CC BY
47
УДК 577.112:577.152.1:636.2:616.34
Калачнюк Л.Г., д.б.н., доцент Нацюналънийутверситет ôiopecypcie i природокористування Украти
ВЩНОВЛЕННЯ АКТИВНОСТ1 ЕНЗИМ1В ЦТК У ПОШКОДЖЕНИХ
ГЕПАТОЦИТАХ
Проведено дослгдження aKmuenocmi ernuMie, вгдповгдалъних за початкову i завершалът cmadiï циклу три карбонових кислот (ЦТК) у гепатоцитах пошкоджених факторами порушення mpaenoï системи (ПТС) новонароджених телят за умов традицтного л1кування (ТЛ) i додаткового застосування бюлог1чно активноï добавки у лтосомалънт форм1 (БАД FLP-MD). Показано, що nid впливом споживання новогфосфолтдвмгсног добавки на тл1 ТЛ eiposidno зростае активтстъ першого ензиму початковог cmadiï функцюнування ЦТК - цитратсинтази (CS) у клтинах печтки новонароджених телят з ПТС. Посилення aKmuenocmi CS, очевидно, дае позитивний поштовх до прискорення nodiu всъого потоку перетворенъ npoмiжнux сполук у ЦТК, що тдтверджуетъся значним зростанням aKmuenocmi ензиму иого завершалъног cmadiï - цитохром-с-оксидази (СОХ) та величини cnieeidHorneHrn СОХ: CS.
Встановлено, що за застосування БАД LP FLP-MD спостеркаетъся вiднoвлeння aKmuenocmi eH3UMie ЦТК у пошкоджених гепатоцитах.
Ключов1 слова: цикл трикарбонових кислот, цитратсинтаза, цитохром-с-оксидаза, фосфолШдвмкт комплекси, гепатоцити, неонаталът телята, система травления..
Значш порушення у функцюнуванш реакцш анаеробного гл1кол1тичного шляху i, зокрема, на заключит його стади при утворенш тровиноградно! i молочно1 кислот, були виявлеш у гепатоцитах неонатальних телят за умов порушення травно! системи. Подальш1 дослщження показали, що за цих же умов у кл1тинах печшки в1рогщно знижуеться активнють цитратсинтази (КФ 4.1.3.7), яка катал1зуе початкову стадш функцюнування ЦТК, i, отже, змшюе швидюсть та обсяги утворення в ньому багатьох важливих штермед1ат1в. За умов ПТС також в1рогщно знижуеться i актившсть цитохром-с-оксидази (КФ 1.9.3.1), тобто 1нг1буеться ще заключна стад1я окиснення-в1дновлення електронами молекулярного кисню. Отримаш дан1 дають п1дстави пояснювати таю змши у гл1кол1тичному шляху та в ЦТК дефщитом надходжень поживних речовин i3 шлунково-кишкового тракту, нестачою 61олог1чно активних речовин (БАР) й буд1вельного матер1алу, передус1м, для мембран кл1тин печ1нки та 1нших оргашв травно! системи. Зв1дси випливае потреба у проведенш нових досл1джень, у яких будуть використан1 екзогенн1 регулятори й необх1дн1 джерела компонент1в структурно-функцюнального призначення. Окремий фрагмент таких дослщжень наведено у ц1й статт1.
©Калачнюк Л., 2013
92
Матер1али i методи. Для дослщження використовували 1-7-добових новонароджених телят, яких за принципом аналопв (р1внозначш за в1ком, породою, статтю, вагою) роздшяли на дв1 групи (n=5) з масою тша 28-36 кг. Телята першо! (I, контрольно! або К) групи були з порушеннями травно! ситеми ал1ментарного походження i пщдавалися традицшному лшуванню, а друго! (II, дослщно! або Д) - i3 такими ж ПТС та ТЛ, але додатково одержували per os фосфолшщвмюну бюлопчно активну добавку в лшосомальнш форм1 - БАД LP FLP-MD у доз1 10-20 мг / кг живо! маси упродовж 10-15 дшв шсля народження тварин. Про склад i характеристику вказано! добавки було описано у попередшх роботах [1-9].
Актившсть CS i СОХ визначали за загальноприйнятими методами [11, 12]. Актившсть CS у оброблених ультразвуком гомогенатах печшки визначали шляхом вим1рювання початково! швидкост1 (V0) реакц1! при 412 нм за методом ф1ксац1! ДТНБ-5,5,-дит1об1с (2-штробензоату) [11]. Реакц1йна сум1ш м1стила 0,2 мМ ДТНБ, 50 мкМ ацетил-КоА, 100 мМ Tpic-HCl (рН 8,1), 100 мкМ оксалоацетату, об'ем проби становив 1 мл. Реакц1ю проводили при 25 °С й шщшвали И додаванням оксалоацетату.
Активн1сть СОХ вим1рювали у заморожено-розморожених оброблених ультразвуком гомогенатах при 25 °С згщно з методикою [12] ¿з 90 мкМ в1дновленого цитохрому с як субстрату i 50 мМ К2НР04 (рН 7,4). Початкову швидк1сть обчислювали за формулою V0=k-[S], у якш стала першого порядку k була визначена експериментально; концентрац1я субстрату [S] становила 90 мкМ. За одиницю активност1 CS i COX прийнято ту к1льк1сть ензиму, яка за умов експерименту катал1зувала вид1лення 1 мкмоля коензиму А або окиснення 1 мкмоля цитохрому с вщповщно за 1 хв при 25 °С. Питом1 активност1 виражено в одиницях на 1 г тканини сиро! маси (U/r сиро! тканини).
Вмют б1лка визначали за Лоур1 та ¿н. [10] з використанням у якост1 стандарту альбум1ну сироватки кров1 бика. Статистичне опрацювання отриманих цифрових даних виконували за допомогою програми Microcal Origin (Version: 5,0) з використанням критерАю Стюдента «t».
Результати i обговорення. Отримаш результата наведено на рис. 1 -3.
3.58±0.24"
%
115
110
105
100
95
90
113
100
■
Рис. 1. Актившсть CS [u/r сиро¥ тканини (А) ¡в % (Б)] у клггинах печшки новонароджених телят за умов ПТС i ТЛ (К), а також з додатковим використанням БАД LP FLP-MD (Д) (M±m; n=5); *Р<0,05 в1рог1дн1сть у nopißHHHHi з К.
93
1з даних рис. 1 видно, що в новонароджених телят за умов ПТС при ТЛ та додатковому використанш БАД FLP-MD (Д) актившсть CS зростае на 0,41 и/г сиро! тканини (А) або на 13 % (Б).
66,51±4,24"
44,63±3,42
Щ
%
160 140 120 100 30 60 40 20 0
149
100
К Д
Рис. 2. Актившсть СОХ [u/r сиро¥ тканини (А) ¡в % (Б)] у кштинах печшки новонароджених телят за умов ПТС i ТЛ (К), а також з додатковим використанням БАД LP FLP-MD (Д) (M±m; n=5); *Р<0,001 в1рогщшсть у nopiBHHHHi з К.
132
18,58
100
140 120 100 % 80 60 40 20 0
К Д
Рис. 3. Величини сшввщношень активностей COX:CS [u/r сиро¥ тканини (А) ¡в % (Б)] у кштинах иечшки залежно ввд способу лжування новонароджених телят за умов ПТС i ТЛ, а також з додатковим використанням БАД FLP-MD (Д).
За вказаних умов актившсть СОХ (рис. 2) також зростае, але ще бшьше (майже на 50 %). Залежно вщ способу л1кування суттево зм1нюються i величини сшввщношення активностей ензим1в COX:CS (рис. 3). Виявлеш зм1ни ч1тко вказують на значну стимулюючу д1ю 61олог1чно активно! добавки LP FLP-MD щодо активност1 ключових ензим1в ЦТК. Передус1м наведен! результата свщчать про в!рог!дну активацш початково! реакц!! циклу, тобто про посилення процесу конденсац!! ацетил-КоА ¿з щавлево-оцтовою кислотою. I це безумовно сприяе зб!льшенню продукцй' цитрату та утворенню наступних ¿нтермед!ат!в. Такий висновок п!дтверджуеться в!рог!дним зростанням активност! СОХ, що вщдзеркалюе посилення всього потоку перетворень у ЦТК. Адже цей ензим разом з 02 е к!нцевим пунктом доставки електрошв, як! надходять вщ окиснення поживних речовин. BiH також спрямовуе транспорт npoTOHiß через внутршню мембрану. Отже, цей ензимний комплекс здшснюе заключну стад!ю б!олог!чного окиснення-вщновлення електронами
94
молекулярного кисню. Взагал1 функци ензим1в циклу трикарбонових кислот залежать вщ багатьох фактор1в i, зокрема, вщ обсяпв окиснення жирних кислот (ЖК) та цшсност1 внутршшх i зовшшшх мембран гепатоцит1в. Очевидно, використання екзогенних фосфолшщвм1сних комплекав i ессенщальних ЖК та в1тамшу Е, яю е у !хньому склад1, суттево сприяе вщновленню активное^ ензим1в ЦТК иошкоджених кл1тин печшки новонароджених телят з виразними ироявами ПТС.
Внсновкн:
1. Виявлено, що пщ впливом сиоживання БАД LP FLP-MD в1рогщно зростае актившсть першого ензиму в функцюнуванш ЦТК (цитратсинтази) у кл1тинах печшки новонароджених телят з порушеннями травно! системи
2. Посилення активное^ CS, очевидно, дае позитивний поштовх до ирискорення подш всього потоку перетворень у ЦТК, на що вказуе значне зростання активное^ СОХ та величини сшввщношення СОХ : CS.
3. Встановлено, що застосування БАД LP FLP-MD дозволяе вщновлювати актившсть ензим1в ЦТК у пошкоджених гепатоцитах.
Л1тература
1. Активн1сть м1тохондр1альних ензим1в у pa3i порушень лшщного метабол1зму в гепатоцитах / Л. Калачнюк, Д. Мельничук, Г. Калачнюк // В1сник Льв1вського ун1верситету. Сер1яБ1ол. 2005. - Вип. 39. - C.40-46.
2. Молекулярш ¿зоформи та актившеть лактатдег1дрогенази у субструктурах кл1тини за дп екзогенних фактор1в / Л.Т.Калачнюк, I.M. Басараб, Д О. Мельничук [таш.] // Б1олог1я тварин. - 2011. - Т. 13, № 1-2. - С. 103 - 108.
3. Роль юнцево! реакци анаеробного гл1кол1зу в молекулярних механ1змах регуляци обм1нних процес1в у гепатоцитах неонатальних телят за fliapei' / М.С. Калачнюк, I.M. Басараб, Л.Т. Калачнюк [та ш.] // Б1олог1я тварин. - 2012. - Т.14, № 1-2. - С. 121-127.
4. Окиснення лактату та локал1зац1я ЛДГ у субструктурах кл1тини за умов дп екзогенних фактор1в / Л.Т.Калачнюк, I.M. Басараб, Д. О. Мельничук [та iH.] // Науковий в!сник ЛНУВМтаБТ ¿м. С.З. Гжицького, 2011. -Т.13, №4(50), 4.2 - С.80-86.
5. 1зозим ЛДТ5(М4 - у2) - ключовий молекулярний маркер пошкоджень субструктур гепатоципв у новонароджених телят за ал1ментарно! fliapei / Л.Т.Калачнюк, I.M. Басараб, Д.О. Мельничук [та ¿н.] // Науковий в1сник ЛНУВМтаБТ im. С.З. Гжицького, 2012. Т. 14, № 2 (52), Ч. 2- С.39 - 44.
6. Biochemistry / J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. - New York, W H Freeman Publ., 2002. - 1515 p.
7. Peculiarities of molecular-structural changes in lipid components of hepatocytes in neonatal calves with enteropatologies / L. Kalachnyuk, D. Mel'nychuk, G. Kalachnyuk // Abstract book, First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Lviv, April 25-28, 2004. - P.271.
8. Регулящя метабол1зму жирних кислот та шших лшщних сполук у жуйних тварин / Л.Г. Калачнюк, Д.О. Мельничук, Г.1. Калачнюк // Укр. 6ioxiM. журн. - 2007. - Т. 79, № 1. - С. 22-45.
9. Використання лшосом на основ! фосфолшвдв молока у гепатологи / Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, В.А. Томчук, Л.Г. Калачнюк, Г.1. Калачнюк
95
[та ¿н.] // Монограф ¿я. Пщ загальною редакщею академка НАНУ та НААНУ Д О. Мельничука. - К., 2010. - 428 с.
10. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbroudh, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, no. 1. - P. 265-275.
11. Citrate synthase from rat liver / D. Shepherd, P.B. Garland // Meth. Enzymol. - 1969. - Vol. 13. - P. 11-13.
12. A study of the kinetics of the oxidation of cytochrome-c by cytochrome-c oxidase / L. Smith, H. Conrade // Arch. Biochem. Biophys. - 1956. - Vol. 63. - P. 403-413.
Summary L. Kalachnyuk
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Heroyiv Oborony
st. 15, Kyiv 03041, Ukraine RECOVERY OF THE TCA CYCLE ENZYMES ACTIVITY IN DAMAGED
HEPATOCYTES
It has been performed research of activity of the enzymes which are responsible for the initial and final stages of the tricarboxylic acid (TCA) cycle in hepatocytes damaged by factors of breach of the digestive system (BDS) in newborn calves under conditions of conventional treatment (CT) and the additional use of dietary supplements.
It has been shown that under the influence of consumption of the phospholipid-containing additives in liposomal form at the shadow of CT, activity of the first enzyme of the initial stage of functioning the TCA cycle - citrate synthase (CS) in the liver cells of newborn calves with BDS. Obviously, increase of CS activity gives a positive impetus to accelerate the flow of events of all transformations of intermediates in the TCA cycle, as evidenced by a significant increase in enzyme activity of its final stage - cytochrome-c oxidase (COX) and the value of the ratio of COX: CS.
Found that under conditions of the use of dietary supplements LP FLP-MD, it is observed restore of activity of enzymes of the TCA cycle in the damaged hepatocytes.
Key words: the tricarboxylic acid cycle, citrate synthase, cytochrome-c oxidase, the phospholipid-containing additives, hepatocytes, newborn calves, the digestive system.
Рецензент - д.с.-г.н., професор, чл.-кор. НААН Украши Кирил1в Я.1.
96
