CC BY
58
УДК [616.91-002.151-06:616.61]-085.281:582.273
противовирусное действие каррагинанов из красной водоросли при экспериментальной хантавирусной инфекции
И.Г. Максема1, Г.Г. Компанец1, А.О. Барабанова2, И.М. Ермак2, Р.А. Слонова1
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
Ключевые слова: каррагинаны, хантавирусная инфекция.
Изучена противовирусная активность каррагинанов двух структурных типов - каппа и лямбда, полученных из водорослей Chondrus armatus, в опытах in vitro при экспериментальной хантавирусной инфекции. Обнаружено выраженное вирусинги-бирующее действие при использовании высоких концентраций каррагинанов: 1000-2000 мкг/мл. Установлено, что при использовании более низких концентраций (500 мкг/мл) наблюдалась заметная разница в проявлении противовирусного действия. Отмечено, что даже в достаточно высоких концентрациях каррагинаны обладают низкой эффективностью подавления вирусной репродукции при предварительной обработке препаратами клеток Vero E6.
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острая вирусная природно-очаговая зооноз-ная инфекция человека, представляющая серьезную проблему в связи с широким распространением, тяжестью болезни, отсутствием эффективных средств этиотропной терапии и специфической профилактики. В Дальневосточном регионе ГЛПС регистрируется ежегодно и характеризуется чередованием подъемов и спадов заболеваемости с преобладанием тяжелых и среднетяжелых форм болезней и высокой летальностью. При среднемноголетнем показателе заболеваемости 3,1 % в отдельные годы летальность достигала 15 % [4].
До настоящего времени для предупреждения заболеваний ГЛПС в нашей стране специфическая профилактика не осуществляется. Рекомендуемый комплекс мер неспецифической профилактики не всегда является эффективным, поскольку широкий охват территорий, где регистрируется заболевание, для проведения истребления грызунов и дезинфекционных мероприятий является трудновыполнимой задачей.
С учетом важности проблемы как для Приморского края, так и в целом для России поиск препаратов, обладающих противовирусным действием, при отсутствии вакцинопрофилактики остается актуальной задачей. Перечень средств, которые используются при ханта-вирусной инфекции в профилактических и лечебных целях, пока невелик. В экспериментальных и клинических наблюдениях показана эффективность препарата виразола (рибавирина) для снижения тяжести и продолжительности заболевания [5, 7]. Действие виразола связано с нарушением репродукции вируса в чувствительных клетках за счет мутаций в геноме. Однако положительные результаты отмечаются при использовании виразола в ранние сроки заболевания, что при ГЛПС не всегда возможно из-за несвоевременной постановки
Максема Ирина Геннадьевна - канд. мед. наук, ст.н.с. лаборатории ГЛПС НИИЭМ СО РАМН: e-mail: irinaluna@inbox.ru
диагноза. Выявленные иммунные нарушения, во многом определяющие тяжесть инфекции, обусловливают возможность применения иммунокорригирующей терапии в комплексном лечении больных ГЛПС [3].
В последние годы проводятся исследования по использованию индукторов интерферона различного происхождения. По данным С.Я. Логиновой и др. [5], в культурах клеток КЛ-17 и СПЭВ ларифан и рифастин в незначительной концентрации практически полностью подавляли репродукцию вируса Хантаан. Известный и широко используемый при респираторных инфекциях препарат арбидол препятствовал контакту и проникновению хантавирусов в клетку in vitro и in vivo [9].
Результаты комплексных фундаментальных и прикладных исследований демонстрируют целесообразность дальнейшего поиска новых соединений, обладающих противовирусными свойствами. В этом плане большой интерес представляют препараты из морских гидробионтов, в частности полисахариды, благодаря их биосовместимости, биоразлагаемости и широкому спектру биологической активности. Исследования, проведенные нами ранее с использованием фукои-данов - сульфатированных полисахаридов бурых водорослей, показали их влияние на адсорбцию вируса Хантаан при экспериментальной инфекции [6].
Согласно литературным данным, высокую ингиби-рующую активность в отношении некоторых вирусов животных и человека проявляют сульфатированные полисахариды красных водорослей - каррагинаны [10, 13]. Каррагинаны представляют собой семейство линейных сульфатированных галактанов, построенных из остатков галактозы и ее производных, характеризуются разнообразием структурных типов и широким спектром биологической активности - иммуномодулирующей, антикоагулирующей, антиоксидантной и антивирусной [15]. Физиологический эффект каррагинанов определятся как структурой полисахарида, так и его молекулярной массой. Так, различные типы каррагинанов оказывают in vitro ингибирующее влияние на репликацию ряда ДНК- и РНК-вирусов: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1-го типа, вируса желтой лихорадки, вирусов простого герпеса 1-го и 2-го типов, вирусов свиной и тропической лихорадки [10, 13, 15]. Обнаружено, что in vitro каррагинан с высокой степенью сульфатирования способен блокировать эпителиальную трансмиссию ВИЧ в дозах, в тысячу раз более низких, чем требуется для ингибирования клеточной адгезии [8]. Наиболее вероятно, что основной мишенью противовирусного
Оригинальные исследования
33
действия каррагинанов является адсорбция вирусов, а не вирусная интернализация и синтез внутриклеточных белков [10]. A. Reunov et al., впервые показали, что к/р-каррагинан из дальневосточной красной водоросли Tichocarpus crinitus ингибирует накопление вируса табачной мозаики в листьях табака [12].
О влиянии каррагинанов на развитие хантавирус-ной инфекции не сообщалось. Поскольку важнейшим свойством противовирусных препаратов является их способность подавлять репродукцию вируса в клетке, нашей целью был анализ вирусингибирующей активности каррагинанов in vitro на культуре чувствительных клеток Vero E6.
Материал и методы. В экспериментах использовали штамм 76-118 вируса Хантаан, адаптированный к культуре клеток Vero E6, в титре 4,8 lg фокусобразую-щих единиц/мл. В качестве ростовой среды для выращивания клеток и размножения вируса использовали питательную среду «Игла МЕМ» с двойным набором аминокислот и витаминов, с добавлением 7 % феталь-ной сыворотки, 0,06 % L-глютамина и антибиотиков. Реакцию индикации инфекционных фокусов проводили согласно P.W. Lee. et al [11]. Вируссодержащую жидкость предварительно обрабатывали каррагинанами в нижеперечисленных концентрациях. Контакт неразве-денной вируссодержащей жидкости с каррагинанами осуществляли в течение 1 часа при 37 °С. Затем смесь титровали с 10-кратными разведениями и наносили на монослой клеток Vero E6, выращенный на 24-луночных планшетах. Клетки культивировали под полужидким покрытием (0,6 % КМЦ) в инкубаторе с воздушной смесью, содержащей 5 % СО2 при 37 °С. Результат учитывали на 10-е сутки после заражения.
Каррагинаны двух структурных типов - каппа и лямбда - были получены из водорослей Chondrus arma-tus, собранных в Японском море (залив Петра Великого, м. Фальшивый). Полисахариды выделяли, фракционировали, идентифицировали методами инфракрасной и 13С-ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии, как описано ранее [14]. Общее содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом, используя D-галактозу в качестве стандарта, а количество сульфатных групп определяли турбидиметрическим методом, согласно приведенным ранее методикам.
Для вычисления молекулярной массы использовали вискозиметрический метод. Вязкость измеряли в модифицированном вискозиметре Убеллоде (СКБ «Пущино», Россия) с диаметром капилляра 0,3 мм в диапазоне концентраций 0,5-2,0 мг/мл в 0,01М растворе NaCl при 25 °С. Значения характеристической вязкости вычисляли путем экстраполяции графика зависимости (1пг|отн)/С от концентрации на нулевую концентрацию.
Молекулярные массы рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка-Куна: [г|] = КМа, где [г|] - характеристическая вязкость, а К и а - эмпирические константы, значения которых были взяты для данной системы полимер-растворитель: К = 3х103 и а = 0,95. В работе
Таблица1
Характеристика каррагинанов
Содержание, % à
Тип моносахариды 3,6-ангидро-галактоза сульфаты Мол. м са, кДа
Каррагинан-1 47 33,0 22,0 246
Каррагинан-2 29 0,56 28,0 140
использовали препараты - каррагинан-1 (к-тип) и кар-рагинан-2 (Х-тип), различающиеся степенью сульфа-тирования и молекулярной массой (табл. 1). Карраги-наны применяли в концентрациях 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 и 2000 мкг/мл. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Первичный скрининг препаратов проводили по двум направлениям: различными концентрациями каррагинанов обрабатывали вирус и неинфицирован-ные клетки Vero E6. Наблюдения за культурой клеток при использовании всех концентраций препаратов не выявили цитодеструктивного эффекта. Результаты вирусингибирующей активности каррагинанов при предварительной обработке вируса представлены в табл. 2. Показано, что препараты в дозах 10-50 мкг/мл не снижали инфекционность вируса. При использовании каррагинанов в концентрациях 100-250 мкг/мл титр вируса снижался в пределах 1,0 lg.
Более выраженное вирусингибирующее действие было обнаружено при использовании высоких концентраций испытуемых препаратов. Каррагинан-1 снижал титр вируса в концентрации 1000-2000 мкг/ мл на 1,9-3,8 lg. Выраженный антивирусный эффект каррагинана-2 также проявлялся при максимальной концентрации (2000 мкг/мл). Следует отметить, что при низких концентраций каррагинанов, используемых для обработки вируса (500 и 1000 мкг/мл), регистрировалась заметная разница противовирусного действия. Так, антивирусная активность каррагинана-2 при концентрации 500 мкг/мл была в 1,5 раза выше, чем карраги-нана-1 (табл. 2), что, вероятно, обусловлено структурными особенностями этих полисахаридов, в частности высокой степенью сульфатирования каррагинана-2 и незначительным содержанием 3,6-ангидрогалактозы (табл. 1). Согласно литературным данным, противовирусная активность сульфатированных полисахаридов повышается с увеличением степени сульфатирования, но важную роль при этом играют распределение сульфатных групп, конформационная гибкость и относительное количество 3,6-ангидрогалактозы [10, 13]. В то же время относительно высокая активность каррагина-на-1 при использовании больших концентраций может проявляться благодаря его более высокой молекулярной массе (табл. 1) и способности этого типа полимера образовывать гели при высоких концентрациях [15], что, возможно, приводит к обволакиванию вируса и инги-бированию его прикрепления к клеткам.
Таблица 2
Влияние различных концентраций каррагинанов на репродукцию вируса Хантаан в культуре клеток Vero
Препарат Доза, мкг/мл Подавление репродукции вируса (A), lg
Каррагинан-1 100 0,7±0,5
250 1,3±0,5
5001 1,1±0,3
1000 1,9±0,22
1500 2,8±0,32
2000 3,8±0,32
Каррагинан-2 100 1,3±0,3
250 1,3±0,3
5001 2,0±0,32
1000 2,5±0,52
1500 2,8±0,32
2000 3,8±0,32
Контроль вируса - 4,8±0,2
1 Различие между препаратами статистически значимо.
2 Различие с контролем статистически значимо.
Несколько иная картина отмечалась при предварительной обработке препаратами клеток Vero E6. Отмечено, что даже в достаточно высоких концентрациях (500-1000 мкг/мл) каррагинаны обладали низкой эффективностью в подавлении вирусной репродукции (1,0 lg). Использование более высоких концентраций (1500 и 2000 мкг/мл) снижало инфекционный титр на 1,5 lg.
Эффективность вирусингибирующего действия каррагинанов зависела от титра вируса. При невысоком титре (3,0 lg) отмечалось снижение инфекционности возбудителя, при предварительной обработке карраги-наном-1 в концентрации 100 и 200 мкг/мл, на 2,0 lg. Т.е. чем выше титр вируса, тем более высокие концентрации препаратов необходимы для его подавления.
Ранее было показано, что условная величина, позволяющая дифференцировать вирусингибирующие препараты, составляет 1,78 lg [2]. Другие авторы за истинную вирусингибирующую активность принимали разницу в титрах вируса в опытном и контрольных рядах не менее 2,0 lg [1]. Таким образом, снижение титра хантавируса под действием каррагинанов на 1,9-3,8 lg можно считать проявлением истинной вирусингибиру-ющей активности. Суммирование результатов изучения антивирусной активности полисахаридов в отношении вируса Хантаан показало целесообразность дальнейшего анализа эффективности каррагинанов в отношении возбудителя ГЛПС in vivo, а также оценки возможности использования их в практической медицине. References
1. Bichurina M.A., Nikitina L.E., Sovetova M.G. et.al. Virus inhibitory activity of the drug, made from mussel hydrolyzate, Vopr. virusol. 1994. No. 3. P. 134-136.
2. Votjakov V.I., Boreko E.I. Approach to assessing the activity of chemical compounds against viruses propagated in material culture, Metod. vopr. nauchnoj razrabotkiprotivovirusnyh vewestv: tez. dokl. Minsk, 1977. P. 10-14.
3. Ivanis V.A. Clinic, immunomodulating therapy of hemorrhagic fever with renal syndrome in the region of different serotypes
of hantavirus circulation: synopsis, tethys, Vladivostok, 2004.
52 p.
4. Ivanis V.A., Maksema I.G., Afanaseva V.I., Slonova R.A. Clinical and immunological features of hemorrhagic fever with renal syndrome in severe with lethal and favorable outcome in Primorye, Pacific Medical Journal. 2010. No. 3. P. 46-51.
5. Loginova S.Ja., Borisevich S.V., Kovalchuk A.V. et.al. Antiviral activity in vitro drug against the pathogen of hemorrhagic fever with renal syndrome, Voprosy virusologii. 2007. No. 6. P. 34-36.
6. Maksema I.G., Makarenkova I.D. Antiviral activity of fucoidan natural origin in experimental infection with hantavirus, Pacific Medical Journal. 2008. No. 2. P. 86-89.
7. Obrazcov Ju.G. Hemorrhagic fever with renal syndrome in the military of the Primorsky Krai (clinical and epidemiological characteristics and capabilities of causal therapy): synopsis, dissertation. SPb., 2005. 20 p.
8. Bourgougnon N. Anti-HIV Compound from Red Seaweeds, Recent Advances in Marine Biotechnology (Fingerman M, Na-gabhushanam R. eds). Sci. Publ. Inc. USA-UK. 2003. Vol. 9. P. 165-206.
9. Deng H.Y., Luo F., Shi L.Q. et. al. Efficacy of arbidol on lethal hantaan virus infections in suckling mice and in vitro, Pharma-cologica Sinica. 2009. No. 30. P. 1015-1024.
10. Ghosh T., Chattopadhyay K., Marschall M. et al. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: From structure-activity analysis to clinical evaluation, Glycobiology. 2009. Vol. 19. No. 1. P. 2-15.
11. Lee P.W., Gibbs C. Jr., Gajdusek D., Yanagihara R. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests, J. Clin. Microbiol. 1985. No. 22. P. 940-944.
12. Reunov A., Nagorskaya V., Lapshina L. et al. Effect of к/\-carrageenan from red a lga Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae) on infection of detached tobacco leaves with tobacco mosaic virus, J. Plant Diseases and Protection. 2004. Vol. 111. P. 165-172.
13. Talarico L.B., Zibetti R.G., Faria P.C. Anti-herpes simplex virus activity of sulfated galactans from the red seaweeds Gymnogon-grus griffithsiae and Crytonmia crenulata, Int. J. Biol. Macromol. 2005. Vol. 34. P. 63-71.
14. Yermak I.M, Kim Y.H., Titlyanov E.A. et. al. Chemical structure and gel properties of carrageenan from a lgae belonging to the Gigartinaceae and Tichocapaceae, collected from the Russian Pacific coast, J. Appl. Phycol. 1999. Vol. 11. P. 41-48.
15. Yermak I.M., Khotimchenko Yu.S. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red a lgae, Recent Advances in Marine Biotechnology (Fingerman M, Nagabhush-anam R. eds). Sci. Publ. Inc. USA-UK. 2003. Vol. 9. P. 207-255.
Поступила в редакцию 27.05.2011.
antiviral action of red algae-derived carrageenans in case of experimental hunt virus infection
I.G. Maksema1, G.G. Kompanets1, A.O. Barabanova2, I.M. Ermak2, R.A. Slonova1
1 Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Siberian Brach of Russian Academy of Medical Sciences (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russian Federation), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of the Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (159 100 Year Anniversary of Vladivostok Av. Vladivostok 690022 Russian Federation)
Summary - The authors have studied antiviral action of Kappa type carrageenan and Lambda type carrageenan derived from Chon-drus armatus algae in vitro during experimental Hunt virus infection and found out evident virus-inhibiting action, given the high concentrations of Carrageenan of up to 1000-2000 mkg/ml. Given the lower concentrations (500 mkg/ml), the antiviral effects varied very much. In case of high levels, the Carrageenans were of low efficiency to inhibit viral reproduction during preliminary treatment with Vero E6 cells.
Key words: Carrageenan, Hunt virus infection.
Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 32-34.
