CC BY
20
2УДК 619:615:577.1:616-003.269:636
Калачнюк Л.Г.1' 2 д.б.н., доцент; Басараб 1.М. 1-3, асистент;
Мельничук Д.О. 1, д.б.н., професор, академiк НАНУ i НААНУ, Мельничук C.Д. 1, д.б.н., професор, член-кор. НААНУ Калачнюк М.С.1, студент Кошман О.В1, магiстрант Калачнюк Г.1. 1, 2, д.б.н., професор 1Нацгональний унгверситет бгоресурсгв / природокористування Украгни 2Львгвський нацгональний ушеерситет ветеринарног медицини та бготехнологгй
1мен1. С. З. Гжицького 31нститут фгзгологгг / генетики тварин Чеськог АН, Прага, Чеська Республгка
ОКИСНЕННЯ ЛАКТАТУ ТА ЛОКАЛ1ЗАЦ1Я ЛДГ У СУБСТРУКТУРАХ КЛ1ТИНИ ЗА УМОВ ДП ЕКЗОГЕННИХ ФАКТОР1В
Наведено класичт методичт пгдходи до фундаментального вивчення особливостей окисно-вгдновних процеав у клтию печтки на стадп утворення й утил1зацп кгнцевих продуктгв глгколгзу - лактату г трувату за ргзних умов проведення експериментальних дослгджень.
Показано чгткг змти активност1 лактатдег1дрогенази (ЛДГ) у цитозоль-мтросомальнт г мгтохондргальнгй фракщях гепатоцит1в неонатальних телят за умов дгарег (Д), традицтного лтування (ТЛ) та поеднання ТЛ гз застосуванням бгологгчно активног добавки, що мктить ессенц1альш фосфолШди молока у лтосомальнт форм1 (БАД LP FLP-MD). Виявлено, що реакцгг, якг катал1зуються ензимом, головним чином, локал1зоваш у цитозоль-мтросомальнт фракцп клтини печтки. За умов Д активтсть ЛДГ в обох субструктурах клтини вгроггдно зростае. ТЛ суттево знижуе гг каталтичну дт. Поеднання ТЛ гз застосуванням БАД LP FLP-MD дозволяе майже наблизити до норми активтсть лактатдег1дрогенази у дослгджуваних компартментах гепатоцит1в. При цьому за умов дгарег в1дм1чаеться зниження в 2 рази р1вня лактату г настыьки ж тдвищення концентрацп трувату в тканин печтки. ТЛ та особливо поеднання його гз застосуванням БАД LP FLP-MD вгроггдно нормал1зують вм1ст цих важливих метаболт1в у клтит.
Загалом, стан процеав окиснення лактату в труват та зворотна лактатдег1дрогеназна реакц1я в субструктурах клтини печтки поражених дгареею неонатальних телят найшвидше наближаються до норми при поеднаннг ТЛ гз застосуванням БАД LP FLP-MD.
Ключовi слова: лактат, труват, лактатдег1дрогеназа, цитозоль-мтросомальна г мтохондр1альна фракцп гепатоцит1в, неонатальн телята, д1арея, традицтне лЫування, лтосоми молока.
Вщомо, що лактатдегщрогеназа (ЛДГ; КФ 1.1.1.27) кат^зуе процес перенесення двох електрошв i одного юна Н+ вщ лактату до НАД+ (рис. 1).
© Калачнюк Л., Басараб I., Мельничук Д., Мельничук С., Калачнюк М., Кошман О., Калачнюк Г., 2011
80
ОН
сн о
Н3С с
II
о
1_-лактат
Рис. 1. Реакщя, що катал1зуеться ЛДГ.
Виходячи з того, що лактат тд впливом ЛДГ у присутност НАД+ окислюеться у труват, а в присутностi НАДН, навпаки, труват - у лактат, то тдвищення активностi ензиму в клiндiагностицi використовуеться як один iз важливих маркерiв, що характеризуе стан значних порушень внутрiшньоклiтинного метаболiзму в тканинах i передусiм у печiнцi. У зв'язку з цим в основну мету нашо! експериментально! роботи входило дослщження змiн активностi ЛДГ у субкл^инних фракцiях та рiвня лактату i пiрувату у гепатоцитах новонароджених телят за умов дiаре! та застосування сучасних лжарських засобiв.
Матер1али 1 методи. Для дослiджень використовували 1 -7 добових новонароджених телят, яких за принципом аналогiв (тобто тварин рiвнозначних за вiком, породою, статтю, вагою i т.д.) роздшяли на чотири групи (п=4 - 7) з масою тiла 28 - 36 кг. Телята першо! (I; контрольно!) групи були клмчно здоровими, друго! (II; дослщно!) - хворими iз важкими проявами дiаре! алiментарно! природи, третьо! (III) - тддавалися традицiйному лiкуванню (ТЛ) i четверто! (IV) -поеднанню ТЛ iз застосуванням ново! фосфолшщвмкно! бюлопчно активно! добавки (ТЛ + БАД LP FLP-MD. Про склад згадано! добавки, умови i методи дослщжень було описано детальнiше у попередтх роботах [1 - 4] та нижче.
Результати 1 обговорення. При вимiрюваннi швидкостi реакцiй, якi вщбуваються за участю НАД+ чи НАДФ+ (зазвичай такi реакцi! каталiзуються дегщрогеназами) нами було враховано тi обставини, що НАДН i НАДФН (але не НАД {НАДФ ) поглинають свило з довжиною хеша 340 нм (це показано на рис. 2).
1,0
л
I-и I
Л
£
я 0,5 г т х 1с О
0
250 350
Довжина хвил1, нм
Рис. 2. Спектри поглинання НАД+ 1 НАДН (концентращя розчишв 44 мг/л, довжина оптичного шляху 1 см. Так1 ж спектри мають НАДФ+ 1 НАДФН вщповщно).
НАДН о
ЛДГ С о-
Н.С С
НАД+ 0
гпруват
Окиснення НАДН у НАД+ (або зворотнш процес) супроводжуеться змшою оптично! щiльностi D розчину при 340 нм. За певних умов швидккть змши D виявляеться пропорцюнальною активноси ензиму (рис. 3).
I
Час, хв
Рис. 3. Принцип ви]шрювання активност НАДН- або НАДФН-залежноУ дегвдрогенази. Вшупрювали швндкчсть 1 змши оптичноУ щшьност при 340 нм, зумовленоУ перетворенням вщновленого коферменту в окиснену форму. У кювету додавали окиснений субстрат (8), вщновлений коензим 1 буфер та репстрували поглинання при А I 340 нм. Спочатку спостерiгали високу оптичну щшьшсть через сильне поглинання НАДН (чи НАДФН). При додаванш 0,025 ...0,2 мл стандартного розчину ензиму оптична щшьшсть знижуеться.
Для отримання калiбрувально! криво! (рис. 4) було побудовано графж залежностi швидкост змiни оптично! щiльностi (нахилу прямих, що показанi на рис. 3) вщ об'ему доданого ензимного препарату. Кшькють ензиму, що знаходиться в дослщжуваному розчинi легко вимiрюеться за спостереженням
Об'ем розчину ензиму, мл
Рис. 4. Кашбрувальна крива для визначення кшькосл ензиму. По ои ординат вiдкладено тангенс (tg) кута нахилу прямих, що наведен на рис. 3, по оа абсцис - кшьккть ензиму.
Звщси на конкретному прикладi методично показано оцшку ензимно1 активности яка грунтуеться на вимiрi швидкостi утворення продукту (НАДН). Швидккть утворення продукту (або ж, рщше, швидкiсть витрачання субстрату S) можна з устхом використовувати для визначення активност не тiльки дегiдрогеназ але й iнших ензимiв. Конкретний метод кшькюно! оцiнки диктуеться завжди фiзико-хiмiчними властивостями продукту чи субстрату. Тому у багатьох випадках пiддають утворений продукт реакци дп тае1 дегщрогенази, для яко! цей продукт е субстратом.
Вищенаведений класичний методичний пiдхiд дозволив визначити змши активностi ЛДГ у субклiтинних фракщях гепатоцитiв неонатальних телят за умов алiментарноl диспепси та застосування рiзних способiв лiкування.
Як вже згадувалось вище, що лактат пiд впливом ЛДГ у присутност НАД+ окиснюеться в пiруват i тому при найвищш активностi лактатдегiдрогенази рiзко знижуеться рiвень лактату та пiдвищуеться концентращя пiрувату. На це вказують результати наших дослщжень i зокрема змши активност ензиму у компартментах гепатоциив та рiвня лактату й трувату у тканинi печiнки, що наведеш у таблицях 1 - 3.
Таблиця 1
Актившсть ЛДГ у субструктурах гепатоцит1в телят за умов норми (К), д1аре¥ (Д), традицшного л1кування (ТЛ) та при застосуванш БАД LP FLP-MD (М±т;
п=5)
Одинищ активносп та вим1ру р1зниць Стан здо ров'я телят
Норма; контроль(К) Дтрея (Д) Способи лжування
ТЛ ТЛ+ЬР FLP-MD
Цитозоль-мжросомальна )ракщя
Мжромоль НАДН/хвмг бшка 1,97±0,10 2,89±0,20 2,61±0,11 2,21±0,23
Факт. Р1зниц1 до К - +0,92 +0,64 +0,24
Р1знищ у % - +46,7 +32,5 +12,2
р - <0,001 <0,05 <0,1
Мггохондаальна фракщя
Мжромоль НАДН/хвмг бшка 0,84±0,09 1,58±0,11 1,34±0,13 1,01±0,10
Факт. Р1зниц1 до К - +0,74 +0,50 +0,17
Р1зниц1 у % - +88,1 +59,5 +20,2
р - <0,001 <0,05 <0,1
1з наведених у табл.1 даних видно, що за умов дiареl у цитозоль-мiкросомальнiй фракци гепатоциив телят друго1 групи вiрогiдно зростае актившсть ЛДГ (на 46,7 %). При традицшному лжуванш (III група) вона знижуеться, при додатковому до ТЛ застосуванш БАД суттево наближаеться до норми, тобто до рiвня, що у вiдмiчаеться у тварин контрольное' (I) групи. Аналопчш змши вщбуваються i у мiтохондрiальних фракщях кл^ин печiнки телят усiх порiвнюваних груп. Цiкавим е той факт, що у цитозоль-мжросомальнш фракци гепатоциив здорових телят активнiсть ЛДГ ~ у 2 рази е вищою, нiж у фракци мiтохондрiй. Це вказуе на основне мкце локалiзацil ензиму в клiтинi. У мiтохондрiальнiй фракци активнiсть його очевидно проявляеться головним чином за рахунок залишюв ензиму, що знаходяться на поверхнях зовшшшх мембран.
Важливо й те, що дат табл. 1 сповна узгоджуються з висновками стосовно закономiрностей змш концентрацш лактату й трувату у тканинi печiнки телят згаданих груп (табл. 2 i 3). Рiвень молочно! кислоти в тканиш печiнки за умов дiаре! вiрогiдно знижуеться (на 48 %). Значне зростання лактату спостер^аеться при ТЛ. Однак, досягти контрольного рiвня цим способом лжування не вдаеться i тому мiжгруповi рiзницi тут залишаються ще вiрогiдними.
Таблиця 2
Концентращя лактату в тканннi печiнки телят за умов дiареl та рiзних
способ1в лжування (М±т; п=5)
Одинищ вим1ру та р1знищ Стан здо зов'я телят
Норма; контроль(К) Дтрея (Д) Способи лжування
ТЛ ТЛ+ЬР FLP-MD
Мжромоль /г сиро!' тканини 12,84±0,92 6,68±1,01 9,08±0,83 11,28±1,11
Факт. Р1зниц1 до К - -6,16 -3,76 —1,56
Р1зниц1 у % - -48 -29,3 -12,15
р - <0,001 <0,05 >0,5
Таблиця 3
Концентращя трувату в тканиш печшки телят за умов дiареl та рiзних
способiв лжування
Одинищ вим1ру та р1зниц1 Стан здо ров'я телят
Норма; контроль(К) Дтрея (Д) Способи лжування
ТЛ ТЛ+ЬР FLP-MD
М1кромоль /г сиро!тканини 0,28±0,01 0,63±0,09 0,42±0,03 0,34±0,09
Факт. Р1зниц1 до К - +0,35 +0,14 +0,06
Р1зниц1 у % - +125 +50 +21
р - <0,001 <0,05 >0,5
Слщ зазначити, що використання БАД LP FLP-MD у поеднаннi з ТЛ наближае концентрацш лактату в тканиш печшки телят, яю перехворши дiареею, до рiвня контролю. При цьому привертае до себе увагу зовам шша картина, що спостерiгаеться при визначенш концентрацi! пiровиноградно! кислоти в аналопчних варiантах дослiджень (табл. 3). Концентращя цього метаболиу в тканиш печшки здорових (контрольних) телят е ~ у 45 разiв нижчою, нiж молочно! кислоти, що вказуе на дуже високу iнтенсивнiсть його використання порiвняно з лактатом. У телят з ентеропатолопею, очевидно, процеси утилiзацi! пiрувату загальмовуються i його концентращя в тканиш печшки зростае на 125 %. ТЛ сприяе зменшенню на 66 % його концентраци порiвняно з <^арейними» телятами. Поеднання ТЛ iз застосуванням БАД LP FLP-MD майже повертае концентрацш трувату в тканиш до рiвня здорових телят.
Наведет результата узгоджуються з даними попередшх дослщжень [1 - 5, 7, 8], яю свщчать, що пероральне введення упродовж 10 - 16 дшв один раз на добу 1%-ого розчину лшосомально! форми бiологiчно активно! добавки LP FLP-MD у дозi 10 - 20 мг/кг живо! маси тварини дозволяе на 75 - 95 % нормалiзувати актившсть багатьох маркерних ензимiв i загальний стан обмiну речовин в органiзмi неонатальних телят з алiментарною дiареею. До наведеного доречно додати, що для бшьшосп органiзмiв при вiдсутностi оксигену деградацiя глюкози
до трувату - це едина можливкть отримання енерги для синтезу АТФ. А для тдтримки процеЫв raiKoni3y i синтезу АТФ утворений НАДН повинен постшно окиснюватися до НАД+. Цi процеси у кл^инах еукарiотiв завжди пов'язаш з вiдновленням пiрувату до лактату [6].
Висновки:
1. Виявлено чiткi змiни активностi ЛДГ у субструктурах гепатоциив неонатальних телят за умов дiареï, традицiйного лiкування i поеднання останнього i3 застосуванням БАД LP FLP-MD.
2. Реакци, якi каталiзуються ЛДГ головним чином локалiзованi у цитозоль-мiкросомальнiй фракцiï клiтин печшки.
3. За умов дiареï актившсть ЛДГ вiрогiдно зростае в обох субструктурах. Традицшне лiкування суттево знижуе ïï каталiтичну дiю. Комплексне застосування ТЛ iз БАД LP FLP-MD дозволяе майже наблизити актившсть ЛДГ до норми.
4. За умов дiареï в 2 рази знижуеться рiвень лактату та на стшьки ж тдвищуеться концентращя пiрувату в тканиш. Традицiйне лiкування i особливо поеднання його iз застосуванням БАД LP FLP-MD вiрогiдно нормалiзують вмют вказаних метаболiтiв.
Л1тература
1. Використання лшосом на основi фосфолiпiдiв молока у гепатологи / Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, В.А. Томчук, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк, С.В. Хижняк, В.М. Войцщький, С.П. Весельський, О.М. Литвиненко // Монографiя. Пiд загальною редакцiею академiка НАН та НААН Украши Д.О. Мельничука. - К.: НУБШУ, 2010. - 400 с.
2. Калачнюк М., Басараб I., Калачнюк Г. Екзогенне шпбування активносп лактатдегiдрогенази у субструктурах гепатоцитiв неонатальних телят при алiментарнiй дiареï // Збiрник тез. VII Мiжнародна наукова конференщя студентiв та аспiрантiв «Молодь i поступ бюлоги» (5-8 квггня 2011). Львiв: ЛНУ iменi I. Франка - 2011. - С. 50 - 51.
3. Калачнюк. Г.И., Басараб И.М., Калачнюк. Л.Г. Активность маркерных энзимов в гепатоцитах неонатальних телят с энтеропатологией и при использовании липосом на основе фосфолипидов молока // Российский журнал гастроэтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №37. - Т. XXI, № 1. - С. 249.
4. Структурно-функщональш зрушення в лшщах гепатоциив i кровi неонатальних телят за дiареï та лжувальнох' ди лшосом на основi фосфолшдав молока / Калачнюк Л.Г., Басараб IM., Мельничук Д.О., Мельничук С.Д., Калачнюк Г1. // Наук. вкник ЛНУВМтаБТ iм. С.З. Гжицького, Львiв, 2011. -Т.13, №2 (48), Ч.1. - С.383 - 390.
5. Калачнюк Л.Г., Мельничук Д.О., Калачнюк ГХ Регулящя метаболiзму жирних кислот та шших лшщних сполук у жуйних тварин // Укр. бiохiм. журн. 2007. Т.79, №1. - С. 22 -45.
6. Кульман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 469 с.
7. Срога М., Басараб I., Калачнюк Л. Корекщя активност амшотрансфераз у компартментах кл^ин печшки неонатальних телят // Збiрник тез. VII
Мiжнародна наукова конференщя студенев та асшранив «Молодь i поступ бюлогп» (5-8 квiтня 2011). Львiв -ЛНУ iMeHi I. Франка, 2011. - С. 74 - 75.
8. Yakymchuk I.S., Basarab I.M., Kalachnyuk L.G., Kalachnyuk G.I. Plural spectrum of molecular isoforms of LDH in the hepatic cells of newborn calves with digestive disorders // Зб. пр. Мiжнар. науково-практ. конф. молодих вчених, асшранив i студенев «Науковi здобутки молодi у вирiшеннi актуальних проблем виробництва та переробки сировини, стандартизаци i безпеки продовольства». 20 -22 квггня 2011 р.. - Кшв: НУБiП Укра1ни. - С. 376.
Summary
L. Kalachnyuk1, I. Basarab1-3, D. Mel'nychuk1, S. Mel'nychuk1, M. Kalachnyuk1, O. Koshman1, G. Kalachnyuk1'
'National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Heroyiv Oborony st. 15, Kyiv 03041, Ukraine 2 L 'viv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z.
Gzhytskyi, Pekarska st. 50, L 'viv 79010, Ukraine;
3Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, Prague,
Czech Republic
OXIDATION OF LACTATE AND LDH LOCALIZATION IN THE SUBSTRUCTURES OF CELL UNDER EFFECT OF EXOGENOUS FACTORS
It has been presented classic methodical techniques of fundamental study of peculiarities of oxido-reduction processes in the hepatic cell at stage of formation and utilization of the glycolysis end-products - lactate and pyruvate under the different conditions of experimental investigations.
It has been shown clear changes of lactate dehydrogenase (LDH) activity in cytosol-microsomal and mitochondrial fractions of hepatocytes of neonatal calves under conditions of diarrhea («Д»), reparative therapy of sick animals according 2 plans [(a) dyspepsia treatment plan (DTP) and (b) complex treatment plan: DTP + biologically active supplement, which is contained essential phospholipids of milk in liposomal form (LP FLP-MD). It was discovered that reactions, which are catalyzed by enzyme, mainly are localized in the cytosol-microsomal fraction of hepatic cell. Under conditions «Д», LDH activity is significantly increased. DTP decreases substantially its catalytic action. Complex treatment plan (DTP + LP FLP-MD) permits almost move nearer LDH activity to norm in the studied compartments of hepatocytes. Under conditions of diarrhea, in the hepatic tissue, it was observed decrease of lactate level in 2 times and increase of pyruvate concentration in 2 times. DTP and complex treatment plan normalize significantly content of these important metabolites in the cell.
Generally, state of processes of lactate oxidation into pyruvate and reversible reaction catalyzed by LDH in the substructures of hepatic cell in the neonatal calves with diarrhea are come to norm under conditions of complex treatment plan.
Key words: lactate, pyruvate, lactate dehydrogenase, cytosol-microsomal and mitochondrial fractions of hepatocytes, neonatal calves, diarrhea, dyspepsia treatment plan, milk liposomes.
Рецензент - д.с.-г.н., проф., чл.-кор. НААНУ Кирил1в Я.1.
