CC BY
49
Вестник ДВО РАН. 2009. № 3
УДК 612.119: 616-019-/98: 579.234
Т.П.СМОЛИНА, ТС.ЗАПОРОЖЕЦ, И.А.ОРЛОВСКАЯ, РП.ГОРШКОВА, Е.Л.НАЗАРЕНКО, Н.Н.БЕСЕДНОВА
Влияние гликополимеров из морских протеобактерий на кроветворение
Дается оценка возможного ингибиторного или стимулирующего эффекта липополисахаридов и полисахаридов, выделенных из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, в отношении пролиферативной активности ранних гемопоэтических предшественников и направления дифференцировки коммитированных предшественников кроветворных клеток.
Ключевые слова: гемопоэз, морские бактерии, Pseudoalteromonas, клеточная стенка бактерий, липополиса-харид, полисахарид, пролиферация, дифференцировка, коммитированные предшественники.
The effect of glycopolymers from marine proteobacteria on hemopoiesis. T.P.SMOLINA, T.S.ZAPOROZHETS (Research Institute of Epidemiology and Microbiology, SB RAMS, Vladivostok), I.A.ORLOVSKAJA (Institute of Clinical Immunology, SB RAMS, Novosibirsk), R.P.GORSHKOVA, E.L.NAZARENKO (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), N.N.BESEDNOVA (Research Institute of Epidemiology and Microbiology, SB RAMS, Vladivostok).
The purpose of the present work is estimation of possible inhibitory or stimulating effect of lipopolysaccharides and polysaccharides, isolated from cell-walls of marine proteobacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens, on the proliferation activity of early hemopoietic precursors and differentiation orientations of committed precursors of the blood-forming cells.
Key words: hemopoiesis, marine bacteria, Pseudoalteromonas, bacterial cell wall, lipopolysaccharide, polysaccharide, proliferation, differentiation, committed precursors.
Многие исследования свидетельствуют о том, что морские гетеротрофные микроорганизмы синтезируют уникальные по структуре и действию биоактивные вещества, которые не обнаруживаются у наземных прокариот, несмотря на более чем полувековую историю таких поисков (см., например, [12]). Есть факты, говорящие в пользу микробного происхождения биологически активных веществ, полученных из морских макроорганизмов (губок, моллюсков, водорослей и других объектов), поскольку бактерии, являясь симбионтными организмами, могут составлять большую часть биомассы хозяев [15,17]. В связи с этим представляются актуальными исследования, направленные на получение новых высокоэффективных нетоксичных биологически активных веществ из морских микроорганизмов, изучение молекулярных и клеточных механизмов их действия и создание на основе этих компонентов лекарственных препаратов.
СМОЛИНА Татьяна Павловна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, ЗАПОРОЖЕЦ Татьяна Станиславовна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией, БЕСЕДНОВА Наталия Николаевна - академик РАМН, директор (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток), ОРЛОВСКАЯ Ирина Анатольевна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией (Институт клинической иммунологии, Новосибирск), ГОРШКОВА Раиса Петровна - кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник, НАЗАРЕНКО Евгений Львович - кандидат химических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: [email protected]
Работа поддерживается грантом РФФИ 08-04-12069-офи.
Представители морских прокариот рода Pseudoalteromonas составляют значительную часть микробной биомассы моря и могут быть выделены практически из каждого образца морской воды, а также из моллюсков [4]. Эти морские бактерии - перспективные продуценты биологически активных веществ. Одним из наиболее примечательных признаков бактерий рода Pseudoalteromonas является их фенотипическая вариабельность [4, 5]. Гли -кополимеры исследованных нами штаммов Pseudoalteromonas представляют собой либо липополисахариды (ЛПС) с аномально низким содержанием липида А (основного структурного компонента, определяющего токсичность ЛПС), либо биополимеры полисахаридной природы. Большинство из них содержат редкие и необычные сахара [3] и оказывают биологическое действие на прокариотические и эукариотические клетки [7-9].
Бактериальные компоненты могут оказывать влияние на систему кроветворения [19]; ранее нами установлена биологическая активность гликополимеров грамотрицательных морских протеобактерий [7-9]. Целью данной работы явилась оценка возможного ингибиторного или стимулирующего эффекта липополисахаридов и полисахаридов (ПС), выделенных из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, в отношении пролиферативной активности ранних гемопоэтических предшественников и дифферен-цировочной направленности коммитированных предшественников кроветворных клеток. Как известно, кроветворение - сложный многостадийный процесс клеточных делений и дифференцировок, в результате которого образуются зрелые, функционально полноценные клетки крови [13]. Изучение механизмов пролиферации и дифференцировки гемо-поэтических предшественников необходимо для решения одной из актуальных проблем иммунологии - регуляции иммунного ответа.
В работе использовали четыре гликополимера, полученных из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens:
1. КПС - кислый капсульный полисахарид из бактерий типового штамма IAM 13010Т, состоит из пентасахаридных повторяющихся звеньев, построенных из двух остатков 2-аце-тамидо-2-дезокси-Э-глюкозы, 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-Ь-галактозы (L-фукозамина), 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-Ь-талозы (N-ацетилпневмозамина) и 3-дезокси-Э-манно-ок-тулозоновой кислоты (KDO) [14].
2. ЛПС1 - липополисахарид из бактерий штамма КММ 156, которые выделены из ткани желудка дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus (штамм находится в Коллекции морских микроорганизмов (KMM) ТИБОХ ДВО РАН). О-спе-цифический ПС, входящий в состав ЛПС, состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы и по одному остатку 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозы и 3-О-[(К)-1-карбоксиэтил]-Э-глюкозы (глюколактиловой кислоты) [2]. В состав ЛПС кроме О-специфического ПС входят липид А в аномально низком количестве и олигосахарид кора.
3. ЛПС2 - липополисахарид из бактерий штамма КММ 161, которые выделены из мантии гребешка приморского Patinopecten yessoensis. О-специфический полисахарид этого ЛПС содержит остатки D-галактозы, 2-ацетамидо-2-дезокси-Э-глюкозы, 3,6-диде-зокси-3-(4-гидроксибутирамидо)^-галактозы и 2-ацетамидо-2-дезокси-Ь-гулуроновой кислоты [1].
4. О-ПС - кислый О-специфический ПС, полученный из бактерий штамма КММ 637, построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих остатки D-глюкозы, D-маннозы и D-галактуроновой кислоты следующего строения [6]: ^4)-p-D-Glcp-(1^4)-P-D-GalpA-(1^4)-p-D-Manp-(1^. Кроме того, ПС содержит в своем составе О-ацетиль-ную группу (4,5%), локализация которой в полисахаридной цепи не установлена.
В качестве экспериментальных животных использованы мыши (CBA • C57Bl/6)F1-гиб-риды 3-6 мес, полученные из НИЛ ЭБМ Томского научного центра СО РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария, выводили из эксперимента в состоянии эфирного наркоза.
Для исследования ингибиторного эффекта изучаемых гликополимеров на пролиферативную активность кроветворных предшественников мышам однократно внутрибрюшин-но в дозе 100 мг/кг вводили тестостерон-пропионат за 4-48 ч до взятия костного мозга. Известно, что эта доза препарата вызывает увеличение пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток (СКК) [11]. Клетки костного мозга (ККМ) получали промыванием бедренных костей мышей, отмывали средой RPMI 1640 и определяли их жизнеспособность и концентрацию. Для исследования ингибиторного и стимулирующего эффекта изучаемых гликополимеров на пролиферативную активность гемопоэтических клеток in vitro ККМ (106/мл) инкубировали при температуре +37°С в течение 4 ч с гликополимерами (конечная концентрация 100 мкг/мл). Для определения количества клеток, находящихся в S-фазе, ККМ в концентрации 7-12 • 106 кл./мл инкубировали в присутствии 30 мкг/мл цитотоксического препарата Ara-C (Sigma) в течение 1 ч при температуре +37°С. Контрольную взвесь тех же клеток инкубировали в таких же условиях, но без Ara-C. После инкубации клетки отмывали холодной средой RPMI 1640, после чего ККМ в количестве 0,5 • 105 кл./мышь вводили внутривенно сингенным летально облученным реципиентам. Облучение животных проводили на аппарате РУМ-25 при мощности дозы 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10 мА. Во всех экспериментах животные получали дозу облучения -9,5 Гр. На 8-е сутки подсчитывали число колониеобразующих единиц в селезенке (КОЕс-8). Процентное содержание клеток, находящихся в S-фазе митотического цикла, определяли по формуле
Кол-во клеток в S-фазе, % = (а - в)/а • 100,
где а - количество колоний, образованных клетками без Ara-C, в - количество колоний, образованных клетками, преинкубированными с Ara-C [10].
Для исследования эффекта на модели in vivo гликополимеры вводили мышам в дозах 5 мг/кг массы дважды: за 1 сут и за 2 ч до взятия ККМ. Контрольным животным вводили аликвотный объем среды RPMI 1640. После инкубации с Ara-C ККМ отмывали и переносили сингенным летально облученным реципиентам в количестве 0,5 • 105 кл./мышь. На 8-е сутки подсчитывали число КОЕс-8.
Для определения колониеобразования в культуре использовали стандартный препарат метилцеллюлозы компании Stem Cell Technology (Canada) - М-3434, содержащий чистые рекомбинантные цитокины и эмбриональную сыворотку теленка (FBC, SCF, IL-3, IL-6, Epo). Взвесь ККМ (104 кл./мл) помещали в пробирки с метилцеллюлозой и энергично взбалтывали, после чего переносили в 24-луночные планшеты. Каждая лунка содержала по 250 мкл метилцеллюлозы. Планшеты помещали в СО2-инкубатор (+37°С, 5% СО2). Подсчет колоний проводили под инвертированным микроскопом согласно рекомендациям Stem Cell Technology (Canada). Определяли и подсчитывали коммитированные гранулоци-тарно-макрофагальные колониеобразующие (КОЕ-ГМ) и эритроидные бурстобразующие клетки (БОЕ-Э).
СКК, находящиеся в костном мозге, относятся к самоподдерживающейся, редко делящейся популяции клеток. Их выявление стало возможным при применении метода образования клеточных колоний - потомков одной стволовой клетки [10] - полипотентных или бипотентных (коммитированных) клеток-предшественниц, дифференцировочный потенциал которых ниже, чем у стволовых. Эти клетки образуют колонии.
Анализ результатов определения возможного ингибиторного эффекта изучаемых гликополимеров морской бактерии Pseudoalteromonas nigrifaciens на пролиферацию стволовых кроветворных клеток позволяет констатировать, что исследуемые бактериальные компоненты не оказывали прямого ингибирующего влияния на пролиферацию СКК мышей, поскольку инкубация ККМ мышей (CBA х C57Bl/6)F1-гибридов с любым из исследованных ЛПС или ПС в дозе 100 мкг/мл не приводила к снижению либо увеличению количества КОЕс, предварительно стимулированных тестостероном-пропионатом.
Таблица 1
Влияние гликополимеров из морских протеобактерий P. nigrifaciens на стимуляцию пролиферации
ККМ мышей (CBA х C57Bl/6)F1-гибридoв
Группа КОЕс в S-фазе, %
in vitro in vivo
Контроль (ККМ) 0,6 і 0,2 0,9 і 0,5
КПС 4,5 і 2,1 0,7 і 0,2
О-ПС 31 і 2,7* 31,5 і 3,4*
ЛПС1 1 і 0,1 6 і 2,2
ЛПС2 26,6 і 2,4* 33,0 і 1,5*
* Статистически значимое различие между показателями опытных и контрольной групп с р < 0,05.
Инкубация биогликанов в тех же дозах и условиях, но с интактными ККМ мышей (табл. 1) ЛПС2 и ОПС вызывала значительную стимуляцию пролиферативной активности. Пролиферацию СКК костного мозга регистрировали по увеличению КОЕс в S-фазе у летально облученных мышей, которым были перенесены ККМ после воздействия гликополимеров. Количество КОЕс в S-фазе под действием О-ПС достигало 31 ± 2,1%, ЛПС2 - 26,6 ± 1,9% (контроль -0,6 ± 0,1%). В экспериментах in vivo
при введении этих полимеров дважды в дозах 5 мг/кг за 1 сут и за 2 ч до вскрытия мышей стимулирующий эффект сохранялся. Введение О-ПС приводило к увеличению числа пролиферирующих клеток до 31,5 і 1,7% , ЛПС2 - до 33% ( контроль - 0,9 і 0,1%). КПС и ЛПС1 не вызывали статистически значимого усиления пролиферации КОЕс как при прямом воздействии на ККМ, так и при введении этих гликополимеров мышам.
Коммитированность сопровождается появлением на поверхности клеток рецепторов к различным факторам роста - колониестимулирующим факторам, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку этих клеток. Оценка результатов клоногенного культивирования в метилцеллюлозе, содержащей чистые рекомбинантные цитокины (колониестимулирующий фактор (КСФ), интерлейкин-3 (ИЛ-3), ИЛ-6, эритропоэтин и эмбриональную сыворотку теленка), проводили с учетом количества коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих клеток (КОЕ-ГМ) и унипотентных эритроидных бурстобразующих клеток (БОЕ-Э).
ЛПС2 in vivo и in vitro (табл. 2) стимулировал гранулоцитарно-макрофагальный росток гемопоэза. КПС, выделенный из IAM 13010T, не оказывая прямого воздействия на формирование КОЕ-ГМ и БОЕ-Э, при введении мышам стимулировал оба кроветворных ростка - гранулоцитарно-макрофагальный и эритроидный. Многократное введение ЛПС2 (2 раза в неделю в течение 3 нед) не изменяло количество гранулоцитарно-макрофагальных и эритроцитарных предшественников по сравнению с контролем.
Данные экспериментов свидетельствуют о том, что гемолоэзстимулирующее действие проявили три из четырех исследованных гликополимеров. Липополисахариды, выделенные
Таблица 2
Влияние гликополимеров из морских протеобактерий P. nigrifaciens на формирование КОЕ-ГМ и БОЕ-Э в ККМ мышей (CBA х C57Bl/6)F1-гибридoв
Группа КОЕ-ГМ БОЕ-Э
Контроль Опыт Контроль Опыт
In vitro
КПС 3,5 і 2,2 5,3 і 3,4 2,3 і 0,6 6,3 і 2,2
О-ПС 3,5 і 2,2 3,7 і 3,3 2,3 і 0,6 4,7 і 0,8
ЛПС1 3,5 і 2,2 5,7 і 0,3 2,3 і 0,6 4,3 і 1,8
ЛПС2 8,3 і 0,9 15,8 і 2,0* 6,5 і 1,9 4,3 і 1,1
In vivo
КПС 20,7 і 0,9 28,3 і 5,4* 17,3 і 0,7 32,8 і 0,9*
ЛПС1 20,7 і 0,9 24,7 і 5,8 17,3 і 0,7 18,0 і 6,6
ЛПС2 15,3 і 0,7 25,3 і 2,4* 8,7 і 2,2 12,5 і 1,8
* p < 0,05.
из бактерий разных моллюсков, отличались по структуре и действию на процессы гемопо-эза. Так, ЛПС2, полученный от моллюска Crenomytilus grayanus, усиливал пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников и их дифференцировку в сторону гранулоци-тарно-макрофагального ростка кроветворения гемопоэза, а ЛПС1 из бактерий, выделенных от моллюска Patinopecten yessoensis, не влиял на эти процессы.
О-ПС на моделях in vitro и in vivo стимулировал пролиферацию ранних гемопоэти-ческих предшественников, не влияя на дифференцировку миелоидного и эритроидного ростков. Поскольку стимулирующий эффект О-ПС и ЛПС2, проявляющийся уже после 4-часовой инкубации с ККМ (in vitro), сравним с уровнем пролиферации ККМ, наблюдаемой после введения этих гликополимеров мышам (in vivo), действие О-ПС и ЛПС2 может быть обусловлено прямым рецепторным связыванием с клетками-мишенями. Так, для глюкана показана прямая независимая от действия цитокинов (ИЛ-3 и КСФ) активация гемопоэза [20]. Поскольку многократное введение ЛПС2 не изменяло количества грану-лоцитарно-макрофагальных и эритроцитарных предшественников по сравнению с контролем, возможно, в регуляцию гемопоэза включался механизм ингибирования развития клеток-предшественниц продуктами, образуемыми клетками разных линий на последних этапах их созревания по принципу обратной связи [18].
Иное влияние на гемопоэз оказывал КПС: не увеличивая пролиферации ранних предшественников, костимулировал вместе с ростовыми факторами (КСФ, ИЛ-3, ИЛ-6, эритропоэтин) формирование гранулоцитарно-макрофагального и эритроидного ростков, причем эффект наблюдался только при введении КПС мышам и не сохранялся на модели in vitro. Можно предположить, что КПС стимулирует функциональную активность клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения, приводящую к усилению продукции эндогенных гемопоэтических факторов роста.
Исходя из известных состава и строения использованных в работе бактериальных гликополимеров можно предположить, что выраженный эффект препаратов ЛПС2 и О-ПС на стимуляцию пролиферативной активности ККМ обусловлен наличием в их составе остатков уроновых кислот: L-гулозаминоуроновой - в случае ЛПС2 и галактуроновой - в случае О-ПС; КПС и ЛПС1 не вызывали усиления пролиферации в связи с отсутствием таких кислых моносахаридов в их составе.
Стимулирующее действие препаратов ЛПС2 и КПС на кроветворные ростки гемопоэза может обусловливаться высокой молекулярной массой этих биогликанов (500-1000 кДа) и/или наличием в их составе кислых сахаров - L-гулозаминоуроновой и 3-дезокси-2-ок-тулозоновой кислот соответственно. Известно, что высокомолекулярные амфифильные углеводсодержащие биополимеры, такие как ЛПС и капсульные полисахариды, содержащие в своем составе остатки N-ациаламино- и кислых сахаров, стимулируют клеточный иммунитет [16].
Результаты данной работы подтверждают описанные ранее факты фенотипической вариабельности гликополимеров. Компоненты клеточной стенки морских протеобакте-рий, выделенные из различных макроорганизмов, различаются и по структуре, и по действию на процессы кроветворения у мышей. Гликополимеры P. nigrifaciens, не оказывая влияния на пролиферацию предварительно стимулированных тестостероном-пропионатом ККМ, увеличивали интенсивность пролиферации и/или дифференцировки ранних предшественников кроветворных клеток на модели интактных ККМ либо не влияли на эти процессы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура О-специфического полисахарида Pseudoаlteromonas nigrifaciens KMM 161 // Биохимия. 2002. Т. 67, № 6. С. 810-814.
2. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas haloplanktis KMM 156 // Биоорган. химия. 1993. T. 19, № 3. P. 327-336.
3. Горшкова Н.М. Таксономические критерии в систематике морских аэробных протеобактерий: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Владивосток, 2000. 26 с.
4. Иванова Е.П. Морские протеобактерии группы Alteromonas: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Владивосток, 1999. 52 с.
5. Иванова Е.П., Романенко Л.Ф., Михайлов В.В. Морские протеобактерии семейства Alteromonadaceae. Владивосток: Дальнаука, 2001. 125 с.
6. Назаренко Е.Л., Горшкова РП., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas sp. KMM 4MC 17 // Биоорган. химия. 1993. Т 19, № 7. С. 733-739.
7. Смолина Т.П., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Беседнова Н.Н. Блокирование адгезии Yersinia pseudotuberculosis с помощью полисахаридов, выделенных из морских микроорганизмов Pseudoalteromonas // Тихоокеан. мед. журн. 2001. № 2. С. 18-20.
8. Смолина Т.П., Горшкова РП., Назаренко Е.Л., Беседнова Н.Н. Ингибирование адгезии прокариотических и эукариотических клеток липополисахаридом и его фрагментами из морских протеобактерий Pseudoalteromo-nas nigrifaciens КММ 156 // Антибиотики и химиотерапия. 2005. № 5/6. С. 4-6.
9. Смолина Т.П., Черных С.В., Горшкова РП., Назаренко Е.Л. Снижение адгезии микроорганизмов на клетках уроэпителия с помощью полисахарида, выделенного из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens // Журн. микробиол. 2006. № 3 (прил.). С. 58-61.
10. Чертков И.Л., Гуревич О.А. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. М.: Медицина, 1984. 200 с.
11. Byron J.W. Effect of steroids on haemopoietic stem cells // Nature. 1970. Vol. 228. P. 1204-1206.
12. Fenical W. Chemical studies of marine bacteria: developing a new resource // Chem. Rev. 1993. Vol. 93. P. 1673-1683.
13. Gordon M.Y. Human haemopoietic stem cell assays // Blood Reviews. 1993. Vol. 7. P. 190-197.
14. Gorshkova R.P, Nazarenko E.L., Zubkov V. A. et al. Structure of the capsular polysaccharide from Alteromonas nigrifaciens IAM 13010T containing 2-acetamido-2,6-dideoxy-L-talose and 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid // Car-bohydr. Res. 1997. Vol. 299. P. 69-76.
15. Isnansetyo K. From chemical structure to environmental biosynthetic pathways: navigating marine invertebrate-bacteria associations // Trends Biotechnol. 2005. Vol. 23(9). P. 437-440.
16. Kalka-Moll W.M., Tzianabos A.O., Ying Wang et al. Effect of molecular size on the ability of zwitterionic polysaccharides to stimulate cellular immunity // J. Immunol. 2000. Vol. 164. P. 719-724.
17. Kunig G.M., Kehraus S., Seibert S.F. et al. Natural products from marine organisms and their associated microbes // Chembiochem. 2006. Vol. 7(2). P. 229-238.
18. Lotem J., Sachs L. Cytokine control of developmental programs in normal hematopoiesis and leukemia // Oncogene. 2002. Vol. 21. P. 3284-3294.
19. Staber F.G., Gisler R.H., Schumann G. et al. Modulation of myelopoiesis by different bacterial cell-wall components: injunction of colony-stimulating activity (by pure preparations, low-molecular-weight degradation products, and a synthetic low-molecular analog of bacterial cell-wall components) in vitro // Cell. Immunol. 1978. Vol. 37, N 1. P. 174-187.
20. Turnbull J.L., Patchen M.L., Scadden D.T. The Polysaccharide, PGG-Glucan, Enhances Human Myelopoiesis by Direct Action Independent of and Additive to Early-Acting Cytokines // Acta Haematol. 1999. Vol. 102, N 2. P. 66-71.
Новые книги
Фундаментальные исследования в интересах биомедицины на Дальнем Востоке
России / отв. ред. П.А.Лукъянов.
Владивосток: Дальнаука, 2008. - 160 с. - ISBN 978-5-8044-0937-2.
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН 690022, Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, I59 Fax: (4232) 3I-40-50. E-mail: [email protected]
В сборник включены сообщения, прозвучавшие на научной сессии Общего собрания ДВО РАН «Фундаментальные науки - медицине» (30 ноября 2006 г.), носвященной медикобиологическим исследованиям на Дальнем Востоке.
Книга представляет интерес для специалистов РАН, РАМН и ФАЗР, занимающихся фундаментальными и прикладными исследованиями в области биомедицины, а также для ас-нирантов и студентов.
