (а) и интepлeйкина-б (б), индyциpoвaннaя липoпoлиcaxapидoм (1), каппа/бета- (2), каппа/тата- (3), каппа- (4), лямбда- (5) и икc-кappaгинaнoм (б).
синтез фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-6 мононуклеарными клетками крови человека (рис. 3).
Конденсация хроматина является одним из маркеров наступления апоптоза (запрограммированной смерти) клеток. При этом важно, чтобы вызывающие ее препараты не проявляли цитотоксического эффекта. Среди исследованных соединений ни одно не оказывало цитотоксического действия, оцененного в тесте с этидиумом бромидом. В то же время лямб-да-каррагинан в концентрации 100 мкг/мл оказывал существенное влияние на процесс конденсации хроматина в ядрах опухолевых клеток, что регистрировалось по резкому увеличению накопления флуоресцентного зонда Hoechst 33342. Это позволяет предположить, что среди исследованных полисахаридов лямбда-каррагинан обладает селективным противоопухолевым действием и может рассматриваться как противоопухолевый препарат.
При исследование параметров системы гемостаза у 18 пациентов с пищевыми токсикоинфекциями были выявлены признаки гиперкоагуляции (1-я фаза синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови) и у 24 — симптомы гипокоагуляции (2-я фаза синдрома). Из плазменных параметров наиболее информативными оказались значения активированного парциального тромбопластинового времени, которые также свидетельствовали о гипер- и гипокоагу-ляционных процессах у больных при поступлении в стационар. Как показали результаты, пероральное введение каррагинана на фоне стандартной терапии более активно по сравнению с контрольной группой восстанавливало систему гемостаза. На 3-и сутки лечения с применением каррагинана наблюдалось снижение лейкоцитоза, уменьшение до нормальных значений количества активированных клеток, увеличение относительного и абсолютного числа лимфоцитов в периферической крови за счет общей популяции Т-лимфоци-тов и их иммунорегуляторных субпопуляций (табл. 2).
Обсуждение полученных данных. Разнообразный структурный дизайн каррагинанов обусловливает широкий спектр их биологических свойств. Наиболее ярко выраженным эффектом из исследованных соединений обладал лямбда-каррагинан, повышавший
концентрацию ионов кальция в лимфоцитах, усиливавший интенсивность формирования активных форм кислорода в макрофагах и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокая активность в этих тестах лямбда-каррагинана может быть обусловлена высокой степенью его сульфатирования, что, как было показано для других полисахаридов, играет важную роль в проявлении иммуностимулирующей активности [11]. В то же время в экспериментах, позволяющих оценить влияние выбранных соединений на фагоцитоз имму-нокомпетентных клеток, наибольшую эффективность проявлял каппа-каррагинан, существенно стимулируя активность лизосом макрофагов мыши.
Способность влиять на продукцию цитокинов в значительной мере зависела от концентрации карра-гинанов и их структуры. В диапазоне 10—1,0 мкг/мл все типы каррагинанов вызывали повышение уровней фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-6 (по сравнению со спонтанной индукцией), в то время как при низкой концентрации они были малоактивны. Наибольшей цитокининдуцирующей активностью в области высоких концентраций обладал каппа-кар-рагинан, а наименьшей — икс-каррагинан. Подобные результаты были получены японскими исследователями, которые обнаружили высокую индуцирующую активность желирующих полисахаридов — каппа- и йота-каррагинанов [12].
Ранее в экспериментах in vivo нами было показано, что каппа- и лямбда-каррагинаны ингибируют токсичность липополисахарида грамотрицательных бактерий и повышают резистентность организма к действию эндотоксинов [3]. Известно, что гиперреакция иммунной системы на фрагменты бактериальных клеток лежит в основе многих воспалительных заболеваний кишечника, в связи с чем в комплексной терапии кишечных инфекций показано применение средств, в том числе растительных полисахаридов, восстанавливающих нормальную микрофлору [8, 10]. На собственном материале введение каррагинана в схему стандартной терапии токсикоинфекций способствовало коррекции гемостаза. При этом действие препарата носило модулирующий (регуляторный) характер: у больных с гиперкоагуляцией отмечалось
Таблица 2
Иммунологические показатели у больных острыми кишечными инфекциями в динамике на фоне стандартной терапии
и лечения с применением каррагинана
Показатель Норма До лечения На 3-и сутки терапии Контроль
(n=42) с каррагинанами (n=22) без каррагинанов (n=20) (n=20)
Лейкоциты, абс.х109/л 4,0—8,8 8,3±3,3 6,6±2,92, 3 5,7±1,8 6,5±1,5
Нейтрофилы % 48-75 81,4±8,51 60,8±8,93 67,8±5,7 62,5±11,4
абс.х109/л 2,1—5,6 6,8±3,21 4,2±2,73 3,9±1,3 4,12±1,6
Лимфоциты % 7 3 9 13,7±6,91 31,5±7,52, 3 26,0±5,41 34,0±10,6
абс.х109/л 1,2—3,0 1,0±0,41 2,0±0,72, 3 1,37±0,31 2,1±0,6
CD3+ % 55—75 66,4±8,4 73,5±7,43 74,2±5,2 68,7±7,3
абс.х109/л 0,9—2,2 0,7±0,31 1,4±0,52, 3 1,0±0,21 1,42±0,3
CD4+ % 5 6 5 3 43,0±20,0 45,7±7,4 49,8+4,1х 40,0±17,0
абс.х109/л 0,6—1,9 0,5±0,21 0,9±0,33 0,8±0,3 0,8±0,1
CD8+ % 2 3 О 22,3±14,5 24,5±6,4 22,8±5,2 25,6±6,0
абс.х109/л 0,3—0,9 0,3±0,11 0,5±0,2 0,4±0,2 0,6±0,2
CD4/CD8 1,2—2,5 2,2 (0,4—4,8) 2,0 (0,9—3,6) 2,4 (1,5—3,4) 1,6 (1,1—2,5)
CD19+ % 5—15 15,4±5,1 11,7±3,43 10,9±4,0 12,4±3,5
абс.х109/л 0,12—0,44 0,2±0,11 0,2±0,12, 3 0,2±0,11 0,3±0,1
1 Разница с
2 Разница с
контролем статистически значима. группой «без каррагинанов» статистически значима. Разница с показателями до лечения статистически значима.
снижение агрегационной активности тромбоцитов (в среднем на 65%), а у больных с гипокоагуляцией степень агрегации возрастала (в среднем на 22%). Как показали клинические испытания в группе пациентов, принимавших каррагинан, нормализация показателей иммунной системы происходила значительно быстрее, чем в контрольной группе. Достаточно быстрое восстановление показателей иммунной системы при приеме каррагинана, вероятно, обусловлено его иммунорегуляторными свойствами.
Полученные данные свидетельствуют о корригирующем влиянии каррагинана на параметры системы гемостаза и показатели иммунной системы у обследованных больных. Таким образом, структурное разнообразие выделенных каррагинанов обеспечивает широкий спектр их иммуномодулирующей активности. Результаты проведенных работ позволяют надеяться на эффективное использование каррагинана в комплексной терапии различных форм бактериальных инфекций.
Работа поддержана грантом по программе президиума ДВО РАН « Молекулярная и клеточная биология» и « Фундаментальная наука - медицине».
Литература
1. Барабанова А.О., Ермак И.М., Глазунов В.П. и др. Сравнительная характеристика каррагинанов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 430—437.
2. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Елякова Л.Л. Структура и иммунотропное действие 1,3; 1,6-в-D-глюканов. Владивосток: Дальнаука, 2002.
3. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Малеев В.В. Влияние каррагинана на неспецифическую резистентность мышей при ЛПС-индуцированной эндотоксемии // ЖМЭИ. 2007. № 2. С. 57-60.
4. Abe T., Kawamura H., Watanable H. et. al. Liver injury due
to sequential activation of natural killer cells and natural killer T cells by carrageenan // J. Hepatol. 2002. Vol. 36, No. 3. P. 614-623.
5. Bienvenu J., Doche C., Gutowski M. et. al. Production of proin-flammatory cytokines and cytokines involved in the TH1/TH2 balance is modulated by pentoxifylline // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1995. Vol. 25. P. 80-84.
6. Bixler H.J. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan. //Hydrobiologia. 1996. Vol. 326/327. P. 35-57.
7. Falshaw R., Richard H., David E. Stevenson. Structural analysis of carrageenans from the red alga, Callophyllis hombroni-ana Mont. K (Kallymeniaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Research: 2005. Vol. 340, No. 6. P. 1149-1158.
8. Kilpatric D.C. Immunological aspects of the potential role of dietary carbohydrates and lectins in human health //Eur. J. Nutr. 1999.Vol. 38. P. 107-117.
9. Lahaye M., Kaeffer B. Seaweed dietary fibres: structure, physicochemical and biological properties relevant to intestinal physiology // Sciences and Aliments. 1997. Vol. 17. P. 563-584.
10. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G. et. al. Effects of polysaccharides from Silen vulgaris on phagocytes // Int. J. Immu-nopharmacol. 1999. Vol. 21. P. 617-624.
11. Rosha de Souza M.C., Marques C.T., Guerra Dore C.M. et. al. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds // J. Appl. Phycol. 2007. Vol. 19. P. 153-160.
12. Tadeta K., Irifune K., Tomono K. et. al. Potential activity of carrageenan to enhance antibacterial host-defense system in mice // J. Infect. Chemother. 1995. Vol. 1. P. 59-63.
13. Yermak I.M., Kim Yong Hwan, Titlyanov E.A. et. al. Chemical structure and gel properties of carrageenan from algae belonging to the Gigartinaceae and Tichocapaceae, collectedfrom the Russian Pacific coast// J. Appl. Phycol. 1999. Vol. 11. P. 41-48.
14. Yermak I.M., Khotimchenko Yu.S. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red algae// in Recent Advances in Marine Biotechnology (Fingerman M, Nagabhushanam R. eds). Sci. Publ. Inc. USA- UK. 2003. Vol. 9. P. 207-255.
15. Yermak I.M., Davidova V. N., Gorbach V.I. et. al. Forming and immunological properties of some lipopolysaccharide-chitosan complexes // Biochimie. 2006. Vol. 88. No 1. P. 23-30.
Поступила в редакцию 14.04.2009.
IMMUNOMODULATING ACTIVITY OF THE FAR EASTERN SEA RED ALGAE-DERIVED CARRAGEENANS
I.M. Ermak1, V.N. Davidova1, D.L. Aminin1, A.O. Barabanova1, E.V. Sokolova, R.N. Bogdanovich2, A.M. Polyakova3,
T.F. Soloviova1
1 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia), 2 Medical Society, FEB RAS (95, Kirov St. Vladivostok 690022 Russia),
3 Central Research Centre of Epidemiology (3a Novogireevskaya St., Moscow 111123Russia)
Summary — Both in clinic and laboratory, the authors have studied immunomodulating effects of sulphated polysaccharides — carra-geenans — derived from the red algae of Gigartinaceae and Ticho-carpaceae families (Sea of Japan). In vitro studies allowed to de-
fine dependence between immunomodulating activity and polysaccharides structure. Lambda-carrageenan was deemed to have the most pronounced biological effect proved to increase calcium ion concentration in mice lymphocytes, generate active forms of oxygen in macrophages and induce apoptosis in Ehrlich>s carcinoma cells. Kappa and kappa/iota-carrageenans showed higher capability to induce generation of pro-inflammatory cytokines. There was concentration dependence between cytokine-inducing activity and polysaccharide concentration. Clinical testing allowed to note positive effects of carrageenan used in integrated treatment of patients suffering from acute enteric infections on the immune system and hemostatic parameters.
Key words: carrageenans, cytokines, phagocytosis, immunological status.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 40—45.
УДК 612.112:612.017.1:579.841.11:577.114
Т.П. Смолина1, Т.С. Запорожец1, Р.П. Горшкова2, Е.Л. Назаренко2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
РАННЯЯ АКТИВАЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ И МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА КОМПОНЕНТАМИ ПРОТЕОБАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS
Ключевые слова: липополисахарид, полисахарид, морские бактерии, активация лимфоцитов.
Методом двуцветного анализа на проточном цитометре определяли влияние липополисахарида, выделенного из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, и его структурных компонентов на раннюю активацию мо-нонуклеаров клеток крови человека. Липополисахарид, О-специфический полисахарид (О-ПС) и олигосахарид кора (Cor) повышали уровень экспрессии CD69 и CD25 на лимфоцитах CD4+, CD8+, CD16+ и CD69 на моноцитах. Липополисахарид увеличивал экспрессию CD95 на клетках CD4+, CD8+, CD16+, а О-ПС и Cor — только на CD4+. Ни один из исследуемых гликополимеров не вызывал статистически значимого изменения уровня экспрессии CD38. О-ПС и Cor сильнее увеличивали экспрессию активационных маркеров на моноцитах и лимфоцитах, чем липопо-лисахарид. В большей степени О-ПС и Cor активировали клетки, способные оказывать цитотоксическое действие.
Морские бактерии являются важной составной частью морских экосистем и могут быть получены практически из каждого образца морской воды и морских животных. Многие выделенные из морских микроорганизмов гликополимеры имеют в своем составе уникальные структурные компоненты и могут оказывать биологическое действие, нередко более выраженное, чем аналогичные вещества из наземных организмов, однако эти полимеры еще недостаточно изучены. В составе полисахаридов морских протеобактерий рода Pseudoalteromonas идентифицированы редкие и необычные N-ациламино- и кислые моносахариды, а также высшие сахара [1].
Ранее нами было установлено, что кислые капсульный и клеточные полисахариды морских микроорганизмов рода Pseudoalteromonas обладают способностью
Смолина Татьяна Павловна - канд. биол. наук, в.н.с. лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.:8 (4232) 44-24-46; e-mail: tsmol@mail.ru.
блокировать адгезию патогенных микроорганизмов на клетках животных и человека [4]. Существенное значение в обеспечении антиадгезивного действия имеет наличие в гликополимерах ацетильных групп и/или углеводной последовательности, состоящей из остатков D-глюкозы, D-маннозы и D-глюкуроновой кислоты [4]. Большую роль в снижении степени адгезии бактерий липополисахаридом Pseudoalteromonas nigrifaciens (штамм КММ 156) играет его фрагмент — О-спе-цифический полисахарид (О-ПС), в то время как другой фрагмент — олигосахарид кора (Cor) — не влияет на процесс адгезии [5].
Липополисахарид (ЛПС) и другие компоненты бактерий представляют собой биологические сигнальные молекулы, способные активизировать врожденные и приобретенные системы защиты организма. Цель настоящей работы: определить влияние ЛПС P. nigrifaciens на активацию лимфоцитов и моноцитов человека, а также выяснить, оказывают ли стимулирующее действие на лимфоциты и моноциты компоненты ЛПС, лишенные липида А (О-ПС и Cor). Для этого определяли экспрессию маркеров активации — кластеров дифференцировки (Claster of Differentiation — CD) 69, 25, 38 и 95 на лимфоцитах. Раннюю активацию моноцитов оценивали по экспрессии CD69.
Материал и методы. Гликополимеры получены из бактерий P. nigrifaciens штамма КММ 156, выделенного из ткани желудка дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus (бухта Троица) и находящегося в коллекции морских микроорганизмов (ТИБОХ ДВО РАН). О-ПС, входящий в состав ЛПС, имеет идентичное строение с капсульным полисахаридом и состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы,
