ІЗОЗИМ ЛДГ5(М4 - γ2) - КЛЮЧОВИЙ МОЛЕКУЛЯРНИЙ МАРКЕР ПОШКОДЖЕНЬ СУБСТРУКТУР ГЕПАТОЦИТІВ У НОВОНАРОДЖЕНИХ ТЕЛЯТ ЗА АЛІМЕНТАРНОЇ ДІАРЕЇ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

2УДК 619:615:577.1:616-003.269:636

Калачнюк Л.Г.1' 2 д.б.н., доцент; Басараб 1.М. 1-3, асистент;

Мельничук Д.О. 1, д.б.н., професор, академк НАНУ {НААНУ, Мельничук С.Д. 1, д.б.н., професор, член-кор. НААНУ Калачнюк М.С.1, студент Калачнюк Г.1. 1, 2, д.б.н., професор Нацюнальнийутверситет бюресурсгв / природокористування Украгни 2Львгвський нацюнальнийутверситет ветеринарногмедицини та бютехнологт 1мет. С. 3. Гжицького 31нститутфгзюлогШ генетикитварин ЧесъкогАН, Прага, ЧеськаРеспублгка

ВОЗИМ ЛДГ5(М4 - 72) - КЛЮЧОВИЙ МОЛЕКУЛЯРНИЙ МАРКЕР ПОШКОДЖЕНЬ СУБСТРУКТУР ГЕПАТОЦИТ1В У НОВОНАРОДЖЕНИХ ТЕЛЯТ ЗА АЛ1МЕНТАРН01Д1АРЕ1

Наведено резулътати експерименталъних дослгдженъ п 'яти /зоформ лактатдег1дрогенази (КФ 1.1.1.27): ЛДГ1 (тетрамер Н4 - а1), ЛДГ2 (тетрамер Н3М1 - а2), ЛДГ3 (тетрамер Н2М2 - ¡3), ЛДГ4 (тетрамер Н1М3 - у1) / ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2) у субструктурах гепатоцит1в неонаталъних телят за розвитку ал1ментарногд1арег.

Показано, що спектри вказаних множинних молекулярних Iзоформ I активтстъ лактатдег1дрогенази у цитозолъ-мшросомалътй / мтохондр1алъний фракщях гепатоцит1в неонаталъних телят виявляютъся р1зними. Хоча ензим локал1зуетъся в цитоплазмI його &мейство молекулярних ¡зоформ змтюе ф1зико-х1м1чт властивост1, будову / тдвищуе каталтичну активтстъ у зв'язку з наближенням до окремих субструктур клтини /, зокрема, до мембран мгтохондрт, очевидно, для прискореного забезпечення функцюнування метабол1чних шляхгв /, передуст, - глжолгзу, ЦТК, глюконеогенезу та циклу Корг.

За умов розвитку ал1ментарног д1арег у неонаталъних телят у цитозолъ-мтросомалъшй / мтоходр1алътй фракцтх гепатоцит1в вгроггдно зростае активтстъ лактатдег1дрогенази. Шдвищення гг активност1 за дп фактор1в д1арегв1дбуваетъся зарахунок посиленого бюсинтезумолекул /зозиму ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2). За зм1нами обсяг1в цъого /зозиму у субструктурах клтин печтки можна реально д1агностувати виникнення та стутнъ розвитку ал1ментарногд1арегу новонароджених телят.

Ключов1 слова: лактатдег1дрогеназа, /зозим ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2), субструктури гепатоцит1в, неонаталът телята, д1арея.

1зозими лактатдегщрогенази (ЛДГ) р1зняться на р1вш четвертинно! структури. Ол1гомерна молекула ЛДГ (мол. маса ~ 130тис.) складаеться ¿з чотирьох протомер1в двох тишв Н I М (обидва з мол. масою ~ 34 тис.).

© Калачнюк Л., Басараб I., Мельничук Д., Мельничук С., Калачнюк М., Калачнюк Г., 2012

39

Катал1тичну актившсть мае тшьки тетрамерна молекула. Синтез Н - i М -субодиниць детермшуеться р1зними генетичними локусами, як1 по-р1зному експресуються у р1зних тканинах [1-7].

Через те, що ЛДГ катал1зуе двохсторонню реакцш вщновлення шровиноградно! кислоти в молочну в присутност1 НАДН, то актившсть цього ензиму виявляеться у Bcix кл1тинах i бюрщинах. Пщвищення активное^ вщбуваеться при р1зних пошкодженнях тканин, в тому числ1 i печшки.

При електрофоретичному роздшенш рухлив1сть ¿зозим1в вщповщае сироватковим бшкам а1, а2, Р, у1, у2 i вони нумеруються: ЛДГ1 (найбшьш рухливий), ЛДГ2, ЛДГз, ЛДГ4 i ЛДГ5 (найменш рухливий). 1зозим ЛДГ1 (тетрамер Н4 - а1) присутнш у високих концентращях у м'яз1 серця, еритроцитах i корков1м mapi нирок, а ¿зозим ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2) - у скелетному м яз1 та печшщ.

Рашше ми звертали увагу на змши у стввщношеннях р1зних ¿зоформ ЛДГ в кл1тинах печшки за умов порушення i вщновлення процеав травления у телят [1-5], а у цьому повщомленш наводяться експериментальш даш щодо в1рогщного збшьшення обсяпв ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2) у гепатоцитах новонароджених телят за ал1ментарно! fliapei, що може бути використаним при д1агностуванш хвороби та згодом i при перев1рщ ефективност1 застосування р1зних терапевтичних засоб1в.

Матер1али i методи. Для дослщжень використовували 1 - 7-добових новонароджених телят, яких роздшяли за принципом аналопв (р1внозначних за в1ком, породою, статтю, вагою) на дв1 групи з масою тша 28-36 кг. Телята першо! (I; контрольно!) групи були клЫчно здоровими, а друго! (II; дослщно!) - хворими ¿з важкими проявами д1аре! ал1ментарно! природи. Субкл1тинш фракци гепатоцит1в отримували диференцшним центрифугуванням [8-10], а ¿зозими та актившсть ЛДГ визначали за загальноприйнятими методами [2, 9]. Статистичне опрацювання отриманих цифрових даних виконували за допомогою програми Microcal Orgin (Version: 5,0) з використанням критерш Сьюдента "t".

Результата i обговорення. Одержан! результати наведено на рис. та у табл. 1 i 2.

1з наведених на рисунку даних видно, що за умов д1аре! у цитозоль-мжросомальтнш фракци кл1тин печшки актившсть ЛДГ зростае на 47 %. Аналопчна м1жгрупова картина змш вщбуваеться i при дослщженш активност1 ЛДГ у м1тохондр1альнш фракци. Однак, у цш фракци фактична актившсть ензиму е майже в 2 рази нижчою, шж у плазматичнш частиш кл1тини. Це свщчить, що основне мкце лактатдегщрогенази зосереджене в цитоплазм!, але значна кшьюсть И може знаходитись i на зовшшшх мембранах м1тохондрш. Про паралельш кшьккш змши субстрат1в й продукт1в реакцп (труват i лактат) у вказаних фракщях гепатоцит1в було сказано рашше [1 - 5] i вони також свщчать про значну деструктивну дш порушень, викликаних факторами д1арейного стану в оргашзм1 новонароджених телят.

40

Рис. Вщносш (%) та (фактнчш; мкмоль НАДН/хв-мг бшка) змшн активное™ лактатдегщрогеназн в субструктурах гепатоцнпв неонатальних телят за умов норми (I; контроль), fliape'i (II), (M±m; n=5).

Таблиця 1

Змшн спектру множинних молекулярних ¡зоформ ЛДГ у цитозоль-мжросомальнш фракцй* гепатоцит1в неонатальних телят за дй' чннннк1в

Опис стану здоров'я телят i р1знищ Множинш молекулярш 1зоформи ЛДГ

ЛДГ1 (тетрамер Н4 - а1) ЛДГ2 (тетрамер Н3М - а2) ЛДГз (тетрамер Н2М2 - ß) ЛДГ4 (тетрамер НМ3 - у:) ЛДГ5 (тетрамер М4 - У 2)

Норма (К) 10,01±0,25 9,97±0,21 26,35±1,19 43,65±1,48 10,02±0,78

Д1арея 8,29±0,17 8,61±0,14 20,11±0,78 35,37±1,11 27,62±2,33

Факт.р1знищ до К -1,72 -1,36 -6,24 -8,26 +17,60

Р13НИЩ в % до К -17,18 -13,64 -23,7 -18,9 +176

р <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,001

Наведет даш узгоджуються ¿з результатами шших експериментальних дослщжень, як1 стосуються вивчеиия спектру множииних молекулярних ¿зоформ ЛДГ у субструктурах гепатоцит1в вищевказаних груп телят. Зокрема, це видно з даних табл. 1 I 2.

Слщ зазначити, що тут за умов д1аре! ще бшьш ч1тюше збшьшуеться молярний вщсоток ¿зоформи ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2; Р<0,001). Це вщбуваеться на тл1 зниження обсяпв ЛДГ2 (тетрамер Н3М - а2), ЛДГ3 (тетрамер Н2М2 - Р) [ ЛДГ4 (тетрамер Н1М3 - у1).

41

Таблиця 2

Змши спектру множинних молекулярних ¡зоформ ЛДГ у мгтохондр1альнш

фракцп гепатоцнтчв неонатальних телят за дй' екзогенних фактор1в __(моль%, М±т; п=5)_

Опис стану здоров'я телят 1 р1знищ Множинш молекулярш1зоформи ЛДГ

ЛДГ1 (тетрамер Н4 - а1) ЛДГ2 (тетрамер Н3М - а2) ЛДГэ (тетрамер Н2М2 - Р) ЛДГ4 (тетрамер Н1М3 - у:) ЛДГз (тетрамер М4 - у 2)

Норма (К) 11,66±1,02 29,34±0,64 38,21±0,67 19,47±0,38 1,32±0,89

Д1арея 12,58±0,17 23,41±0,14 33,12±0,82 15,01±0,61 15,88±3,32

Факт.р1знищ до К +0,92 -5,93 -5,09 -4,46 +14,56

Р1знищ в % до К +7,9 -20,2 -13,3 -22,9 +1103

Р >0,5 <0,001 <0,05 <0,01 <0,001

Виявлеш р1знищ в спектр! множинних молекулярних ¿зоформ ЛДГ та И ензимно! активное^ в субкл1тинних фракщях гепатоцит1в додатково вказують на те, що основним мюцем розташування ензиму у вЫх його ¿зоформах е цитоплазма, але знаходження його ближче до м1тохондрш (1 особливо на !хшх мембранах), суттево впливае на переб1г багатьох бюх1м1чних реакцш, яю катал1зуються дегщрогеназами, очевидно, для забезпечення високо! ефективност1 функцюнування метабол1чних шлях1в у цих компартментах кл1тини I, передус1м, - гл1кол1зу, ЦТК, глюконеогенезу та циклу Кор1 [1 - 7].

Висновки

1. Спектри множинних молекулярних ¿зоформ I актившсть лактатдегщрогенази у цитозоль-мжросомальнш та м1тохондр1альнш фракщях гепатоциив новонароджених телят виявляються р1зними.

2. Хоча ензим локал1зуеться в цитоплазм!, його амейство молекулярних ¿зоформ змшюе ф1зико-х1м1чш властивост1, будову I пщвищуе катал1тичну актившсть у зв'язку з наближенням до окремих субструктур кл1тини 1, зокрема, до мембран м1тохондрш, очевидно, для прискореного забезпечення функцюнування метабол1чних шлях1в у цих компартментах кл1тини I, передуам, - гл1кол1зу, ЦТК, глюконеогенезу та циклу Корг

3. За умов розвитку ал1ментарно! д1аре! у неонатальних телят у цитозоль-мжросомальнш I м1тохондр1альнш фракщях гепатоциив в1рогщно зростае актившсть лактатдегщрогенази.

4. Пщвищення активное^ лактатдегщрогенази у субструктурах гепатоциив новонароджених телят за дп фактор1в д1аре! вщбуваеться за рахунок посиленого бюсинтезу ¿зозиму ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2).

5. За змшами в б1к збшьшення I зниження молярного вщеотку ¿зозиму ЛДГ5 (тетрамер М4 - у2) у субструктурах гепатоциив можна д1агностувати виникнення та стутнь розвитку ал1ментарно! д1аре! у новонароджених телят.

Л1тература

1. Використання лшосом на основ! фосфолшдов молока у гепатологи / Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, В.А. Томчук, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк,

42

С.В. Хижняк, В.М. Войцщький, С.П. Весельський, О.М. Литвиненко // Монограф1я. Пщ загальною редакщею академка НАН та НААН Украши Д.О. Мельничука. - К.: НУБ1ПУ, 2010. - 400 с.

2. Окиснення лактату та локал1защя ЛДГ у субструктурах кл1тини за умов ди екзогенних фактор1в / Калачнюк Л.Г., Басараб I.M., Калачнюк М.С., Кошман О.В., Мельничук С.Д., Мельничук ДО., Калачнюк Г.1. // Наук. вюник ЛНУВМтаБТ im. С.З. Гжицького, Льв1в, 2011. -Т.13, №4(50), 4.2 - С.80-86.

3. Молекулярш ¿зоформи та актившсть лактатдегщрогенази у субструктурах кл1тини за екзогенних фактор1в / Л.Г. Калачнюк, I.M. Басараб, Д.О. Мельничук, С.Д. Мельничук, М.С. Калачнюк, О.В. Кошман, Г.1. Калачнюк // Бюлогштварин - 2011. - Т. 13, № 1-2. - С. 103 - 108.

4. Змши у Ымейств1 ¿зоформ лактатдегщрогенази у структурах кл1тин / О.В. Кошман, М.С. Калачнюк, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк / 66 студентська науково-практична конференцш HHI ветеринарно! медицини та якост1 i безпеки иродукц11 тваринництва: Тези доиов1дей (Ки!в, 5-6 березня 2012 р.). - К.: НУБШ Укра!ни, / Редкол.: В.В. Недосеков (в1ди.ред.) та1н.. - К., 4.1. - 2012. - С. 76.

5. Калачнюк М. Екзогенне шпбування активност1 лактатдег1дрогенази у субструктурах гепатоцит1в неонатальних телят при ал1ментарн1й fliapei / М. Калачнюк, I. Басараб, Г. Калачнюк // Зб1рник тез. VII М1жнародна наукова конференц1я студенев та acnipaHTiB «Молодь i поступ 61олог11» (5-8 кв1тня 2011. Льв1в). Льв1в - 2011. - С. 50 - 51.

6. Биохимия человека (1 и 2 т.) / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В.Родуэл - М.: Мир БИНОМ, Лаборатория знаний. - 2009. - 796 с.

7. Berg J.M. Biochemistry / J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer - New York: W H Freeman. - 2002. - 1515 p.

8. Lodish H. / Purification of Cells and Their Parts / H. Lodish, A. Berk, S.L. Zipursky, et al. // Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W.H. Freeman and Company, 2000. - 1184 p.

9. Wiggert B.O. Multiply molecular forms of malic and lactic dehydrogenases during development / B.O. Wiggert, C.A. Villee // J. Biol. Chem. -1964. - Vol. 239, No. 2. - P. 444 - 451

10. Бюх1м1я тварин з основами ф1зично! та колощно! xiMii' (робочий зошит для студешгв факультету ветеринарно! медицини; 1 частина) / С.Д. Мельничук, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк [та ш.] // Навчальне видання. - Ки!в: НУБШУ, 2012. - 112 с.

43

Summary

L. Kalachnyuk1, I. Basarab1-3, D. Mel'nychuk1, S. Mel'nychuk1, M. Kalachnyuk1, G. Kalachnyuk1,2 1National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Heroyiv

Oborony st. 15, Kyiv 03041, Ukraine 2 L'viv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyi, Pekarska st. 50, L'viv 79010, Ukraine; 3Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, Prague,

Czech Republic

LDH5 (M4 - y2) ISOZYME - KEY MOLECULAR MARKER OF HEPATOCYTES DAMAGES IN THE NEWBORN CALVES UNDER CONDITIONS OF ALIMENTARY DIARRHEA

Results of experimental investigations of five isoforms of lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27): LDH1 (tetramer H4 - a1), LDH2 (tetramer H3M1 - a2), LDH3 (tetramer H2M2 - ft), LDH4 (tetramer H1M3 - y1) and LDH5 (tetramer M4 - y2) in the substructures of hepatocytes in neonatal calves under development of alimentary diarrhea.

It has been shown that spectra of these multiple molecular isoforms and activity of lactate dehydrogenase in the cytosol-microsomal and mitochondrial fractions of hepatocytes are different in neonatal calves. Although the enzyme is localized in the cytoplasm and its family of molecular isoforms alters physical and chemical properties, structure and increases the catalytic activity in connection with the approach to individual substructures of cell, and in particular to the membranes of mitochondria, probably to the accelerated functioning the metabolic pathways and, above all - glycolysis, TCAC, gluconeogenesis and cycle Kori.

Under conditions of alimentary diarrhea in neonatal calves, lactate dehydrogenase activity increases significantly in the cytosol-microsomal and mitochondrial fractions of hepatocytes. The increase of its activity is due to enhanced biosynthesis of molecules of isozyme LDH5 (tetramer M4 - y2). For changes of the isozyme amount in substructures of liver cells, it is possible to do effectively diagnose and stage of development of the alimentary diarrhea in newborn calves.

Key words: lactate dehydrogenase, isoform of LDH5 (tetramer M4 - y2), substructures of hepatocytes neonatal calves, diarrhea.

Рецензент - д.с.-г.н., проф.,чл.-кор.НААНУ Кирил1в Я.1.

44