CC BY
16
4 УДК 619:616.935:636.2:577.115.3
Калачнюк Л.Г.,1' 2 д.б.н., доцент;
Басараб 1.М., 2, асистент;
Мельничук Д.О. 1, д.б.н., професор, академк НАНУ i НААНУ;
Мельничук С.Д. 1, д.б.н., професор, член-кор. НААНУ Калачнюк Г.1. 1 2, д.б.н., професор 1Нацюнальний ушверситет бюресурсгв / природокористування Украгни
2Льв1вський нацюнальний ушверситет ветеринарног медицини та бютехнологш ¡мет С. З. Гжицького
СТРУКТУРНО-ФУНКЦЮНАЛЬШ ЗРУШЕННЯ В Л1П1ДАХ ГЕПАТОЦИТ1В I КРОВ1 НЕОНАТАЛЬНИХ ТЕЛЯТ ЗА Д1АРЕ1 ТА Л1КУВАЛЬНО1 ДП Л1ПОСОМ НА ОСНОВ1 ФОСФОЛ1П1Д1В МОЛОКА
Показано, що традицшне л1кування (ТЛ) протягом 10 - 15 дшв не дозволяе сповна нормал1зувати зрушений вм1ст загальних лтдгв (ЗЛ) та гх компонент1в - холестеролу (Х), холестеролу естерифжованого (ХЕ), триацилглщерол1в (ТАГ), есенщальних жирних кислот (ЕЖК), фосфатидилхолшу (ФХ), фосфатидилетаноламшу (ФЕ), кардюлтшу (КЛ), сфшгом1елшу (СМ), фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилшозитолу (Ф1) у клтинах печшки, а також - молярний вгдсоток домшуючих високомолекулярних карбонових кислот у фосфолШдах гепатоцит1в та у ЗЛ сироватки кровг, викликаний д1ею фактор1в дгарег ал1ментарного походження в новонароджених телят. Поеднання способ1в ТЛ гз застосування лтосомально'г форми бгологгчно активног добавки, одержаног на основг фосфолгпгдгв молока (БАД ЬР ЕЬР-ЫЭ), дае можливють вгроггдно наблизити до норми вм1ст вищевказаних лгпгдних компонентгв. Наведен змши пов'язуються гз структурою г функцгею лгпгдних сполук у мембранах клтин та мюцем розмщення насичених I есенщальних жирних кислот у молекулах.
Ключо^^ слова: фосфолтдн компоненти, жирн кислоти, мембрани, клтини печшки, телята, д1арея, лтувальы препарати, лтосоми молока.
У дослщженнях обмiну речовин в органiзмi новонароджених телят особливу увагу привертае метаболiзм лшвдв [1 - 7]. Важливють його пщсилюеться не тшьки складшстю переходу оргашзму вщ пре- до постнатального перюду, але й дуже частими проявами розладiв травно! системи [4]. Основш патолопчш змши наступають у епiтелiальних нашаруваннях слизово! оболонки шлунково-кишкового тракту (ШКТ) та в гепатоцитах [2, 4].
У попередшх наших дослщженнях [2] було встановлено, що вмют загальних лшвдв i !х окремих компонент (Х, ХЕ, ТАГ, ЕЖК, ФХ, ФЕ, КЛ, СМ, ФС, Ф1) у гепатоцитах диспепсшних новонароджених телят на 20-30% е нижчим, шж у таких же клтинах здорових тварин цього ж вшу. Це вказуе на рiзке порушення структурно-функщонального стану кл^ин [4].
© Калачнюк Л., Басараб I., Мельничук Д., Мельничук С., Калачнюк Г., 2011
383
Якщо опублжоваш результати мають науково-теоретичне, тзнавальне й прикладне значення, то даш ще! статт стосуються розшифровки лiпiдного спектру гепатоциив i жирнокислотного складу кровi телят та з'ясуванню молекулярно-структурних змiн у фосфолшщах клiтин за конкретних умов екзогенно! дп традицiйного лiкування i поеднання останнього з використанням нового фосфолшщного препарату LP FLP-MD, який, як вже акцентувалось [4 -7], е важливим джерелом не тшьки фосфолiпiдiв, але й есенщальних жирних кислот та iнших життево-важливих факторiв для функцiонування клiтини.
Матер1али i методи. Для дослiджень використовували 1 - 7-добових новонароджених телят, яких за принципом аналогiв (тобто тварин, рiвнозначних за вiком, породою, статтю, вагою i т.д.) роздшяли на 4 групи (n=4-7) з масою тiла 28 - 36 кг. Телята першо! (I; контрольно!) групи були клмчно-здоровими, друго! (II; дослщно!) - хворими iз важкими проявами дiареl алiментарноl природи, третьо! (III) - пщдавалися традицiйному лiкуванню (ТЛ) [3, 4] i четверто! (IV) - поеднанню ТЛ iз застосуванням нового фосфолшщного препарату (ТЛ + БАД LP FLP-MD) [3, 4, 8, 9].
БАД LP FLP-MD розроблено на кафедрi бiохiмil тварин, якост i безпеки сшьськогосподарсько! продукци Нацiонального ушверситету бiоресурсiв i природокористування Украши Кабшету Мiнiстрiв Украши (м. Кшв, Украша). В його складi е сумш рiзних класiв фосфолiпiдiв, видiлених iз маслянки [8], i вiтамiну Е (фармакопейного а-токоферолу), якому притaмaннi антиоксидантш влaстивостi [4, 9] та iншi речовини [5].
У зразках печшки i сироватки кровi цих телят визначали спектр молекулярних компонентiв загальних лiпiдiв i фосфолiпiдiв, проводили aнaлiз жирних кислот, !х iдентифiкaцiю та кшькюне визначення згiдно методiв, описаних рашше [7]. Iз зрaзкiв тканин, сироватки кровi та iнших бюоб'екив екстрагували лiпiди за методикою I. Folch et al. [11 - 13, 15]. Для повшшо! екстракцп aнiонних фосфолiпiдiв застосовували модифжаци F.B. Palmer [12, 13]. Метилювання жирних кислот здшснювали сумiшшю 3 н. HCl у метaнолi при темперaтурi 100°С за методом W. W. Christive [14]. Одержaнi метиловi ефiри очищали застосуванням тонкошарово! хроматографа на скляних пластинках розмiром 6х9 см iз нанесеним на них шаром силжагелю L-5/40 ("Lachema", Чехiя). Анaлiз жирних кислот проводили методом газо-рщинно! хроматографа на хромaтогрaфi Carlo Erba (Iтaлiя) зi скляними набивними колонками (2,5x3 мм), заповненими Silar SCP ("Serva", Шмеччина). Iдентифiкaцiю кислот та кшьюсне !х визначення здiйснювaли за методикою, описаною В.А.Томчуком i Д.О.Мельничуком [12, 13].
Для визначення спектру молекулярних компонент загальних лiпiдiв i фосфолшвдв у гепатоцитах використовували методики дослщжень, якi описaнi в роботах [7, 8]. Для роздшення загальних фосфолшвдв на !х окремi молекулярш компоненти застосовували двохмiрну тонкошарову хроматографш, де у вертикальному напрямку застосовували систему розчинниюв хлороформ-метанол-вода (65:25:4), а в горизонтальному -хлороформ-метaнол-aмiaк (14:16:1).
Тканини вщ новонароджених телят одержували пщ час забою в забшному цеху. Ввдбраш зразки тканин збершали у середовищi рщкого азоту (в дюарах). Перед ан^зами 1х розтирали у рiдкому азот до попрошкоподiбного стану i використовували в подальших дослiдженнях.
Статистичну обробку отриманих цифрових даних здiйснювали з використанням критерiю "1" Стюдента [2].
Результати 1 обговорення. У дослiдженнях метаболiзму та структурно-функцiонального стану кл^ин особливе мiсце займае з'ясування змiн у лiпiдному спектрi гепатоциив телят, а також вивчення рiвня домiнуючих високомолекулярних карбонових кислот у фосфолшщах за умов норми, дiареl, традицiйного лiкування, при поеднаннi ТЛ iз застосуванням БАД ЬР БЬР-МО. Переважаюча кiлькiсть лiпiдiв за своею хiмiчною структурою е складними ефiрами високомолекулярних карбонових кислот i спирав (глiцеролу, сфiнгозину, холестеролу та шших). Крiм того, у складi багатьох лшщних сполук знаходять також залишки фософорно! кислоти, азотовмiсних основ (колам^, холiну), вуглеводiв тощо [2, 4 - 6].
Одержат результати наведено в рис. 1 - 3. 1з даних рис. 1 видно, що вс лшщш компоненти - холестерол, холестерол естерифжований, триацилглiцероли, есенщальш жирнi кислоти, фосфатидилхолiн, фосфатидилетаноламiн, кардюлшш, сфiнгомiелiн, фосфатидилсерин, фосфатидилiнозитол, а також i загальна кiлькiсть лiпiдiв у гепатоцитах телят за умов дiареl знижуються ~ на 30%, а ЕЖК та ФХ ~ на 40%, що вказуе на значш пошкодження клiтин, 1хнього структурно-функцiонального стану ^ передусiм, мембран. При традицшному лiкуваннi рiвень бiльшостi лiпiдних компонент (Х, ХЕ, ТАГ, КЛ, СМ та Ф1) спрямовуеться до норми. А таю показники, як ЕЖК, ФХ, ФЕ, ФС i ЗЛ ще залишаються вiрогiдно нижчими за норму. Тшьки при поеднаннi ТЛ iз застосуванням нового фосфолiпiдного препарату - БАД ЬР БЬР-МО структурно-функщональний стан гепатоцитiв диспепсiйних телят вдаеться суттево наблизити майже до норми.
Звщси слщ зробити висновки, що вс лiпiднi компоненти у гепатоцитах телят за умов дiареl знижуються на 30%. Традицшне двохтижневе лжування дозволяе значно покращати стан кл^ин печiнки перехворiлих телят, а поеднання традицiйного лiкування iз застосуванням нового фосфолшщвмюного препарату БАД ЬР БЬР-МО за вказаний перiод дозволяе майже вщновити структурно-функцiональний стан гепатоцитiв.
Рис. 1. Лшвдний спектр гепатоциив за умов лiкування неонатальних телят з проявами ашментарно д1аре!°
Результати, що представленi на рис. 2, показують, якi ж змши вiдбуваються в жирнокислотному склащ фосфолiпiдiв печiнки. Вони узгоджуються iз результатами попереднiх робiт [1 - 7] щодо вмiсту високомолекулярних карбонових кислот у фосфолшщах печiнки здорових та диспепсшних телят. Ц даш свiдчать про разючу кiлькiсно-якiсну перебудову молекул фосфолшвдв за вмiстом жирних кислот. Пщ впливом розладiв травлення вiрогiдно збiльшуeться рiвень пальмiтату (у 2,5 рази; 29,31±5,21 проти 8,28±0,36 %), пальмiтоолеату (у 2,2 рази; 6,62±2,07 проти 2,01±0,08 %) i стеарату (на 53%; 28,21±2,44 проти 18,44±0,69). Натомiсть, вiрогiдно зменшуеться вмкт олеату (на 67%; 8,36±3,08 проти 25,68±0,87 %) та лiнолеату (на 75%; 5,82±2,32 проти 22,63±0,91 %). При традицшному лiкуваннi вiдбуваеться перерозподш жирних кислот у напрямку суттевого наближення 1х до рiвнiв, яю знаходяться в здорових телят. Однак, перюд лiкування протягом 10-15 дшв, очевидно, ще е недостатнiм, бо рiзницi в порiвняннi з нормою залишаються в межах вiрогiдностi.
Тератя печiнки диспепсiйних телят шляхом поеднання традицшно! iз застосуванням нового фосфолшщвмкного препарату - БАД ЬР БЬР-МБ е набагато ефективнiшою. Мiжгруповi рiзницi у порiвняннi з контролем звужуються до мiнiмуму i стають не вiрогiдними. Цi результати узгоджуються iз даними щодо обсягiв ароВ та шших бiополiмерiв [1, 3, 5], а також iз результатами дослщження змiн молярного вiдсотку домiнуючих
високомолекулярних карбонових кислот у ЗЛ сироватки кровi новонароджених телят за умов гострих розладiв травно! системи та застосування засобiв ТЛ i поеднання його з використанням БАД ЬР БЬР-МО (рис. 3).
К Д ТЛ ТЛ*
□ палы.«тат Цпалы.шо-олеат Истеарат Полеат □лшолеат
Рис. 2. Вм1ст дом1нуючих високомолекулярних карбонових кислот у фосфолшщах гепатоцит1в за репаративноТ терапн неонатальних телят з ашментарною ентеропатолог1ею в % в1д загальноТ к1лькост1 ЖК
1з даних рис. 3 видно рiзке пiдвищення у лшщах сироватки кровi хворих телят молярного вщсотку пальмiтату (~ на 50 %), пальм^оолеату - у 2 з лишком рази i стеарату - у 3 з лишком рази при паралельному зменшенш вмiсту олеату - на 60 % i лшолеату - у бiльше, як у 4 рази щодо вiдповiдних велечин контролю. Слщ зазначити, вказанi кшьюсно-яюсш змiни жирнокислотного складу сироватки кровi новонароджених телят узгоджуються iз даними В.А. Томчука i Д.О. Мельничука [13]. Вони тдтверджують можливiсть появи вищеописаних молекулярно-структурних змiн у фосфолшщах гепатоциив новонароджених телят при дiареl.
Для глибшого розумiння i наукового пояснення виявлених змш у структурно-функщональному станi клiтин необхiдно, передусiм, звернути увагу на порушення !х мембран. Як вщомо, мембрани клiтин (у тому чи^ й гепатоцитiв) складаються з двох шарiв фосфолiпiдiв. Виршальним для еластичностi, пружностi й проникноси мембран е довжина i стутнь насичення жирних кислот у 1х фосфолiпiдах. Ацильнi групи насичених жирних кислот (довжиною > 16 С) сприяють меншiй текучостi мембран, в той час, як коротшi ненасичеш жирнi кислоти призводять до змши !х пружностi та покращення проникностг Якщо виходити iз того, що природнi
% 20
Пл1нолеат
К д тл
па]ыятат палылтоолеат ■ стеарат
Рис. 3. Змши молярного вщсотку домiнуючих високомолекулярних карбонових кислот у загальних лшщах сироватки кров1 новонароджених телят при дiареl та застосуванш лiкарських засоб1в ТЛ i БАД ЬР ЕЬР-МБ
глiцерофосфолiпiди мiстять у центральному (2-ому, Р-) положеннi залишки ненасичених, а в крайньому (1-ому, а-) - насичених жирних кислот, то багатократне збшьшення вмiсту насичених жирних килот (пальм^иново! + стеариново!) та статистично вiрогiдне зменшення ненасичених (олешово! + лшоленово!) у фосфолшщах гепатоцитiв новонароджених телят усвiдчуе значш молекулярно-структурнi змiни !х будови й оргашзаци. Адже пiд дiею комплексу факторiв, якими викликаеться дiарея, разом iз вказаними змiнами у структурi молекул фосфолiпiдiв, можливо, зникають звичайш та з'являються новi !х властивост й функци [2, 4-6]. Тому, наприклад, збiльшення молярного вiдсотку насичених жирних кислот та зменшення есенщальних жирних кислот у складi глщерофосфолшвдв, на наш погляд, може викликати "згущуванння" останнiх. А це може призводити до втрати еластичностi й основних функцш мембран, що супроджуватиметься зниженням. не тiльки ефективностi роботи окремих клiтин печiнки, але й органу в цшому. В юнцевому виразi такi змiни можуть суттево вщбиватися на загальному метаболiзмi оргашзму. Виходячи iз результатiв наших дослщжень, можна стверджувати, що при 15-деннш репаративнiй терапи хворих тварин за схемою комплексного лжування фосфолiпiдний препарат молочного походження (ЬР ЬЬР-МО) допомагае майже зовам наблизити вмiст жирних кислот й шших бiополiмерiв у кл^иш та у кровi до рiвня здорових тварин.
Таким чином, використання БАД ЬР ЬЬР-МО у комплекс iз традицiйним лiкуванням може мати суттевий вплив i на жирнокислотний склад фосфолiпiдiв мембран та на ефектившсть вiдновлення метаболiчних процеав, що пов'язанi з ними та взагалi i структурно-функцiональним станом кл^ин печiнки у неонатальних телят з алiментарною ентеропатологiею.
Висновки:
1. За умов дiаре! у кл^инах печшки неонатальних телят загальна кшьюсть лшвдв та основних лiпiдних компонентiв знижуеться ~на 30%. Тiльки використання лшосомально! форми фосфолiпiдвмiсного препарату молочного походження (ЬР БЬР-МО) у поеднаннi iз традицiйним лiкуванням дозволяе наблизити до норми вмют дослiджуваних лiпiдних сполук у гепатоцитах.
2. Вмiст домiнуючих високомолекулярних карбонових кислот у фосфолшщах печшки та сироватки кровi пщ впливом патологiчних змiн, викликаних дiареею, супроводжуеться вiрогiдним збiльшенням пальм^иново!, пальм^оолешово! i стеариново! та зменшенням оле!ново! й лшолево! кислот;
3. Традицшне лiкування телят дозволяе суттево покращати стан вмiсту вказаних високомолекулярних кислот у фосфолшщах печшки i сироватки кровi та наблизити його до рiвня здорових тварин, однак, перюд терапи протягом 1015 дшв слiд вважати недостатнiм;
4. Тератя шляхом поеднання традицшно! методики i застосування нового фосфолiпiдвмiсного препарату ЬР БЬР-МО е набагато ефектившшою, адже, жирнокислотний склад фосфолiпiдiв у гепатоцитах майже нормалiзуеться впродовж двох тижшв лiкування..
5. Одержанi даш важливi для розумiння закономiрностей змш структури i функцiй природних глщерофосфатсв та причин зрушень у мюцях розмiщення в !х молекулах насичених i есенцiальних жирних кислот, а також - ролi цих бiополiмерiв у структурi i функци мембран кл^ин при дiареях та л^ванш тварин.
Л1тература
1. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Молекулярш механiзми регуляци синтезу, метаболiзму й секреци лiпопротенiв у клiтинах печшки // Вшник Львiвського ун-ту. Серiя Бiол. 2004.- Вип.38. - С.3-20.
2. Калачнюк Л., Мельничук Д., Калачнюк Г. Молекулярно-структурш змiни у фосфолшщах гепатоциив новонароджених телят у разi дiаре! // Вiсник Львiвського ун-ту. Серiя Бiол. - 2004. - Вип. 35. - С. 71 - 76.
3. Обсяги ароВ та шших бiополiмерiв у кл^инах печiнки за репаративно! терапи неонатальних телят з алiментарною ентеропатолопею / Л. Калачнюк, Д. Мельничук, Г. Калачнюк, О. Савка // Наук. вшник ЛНАВМ iм. С.З. Гжицького, Львiв, 2005. - Т. 7, № 2, Ч. 1. - С. 37 - 44.
4. Мельничук Д., Грищенко В.А. Показники лшщного i фосфолшщного спектрiв плазми кровi за репаративно! терапи при неонатальнш ентеропатологi! телят // Укр. б^м. журн. - 2005. - Т. 77. - № 1. - С. 89 - 95.
5. Використання лшосом на основi фосфолшвдв молока у гепатологи / Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, В.А. Томчук, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк [та ш] // Монографiя. Пiд загальною редакцiею академiка НАНУ та НААНУ Д.О. Мельничука. - К., 2010. - 428 с
6. Калачнюк Л.Г., Мельничук Д. О., Калачнюк Г.1. Регулящя метаболiзму жирних кислот та шших лшщних сполук у жуйних тварин // Укр. б^м. журн. 2007. - Т.79, №1. - С. 22 - 45.
7. Метаболiзм лшвдв в opraHi3Mi жуйних тварин / Д. Мельничук, Л. Калачнюк, Г. Калачнюк, [та iH.] // Вюник Львiвського ун-ту. Серiя Бiол. - 2003. - Вип.34. - С. 41 - 51.
8. Патент № 1289440 А1 СССР, А 61 К37/22. Способ получения фосфолипидов. Д.А. Мельничук, В.К. Лишко, А.В. Стефанов и др. Заявлено 23.01.85. Опубликовано 15.02.87.
9. Хомич В.Т., Грищенко В.А. Особливост ультраструктурних змш ештелюциив з посмугованою облямiвкою слизово! оболонки порожньо! кишки у перехворiвших на ентеропатологiю телят // Бюлопя тварин, Львiв. -2004. - Т. 6, № 1-2. - С. 332 - 338.
10. Recent advances in membrane microdomains: rafts, caveolae, and intracellular cholesterol trafficking / F. Schroeder, A.M. Gallegos, B.P. Atshaves [et al.] // Experimental Biology and Medicine. - 2001. - Vol. 226. - P. 873 - 890.
11. Новицкая Г.В. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии липидов, Москва: Наука, 1972. - 64 с.
12. Томчук В. А. Гомеостаз кровi телят, хворих на диспепсш, за складом i кшьюстю лшвдв // Вет. мед. Укра!ни. - 2001. - № 10. - С. 26 - 27.
13. Томчук В.А., Мельничук Д.О. Природа i склад жирних кислот лшвдв кровi новонароджених телят при диспепсп // Укр. бiохiм. журн. - 2003. - Т. 75, № 1. - С. 72 - 77.
14. Christlie W. W. Lipid analysis. Oxford: Pergamon Press., 1979. 338 p.
15. Sarsunova M., Schwarz V., Michalec C. Chromatografia na tenkych vrstvach vo farmacii a v klinickej biochemii, Bratislava: Osveta, 1977. - 624 s.
Summary
It has been shown that during 10 - 15 days, diarrhea treatment plan (DTP) doesn't allow to restore completely the content of total lipids (TL), cholesterols (C); the esterified cholesterols (EC); triacylglycerols (TAG); essential fatty acids (EFA); phosphatidylcholine (PC); phosphatidylethanolamine (PE); cardiolipin (CL); sphingomyelin (SM); phosphatidyl serine (PS) and phosphatidylinositol (PI) in the liver cells and the molar percentage of dominant high molecular carbonic acids in phospholipids of hepatocytes and in TL of the blood serum appearing under illness conditions. Complex treatment plan (DTP + LP FLP-MD) permits almost completely to liquidate the differences of indexes determined in healthy and sick animals. The combination of DTP with use of LP FLP-MD allows nearly restoring the content of dominant fatty acids in hepatic phospholipids in the calves; and that was not achieved under only dyspepsia treatment plan. It is displayed the interpretation of the obtained results in the light of structure and function of lipids in membranes of cells and of arrangement of saturated and essential fatty acids in their molecules.
Key words: phospholipids components, fatty acids, membranes, liver cells, calves, diarrhea, treatment remedies, liposomes of milk.
Стаття надшшла до редакцИ 7.05.2011
