CC BY
41
Активация клеток врождённого иммунитета человека липополисахаридом и экстрацеллюлярным полисахаридом морских бактерий
Т. П. СМОЛИНА*, Т. С. ЗАПОРОЖЕЦ, Н. Н. БЕСЕДНОВА
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток
Activation of Innate Immunity Human Cells by Lipopolisaccharide and Extracellular Polysaccharide Produced By Marine Bacteria
T. P. SMOLINA, T. S. ZAPOROZHETS, N. N. BESEDNOVA
Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok
С помощью цитометрического метода показано, что липополисахарид (ЛПС) и экстрацеллюлярный полисахарид (ЭПС), выделенные из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, увеличивают относительное количество моноцитов, синтезирующих IL-12. ЛПС и ЭПС повышают цитотоксический потенциал NK-клеток, усиливая их дегрануляцию (экспрессию мембранного С0107а), внутриклеточный синтез IFN-y и увеличивая экспрессию молекул CD25, CD69, HLA-DR, CD11b и CD54.
Ключевые слова: морские бактерии, Pseudoalteromonas nigrifaciens, врождённый иммунитет, липополисахарид, экстрацеллюлярный полисахарид, NK-клетки, СВ107а, внутриклеточные цитокины.
It has been shown that using the cytometric method lipopolysaccharide (LPS) and extracellular polysaccharide (EPS) isolated from marine bacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens increase the relative amount of monocytes synthesizing IL-12. LPS and EPS enhance the cytotoxic potential of NK cells, enhancing their degranulation (expression of membrane CD107a), intracellular synthesis of IFN-y and increasing the expression of CD25, CD69, HLA-DR, CD11b, and CD54 molecules.
Keywords: marine bacteria, Pseudoalteromonas nigrifaciens, innate immunity, lipopolysaccharide, extracellular polysaccharide, NK cells, CD107a, intracellular cytokines.
Способность МК-клеток (натуральных киллеров) быстро осуществлять эффекторные функции, направленные на элиминацию заражённых и повреждённых клеток организма, позволяет отнести их к клеткам системы врождённого иммунитета. Стимуляция МК-клеток различными растворимыми веществами и/или контактными взаимодействиями приводит к изменению их фенотипа, функциональных свойств и возможности более эффективно осуществлять контактный цитолиз [1].
Для поиска препаратов, активирующих клетки врождённого иммунитета, перспективно применение гликополимеров микробного происхождения, несущих патоген-ассоциированные молекулярные структуры, распознающиеся системой врождённого иммунитета. Известно, что липопо-лисахариды (ЛПС) клеточных стенок грамотрица-тельных бактерий могут активировать МК-клетки [2], однако входящий в их состав токсический
© Коллектив авторов, 2017
*Адрес для корреспонденции: E-mail tsmol@mail.ru
компонент (липид А) является препятствием для создания фармакологических препаратов.
В последнее время наблюдается повышенный научный интерес к морской микробиологии. Многие соединения, изолированные из морских гетеротрофных бактерий, являются уникальными по своей структуре и/или физиологическому действию [3]. Как оказалось, гликополимеры морских бактерий РзгийоаИгготопаз т^/аавт содержат необычные структурные варианты ли-пида А с низким эндотоксическим потенциалом. Эти бактерии могут культивироваться в искусственных условиях и перспективны для биотехнологии [4, 5]. Ранее нами было показано, что ЛПС и экстрацеллюлярный полисахарид (ЭПС), выделенные из морских бактерий Р.т%г1/аавт, активируют нейтрофилы и моноциты, а также усиливают миграционный потенциал этих клеток [6].
В связи с этим теоретический и практический интерес представляют возможности ЛПС и ЭПС Р.т%г1/аавт оказывать влияние на эффекторные функции МК-клеток человека и способность моноцитов синтезировать ТЬ-12, который, действуя
на NK-клетки, активирует их и способствует выработке IFN-y.
Цель работы — изучение влияния ЛПС и ЭПС P.nigrifaciens на внутриклеточную продукцию IL-12 моноцитами и на изменение функциональной активности и фенотипа NK-клеток. Для этого исследовали изменение экспрессии активационных маркеров (CD25 и CD69), молекул адгезии (CD11b и CD54) и главного комплекса гистосовместимос-ти II класса (HLA-DR), маркера дегрануляции CD107а на мембранах NK-клеток, а также — внутриклеточную продукцию у-ИФ NK-клетками.
Материал и методы
ЛПС и ЭПС получены из штамма КММ 156 бактерий P.nigrifaciens, выделенных из ткани желудка дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus. ЭПС состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы, один остаток 2-ацетамидо-2-дезокси^-глюкозы и один остаток 3-0-[^)-1-карбоксиэ-тил]^-глюкозы (глюколактиловой кислоты) [7]. Гликопо-лимеры выделены и любезно предоставлены для исследования сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Елякова.
Материалом для исследования служила полученная от здоровых доноров периферическая кровь с гепарином (25 ЕД/мл), которую разводили в соотношении 1:2 полной питательной средой (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глута-мина, 100 мг/мл гентамицина). Использование цельной крови не требует выделения и подготовки клеток к культивированию, устраняет неспецифическую активацию клеток на этапах сепарации, и при этом сохраняется существующий in vivo баланс различных типов клеток крови.
Исследуемые гликополимеры растворяли в 0,9% растворе NaCl и вносили образцы в кровь в конечных концентрациях 10 и 100 мкг/мл. В контрольные пробы вносили 0,9% раствор NaCl в объёме, равном таковому раствора гликополимеров.
Уровень экспрессии поверхностных молекул определяли методом цитометрического анализа в программе «CellQuest Pro» на проточном цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson») c использованием моноклональных антител к молекулам CD3-FITC, CD14-PE, CD69-PE, CD11b-PE, CD25-PE, CD54-PE, HLA-DR-PE, CD56-APC, CD107а-PE («Beckman Coulter») и соответствующих изотипических контролей. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Экспрессию молекул CD107а определяли после 4 ч инкубирования, всех остальных молекул — через 24 ч.
Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов цельную кровь инкубировали с 10 мкг/мл. ЛПС или ЭПС в присутствии 2 мкмоль/л моненсина (Sigma) при температуре 37°С (4 ч — для определения внутриклеточного ИЛ-12 в моноцитах; 20 ч — для выявления ИФН-у в NK-клетках) в полистироловых 12x75 мм пробирках c пробками (Falcon). Нести-мулированный контроль инкубировали в тех же условиях в присутствии моненсина без добавления активаторов. После инкубации клетки окрашивали антиген-специфическими мо-ноклональными антителами для поверхностных маркеров (CD3-FITC, CD56-APC), лизировали эритроциты (BD FACS Lysing Solution), клетки пермеабилизовали (BD FACS Permeabilizing Solution) и отмывали. Для выявления внутриклеточных цитокинов добавляли конъюгированные с PE МКА к IL-12, или IFN-y. После отмывки клетки ресуспенди-ровали в 500 мкл 1% раствора параформальдегида и анализировали образцы на проточном цитометре [8]. При гейтирова-нии популяцию моноцитов выделяли по CD14 в комбинации с боковым светорассеянием (SSC). NK-клетки идентифицировали как CD3-CD56+ клетки. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Результаты представлены как процент NK-клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры. Плотность (количество) молекул на поверхности клеток отра-
Влияние гликополимеров P.niдrifаciens на изменение внутриклеточного синтеза ^-12 моноцитами крови человека
! § О ? = | -11,4) ,2 оч 7 ,4) 7 ,4) сл 1 сл
о & .5 1 с, сч ,5
ос 5, 2 (1, чсТ (2,
И ,2 чо сл
S о оч 1, ОО 4,
iR
се ,
Ё а
& ©
s s
& о а ч
Q. с. о ср t— х
о ^
Q
3 о х
I—
о о
1Л
о о"
V/ а
и 01
I
01 о
01
<и =1
0) i £
жена в виде условных единиц средних интенсивностей флюоресценции (MFI).
Статистическую обработку результатов проводили методами непараметрической статистики, включающими расчёт медианы и квартального размаха (разность значений 75-го и 25-го процентиля), а также оценку различий с использованием критерия Вилкоксона для связанных групп.
Результаты и обсуждение
Моноциты человека в ответ на бактериальные продукты могут продуцировать различные цитокины, в том числе IL-12 — плейотропный цитокин, оказывающий влияние на различные биологические эффекты T-клеток и натуральных киллеров [9]. Инкубирование цельной крови в течение 4 ч как с ЛПС, так и с ЭПС в концентрации 10 мкг/мл приводило к значимому увеличению относительного количества моноцитов, синтезирующих IL-12 внутри клеток (рисунок). Более выраженный эффект оказывал ЭПС, увеличивая процент синтезирующих IL-12 моноцитов до 25,5±3,8% (контроль — 2,5±1,1%), в то время как ЛПС повышал этот показатель до 9,4+2,3%.
IL-12 является сильным индуктором синтеза IFN-y T-лимфоцитами и NK-клетками периферической крови и способствует активизации ци-толитической активности NK-клеток [10] .Через 20 ч инкубации клеток крови с 10 мкг/мл ЭПС относительное количество NK-клеток, синтезирующих IFN-y, возрастало до 21,2+3,4% при контрольном показателе 3,9+2,1%. ЛПС оказывал меньший эффект, увеличивая процент IFN-y-по-зитивных NK-клеток до 8,3+1,7%. Различия статистически значимы (р<0,05) по отношению к контролю.
При активации NK-клеток на их мембране регистрируется экспрессия маркера CD107a, который характеризуется как трансмембранный белок LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein1) и является маркером дегрануляции клеток [11]. Инкубация клеток крови с 10 мкг/мл ЭПС в течение 4 ч приводила к увеличению относительного количества NK-клеток, экспрессирующих на поверхности CD 107a, до 9,1+1,7% (контроль — 0,8+0,9%). ЛПС увеличивал относительное количество субпопуляции CD107a-позитивных NK-клеток до 7,1+0,9%.
Стимуляция различными веществами может приводить NK-клетки не только к быстрому эф-фекторному ответу в виде контактного цитолиза с помощью цитотоксических гранул, но и к изменению их фенотипа и функциональных свойств.
В экспериментах показано (таблица), что инкубация клеток крови с ЛПС или ЭПС в течение 24 ч приводила к изменению субпопуляционного состава NK-клеток: увеличивалось относительное число клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD69) и поздней (CD25, HLA-DR) активации, а
также молекул адгезии (СБ54) на мембране клеток; возрастала плотность интегринов (СБ11Ъ). ЭПС оказывал более выраженное действие на изменение фенотипа МК-клеток, чем ЛПС. Роль всех этих маркеров на МК-клетках связана с осуществлением цитотоксической функции [12—17].
Трансмембранный гликопротеин СБ69 является одним из самых ранних поверхностных маркеров активированных МК-клеток, который необходим для проведения сигнала внутрь клетки и повышения функциональной активности МК-кле-ток. Лимфоциты, в том числе МК-клетки, в ин-тактном состоянии не экспрессируют СБ69, эти молекулы появляются на их поверхности после активации клеток различными стимулами. Известно, что экспрессия СБ69 на МК-клетках связана с их цитотоксической функцией. Установлена роль СБ69 в лизисе, осуществляемом активированными МК-клетками. Кроме того СБ69 принимает участие в регулировании других функций МК-кле-ток, таких как пролиферация, продукция ФНО-а и экспрессия других функционально значимых антигенов (СБ25, 1САМ-1). [12]. СБ69 имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез интерлейкина-2, и сигналы, поступающие с СБ69, вызывают увеличение как продукции этого цитокина, так и количества рецепторов к нему на клетках СБ25+ [13], экспрессию которых принято считать одной из ключевых стадий процесса активации.
ЭПС вызывал более значительное повышение экспрессии СБ25 на МК-клетках, чем ЛПС и, соответственно, в большей степени увеличивал возможность проявления цитотоксических свойств МК-клеток, т.к. известно, что экспрессия СБ25 позитивно коррелирует с цитотоксической функцией МК-клеток, увеличивая их дегрануляцию и процент гибели клеток-мишеней, а также продукцию ИФН-у [14].
Система ИЬА обеспечивает регуляцию иммунного ответа. МК-клетки, экспрессирующие ИЬА-БЯ, характеризуются сильной литической активностью и играют значительную роль в процессах инициации и усиления воспалительных реакций.
СБ11Ъ является важным интегрином, который связан с созреванием и цитотоксичностью МК-клеток [15].
Молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 (СБ54) экспрессируются на клетках крови при активации и участвуют в обеспечении адгезии и миг-
рации клеток в очаг воспаления [16]. Молекулы СБ54, экспрессирующиеся на МК-клетках, участвуют в регулировании процесса цитолиза [17].
Таким образом, увеличение экспрессии молекул СБ69, СБ25, ИЬА-БЯ, СБ11Ъ и СБ54 на МК-клетках связано с возрастанием их цитоток-сического потенциала.
Известно, что активация одного типа клеток может приводить к активации другого, причём активирующее действие МК-клеток на моноцитар-но-макрофагальные клетки связано, главным образом, с секрецией 1КК-у, а моноцитарно-макро-фагальные клетки стимулируют натуральные киллеры с помощью цитокинов 1Ь-12, 1Ь-15 и 1Ь-18 и контактных взаимодействий.
Анализ результатов экспериментов позволяет предположить, что ЛПС и ЭПС, выделенные из P.nigrifaciens, оказывают прямое действие на моноциты крови через паттерн-распознающие рецепторы, увеличивая относительное количество моноцитов, синтезирующих 1Ь-12 уже через 4 ч инкубации. Наблюдаемая активация МК-клеток и увеличение их цитотоксичности могут быть связаны как с прямым воздействием исследуемых гликополимеров, так и с влиянием 1Ь-12, который может приводить к запуску продукции ШК-у и индуцировать экспрессию акти-вационных маркеров.
В связи с тем, что МК-клеткам принадлежит важнейшая роль в иммунологическом надзоре, а ЛПС и ЭПС морских бактерий Р5еийоа11еготопа5 nigrifaciens являются индукторами МК-клеточной активности, представляется перспективным дальнейшее исследование этих гликополимеров и создание на их основе фармакологических противовирусных и противоопухолевых препаратов.
Выводы
1. ЛПС и ЭПС, выделенные из морских бактерий P.nigrifaciens, оказывают влияние на регу-ляторную способность моноцитов, увеличивая их способность синтезировать 1Ь-12.
2. Под действием ЛПС и ЭПС возрастает количество МК-клеток, синтезирующих ИФН-у.
3. ЛПС и ЭПС усиливают цитотоксический потенциал МК-клеток увеличивая экспрессию молекул СБ107а, СБ69, СБ25, ИЬА-БЯ, СБ11Ъ и СБ54.
4. ЭПС оказывает более эффективное, чем ЛПС, действие на изменение функциональной активности моноцитов и МК-клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Farag S.S., Caligiuri M.A. Human natural killer cell development and biology. Blood Rev 2006; 20: 123—137.
2. Goodier M. R, Londei M. Lipopolysaccharide stimulates the proliferation of human CD56 + CD3 — NK cells: a regulatory role of monocytes and IL-10. J.Immunol 2000; 165: 139—147.
3. Alba S, Nazarenko E.L., Lanzetta R, Parrilli M, Molinaro A. Molecular Structure of Endotoxins from Gram-negative Marine Bacteria: An Update Serena Leone. Mar Drugs 2007; 5 (3): 85—112.
4. Bowman J.P. Bioactive compound synthetic capacity and ecological significance of marine bacterial genus Pseudoalteromonas. Mar Drugs 2007; 5: 220—241.doi:10.3390/md504220 ■ Source: PubMed
5. Красикова И.Н., Капустина Н.В., Исаков В В. Установление структуры липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas HabplankUs АТСС 14393т. Биоорган хим 2004; 30 (4): 409—416. / Krasikova I.N., Kapustina N.V., Isakov V.V. Ustanovlenie struktury lipida A iz morskoj gramotricatel'noj bakterii Pseudoalteromonas Haloplanktis ATSS 14393t. Bioorgan him 2004; 30 (4): 409—416. [in Russian]
6. Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врождённого иммунитета человека гликополимерами морских бактерий. Антибиотики и химиотер 2015; 60, 3—4: 37—41./ Smolina T.P., ZaporozHec T.S., Besednova N.N. Izmenenie urovnja jekspressii molekul adgezii kletok vrozhdjonnogo immuniteta cheloveka glikopolimerami morskih bakterij. Antibiotiki i himioter 2015; 60, 3-4: 37—41. [in Russian]
7. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков A.A. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида AlteromonasHaloplanktis KMM156. Биоорган хим 1993; 19 (3): 327—336./ GorsHkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov A.A. i dr. Struktura povtorjajushhegosja zvena kislogo polisaharida AlteromonasHaloplanktis KMM156. Bioorgan him 1993; 19 (3): 327-336. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Смолина Татьяна Павловна — к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток Запорожец Татьяна Станиславовна — д.м.н., с.н.с. (звание), зам. директора по науке НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток
8. Foster B, Prussin C, Liu F., Whitmire J.K., Whitton J.L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol 2007; Aug; Chapter 6: Unit 6.24. doi: 10.1002/0471142735. im0624s78.
9. Chehimi J., Trinchieri G. Interleukin-12: a bridge between innate resistance and adaptive immunity with a role in infection and acquired immunodeficiency. J Clin Immunol 1994; 14: 149—161.
10. Wolf S.F., Sieburth D., Sypek J. Interleukin-12: a key modulator of immune function. Stem Cells Dayt 1994; 12 (2): 154—68.
11. Betts M.R., Koup R.A. Detection of T-cell degranulation: CD107a and b. Methods Cell Biol 2004; 75: 497—512. doi: 10.1016/S0091-679X(04)75020-7
12. Borrego F., Robertson M.J., Ritz J., Pena J., Solana R. CD69 is stimulatory receptor for natural killer cell and its cytotoxic effect. Immunol 1999; 97: 159—165.
13. Marzio R., Mauël J., Betz-Corradin S. CD69 and regulation ofthe immune function . Immunopharmacol Immunotoxicol 1999; 21; 3: 565—582.
14. Rudnicka K., MatusiakA. Chmiela M. CD25 (IL-2R) expression correlates with the target cell induced cytotoxic activity and cytokine secretion in human natural killer cells. Acta Biochim Pol 2015; 62 (4): 885—894. doi: 10.18388/abp.2015_1152.
15. Fu B., Tian Z., Wei H.Subsets of human natural killer cells and their regulatory effects. Immunology 2014; 141: 4: 483—489.
16. Zimmerman T., Blanco F.J. Inhibitors targeting the LFA-1/ICAM-1 cell adhesion interaction: design and mechanism of action. Current Pharmaceutical Design 2008; 14; 22: 2128—2139.
17. Robertson M.J., Caligiuri M.A., Manley T.J., Levine H., Ritz J. Human natural killer cell adhesion molecules. Differential expression after activation and participation in cytolysis. Immunol 1990; 15; 145 (10): 194—201.
Беседнова Наталия Николаевна — д.м.н., академик РАН, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток
