CC BY
19
3УДК 577.112:577.122:579.222
Калачнюк М.С.1, студент Мельничук Д.О. 1, д.б.н., професор, академк НАНУ i НААНУ, Калачнюк Л.Г.1 д.б.н., доцент; Мароунек M. 2д.б.н., професор Савка О.Г. 2, к.б.н.
Калачнюк Г.1.1 2, д.б.н., професор 1 Нацюнальнииутверситет 6iopecypcie i природокористування Украгни 21нститутфгзгологШ генетикитварин ЧесъкогАН, Прага, ЧеськаРеспублгка
ЕНЗИМНА АКТИВН1СТЬ КЛ1ТИН ОКРЕМИХ М1КРООРГАН13М1В-СИМБЮНТ1В РУБЦЯ ЗА ДИ ЕКЗОГЕННИХ ЧИННИК1В
Проведено досл\дження ензимног aKmuenocmi клтин окремих м1крооргашзм1в-симбюнт1в за умов токсично! dii найбыъш поширеного в довюллi бюциду - пентахлорфенолу (ПХФ) та протекторноi 3damnocmi природного сорбенту - клтоптилолту, поклади якого тыъки у 3aKapnammi перевищуютъ 1 млрд. тонн.
Показано, що клтини чистих рубцевих rnmaMie (Butyrivibrio fibrisolvens, Streptococcus bovis i Megasphaera elsdenii) за активтстю семи ключових внутршнъоклтинних ernuMie чтко в1др1зняютъся м1ж собою. За dii навтъ малог дози ПХФ (40 мкМ) актившстъ дослгджуваних ernuMie eiposidno знижуетъся у клтинах дуже чутливог до бгоциду бактерИ B. fibrisolvens. У клтинах менш чутливих до токсиканту rnmaMie бактерт (S. bovis i M. elsdenii) актившстъ ecix ernuMie eiposidno зменшуетъся тыъки за впливу у 2,5 раза вищог ПХФ. Додавання клтоптилолту до ткубацтного бактер1алъного середовища з пентахлорфенолом у вищевказаних дозах eiposidno тдвищуе ензимну актившстъ у клтинах ycix дослгджуваних чистих rnmaMie мтрооргашзм1в-симбюнт1врубця.
Ключовг слова: енутршнъоклтинш ензими, 4ucmi штами мтрооргашзм1в рубця, бюциди, пентахлорфенол, природт сорбенти, клтоптилолт.
Рашше [1-7] зверталась увага на те, що вщносна постшшсть обмшу речовин у рубщ пщтримуеться багатьма факторами i вона спрямована передуам на ефективну реал1зацш симбютичних взаемовщносин оргашзму жуйно! тварини з мкрооргашзмами, що заселяють И передшлунки i весь травний тракт. Вартують окремо! уваги результати вивчення тканинного метабол1зму тварини-господаря i, зокрема, взаемозв'язуючо! рол1 слизово! оболонки рубця [4, 5]. Потребуе ретельного анал1зу шформащя про особливосп метабол1чно! активное^ мжробно! екосистеми, створено! багатьма видами бактерш, протозоа i грибюв [1-3 ]. При цьому слщ завжди враховувати, що рубцеве середовище е анаеробним i редукуючим [ 2, 3]. Кисень сюди потрапляе
© Калачнюк М., Мельничук Д., Калачнюк Л., Мароунек М., Савка О., Калачнюк Г., 2013
314
тшьки з кормами та i3 кровг Факультативными анаеробами рщини чи адгерованими на слизовш оболонщ рубця вш швидко утил1зуеться [1]. Також варто зазначити, що життед1яльшсть р1зних м1крооргашзм1в травного тракту пщтримуеться певною величиною редокс-потенщалу (Eh) i pH та багатьма шшими екзо- i ендогенними чинниками [1-3].
Одшею i3 екзогенних дуже токсичних речовин у довкшл1 вважаеться пентахлорфенол (ПХФ) i саме тому Агентство захисту навколишнього середовища у кшщ XX стол1ття занесло його до списку найнебезпечшших забруднювач1в природи [6, 8, 9]. Шсля цього було розпочато штенсивне вивчення ди ПХФ на Bei ланки екобюсистеми, в тому числ1 i на стан здоров'я людини й тварин та на пошук реальних можливостей деградацп його мкрооргашзмами [6, 8, 9].
Метою ще! роботи було показати дш бюциду (ПХФ) на ензимну актившсть кл1тин окремих м1крооргашзм1в-симбюнт1в рубця i протекторну здатшсть природного сорбенту (клшоптилол1ту), поклади якого тшьки у Закарпатп складають понад 1 млрд. тонн [6, 10-12].
Матер1али i методи. За об'ект дослщжень правили чист1 штами рубцевих бактерш. Найбшьше уваги було зосереджено на Butyrivibrio fibrisolvens 787, що утил1зуе целюлозу, глюкозу, ксилозу тощо; Streptococcus bovis AO 24/85, що використовуе крохмаль та rnmi вуглеводи, а також Megasphaera elsdenii LC8, що засвоюе лактат та rnmi штермед1ати мкробно! ферментаци. Штами бактерш одержували i3 1нституту ф1зюлогп i генетики тварин Чесько! АН (Praha), 1нституту ф1зюлогп тварин Словацько! АН (Kosice), Роветського науково-дослщного шституту (Aberden, United Kingdom). Зазначеш штами вирощували на середовищ1 М-10 з деякими модифжащями. Окр1м того, до середовища для M. elsdenii додавали лактат натрш (до кшцево! концентрацп 0,8%) i тюглколеву кислоту (до 0,3%).
Вивчення дй ПХФ на юнетику росту чистих штам1в проводили за умов ix шкубаци у середовищах i3 додаванням шактивовано! (105оС - 1 год) безбактершно! рубцево! рщини (5000 об/хв. - 30 хв), одержано! вщ тварин, що по!дали високий р1вень легкодоступних поживних речовин i целюлози. Для оцшки дй' ПХФ створювали три вар1анти шкубацш: I- контрольний, К (культуральне середовище 3i змшаною рубцевою мкробною популящею без добавок ПХФ), дослщш: II - у культуральне середовище яких добавляли ПХФ у концентрациях 40 мкМ (для B. fibrisolvens 787) або 100 мкМ (для S. bovis i M. elsdenii) i III - К + ПХФ + 3 г/пробу Кл [6]. Дш ПХФ на актившсть внутршньокл1тинних ензим1в бактерш вивчали теля 24 год шкубацп за експоненщально! (логарифм1чно!) фази росту. Кл1тини збирали за допомогою центруфугування (5000 об/хв., 30 хв при 4°С). 3i6paHi кл1тини дв1ч1 промивали 20 мМ K-Na-фосфатним буфером (pH 7,5). Концентрацш кл1тин доводили до 1 мг/мл i заморожували, додаючи до суспензи 1/3 об'ему скла (nicKy). Руйнування кл1тин проводили на холод1 (4°С) з використанням планетарного в1братора К-23 (Имеччина) при 1000 об/хв. протягом 6 хв., або ж ультразвуковою дезштегращею кл1тин при 22 кГц протягом 15 хв з штервалом 30 сек при 0-2°С
315
на диспергатор1 УЗДН-1. За температури 2-4°С шляхом центрифугування (18 000 об/хв., 30 хв) одержували цитоплазматично-мкросомальну фракцш бактер1альних кл1тин. У нш визначали вмкт бшка (за Лоур1 та cniß.) i актившсть ензим1в: лактатдегщрогенази (ЕС 1.1.1.27), малатдегщрогенази (ЕС 1.1.1.37), ¿зоцитратдегщрогенази (ЕС 1.1.1.42), малк-ензиму (ЕС 1.1.1.40), форм1атдегщрогенази (ЕС 1.2.1.2), акоштази (ЕС 4.2.1.3) i фумарази (ЕС 4.2.1.2). Актившсть перших п'яти ензим1в визначали спектрофотометрично i виражали у нмоль NADH/NADPH за 1 хв на 1 мг бшка. Методи визначення активносп Bcix ензим1в та шших бюх1м1чних показниюв описано рашше [2, 3, 6-9]. Bei 6ioxiMi4Hi анал1зи проводили у п'яти повторениях. Одержаний цифровий матер1ал опрацьовували статистично з використанням критерш Стьюдента «t».
Результати i обговорення. Одержан! результата наведено на рис. 1 -3. За дй пор1вняно низько! дози бюциду пентахлорфенолу (40 мкМ), актившсть yeix дослщжуваних ензим1в у кл1тинах B. fibrisolvens знижуеться в1рогщно i переважно в 3 - 6 раз1в (рис. 1). Найчутлившими ензимами до дй' токсиканта виявилися малатдегщрогеназа й фумараза. Форм1атдегщрогеназа, малкензим i лактатдегщрогеназа е менш чутливими за попередш ензими, а акоштаза й ¿зоцитратдегщрогеназа е пор1вняно найменш чутливими. Додавання клшоптилол1ту до культурального середовища в1рогщно пщвищуе актившсть yeix ензим1в. Очевидно, природний сорбент не здатний повшетю вщновити попередш piBHi активное^ ензим1в i р1знищ, пор1вняно з контролем, залишалися ще в1рогщно значними.
Внутршньокл1тинш ензими амшол1тичного штаму S.bovis (рис. 2) виявилися значно стшюшими до дй бюциду. Вони в1рогщно знижували cboi активност!, але не такою високою м1рою як у кл1тинах целюлозо- i пектинол1тично! бактери B. fibrisolvens. Необхщно тут додати те, що в експериментах, за яких вивчався вплив пентахлорфенолу на актившсть ензим1в у кл1тинах S. bovis, доза його була в 2,5 раза вищою (100 - проти 40 мкМ), а за умов внесения клшоптилол1ту в культуральне середовище з ПХФ спостеркаеться на 12 - 30% пщвищення 1хньо! активности У цшому, актившсть yeix ензим1в наближалася майже до р1вня контролю завдяки вщносно вищо! антитоксично! стшкост1 бактерш S. bovis та протекторно! здатност1 доданого сорбенту. Як видно i3 експериментальних даних, р1знищ у вщмшностях ензимних активностей, пор1вняно з контролем, залишаються лише в межах (15 - 48 %), тод1 як для B. fibrisolvens вони е вищими (50 - 80%).
316
Рис. 1. Д1я пентахлорфенолу та клтоптилолту на актившсть внутр1шньоклггинних ензшупв Butyrivibrio fibrisolvens 787 (M ± m; n=5; I-контроль, К; II - К + 40 мкмоль ПХФ; Ш - К + 40 мкмоль ПХФ + 3 г/пробу Кл; 1- лактатдегщрогеназа, 2 - акоштаза, 3- ¿зоцитратдегщрогеназа, 4 - фумараза, 5 -
малатдегщрогеназа, 6 - малкензим, 7 - форм1атдегщрогеназа). %
■ I
■ II
□ III
100
so
60
40
20
Рис. 2. Д1я пентахлорфенолу та клтоптилолту на актившсть внутршньокштинних ензим1в Streptococcus bovis AO 24/85 (M ± m; n=5; I -контроль, К; II - К + 40 мкмоль ПХФ; III - К + 100 мкмоль ПХФ + 3 г/пробу Кл; 1- лактатдегщрогеназа, 2 - акоштаза, 3- ¿зоцитратдегщрогеназа, 4 - фумараза, 5 -малатдегщрогеназа, 6 - малкензим, 7 - форм1атдегщрогеназа).
317
Згщно з даними рис. 3 кл1тини M. elsdenii ще менше реагували на токсичну дш пентахлорфенолу. За винятком акоштази, яка пщ д1ею токсиканта (за дози його 100 мкМ) знижувала свою актившсть на 42 %, решта ензим1в знижували свою катал1зуючу здатшсть переважно на 25 - 30 %. Можливо, що внутршньокл1тинш ензими, як1 функцюнують майже на piBHi штактних кл1тин, достатньою м1рою захищаються сорбуючою здатшстю клшоптилол1ту. Передуам, це стосуеться лактатдегщрогенази, актившсть яко! пщ д1ею ПХФ знижуеться лише на 27% пор1вняно з контролем, а в присутност1 сорбенту зростае на 22 %, тобто вщновлюеться майже до р1вня активное^ контрольного вар1анту. При анал1з1 зрушень активное^ малатдегщрогенази вщм1чаються под1бш змши за ди токсиканта й сорбенту, тод1 як решта ензим1в змшюють cboï активност! майже в таких межах, як внутршньокл1тинш ензимш системи B. fibrisolvens та S. bovis.
Рашше було виявлено, що кл1тини M. elsdenii мають найвищу стшкють до токсично! ди пщвищених доз пентахлорфенолу. Наведен! на рис. 1-3 даш узгоджуються i3 результатами дослщжень щодо визначення р1вшв кшцевих продукт1в ферментаци дослщжуваних чистих штам1в, а також з кшетикою ïx росту [9]. Стосовно анал1зу окремих ензим1в слщ вщм1тити, що актив Hi сть лактатдегщрогенази (рис. 1_3) е в декщька раз1в нижчою в клтинах B. fibrisolvens, пор1вняно i3 S. bovis та M. elsdenii. Це, мабуть, вказуе на р1зну штенсившсть вщновлення в них трувату до лактату.
Враховуючи те, що в таких лактатутил1зуючих бактерш, як M. elsdenii метабол1зм спрямований у протилежний бк [1, 7], то можна стверджувати, що перетворення лактату в шруват (зворотна лактатдегщрогеназна реакщя) вщбуваеться на дуже високому piBHi в клтинах ще! бактери.
Внесения в культуральне середовище 100 мкМ ПХФ, критично! в ф1зюлопчному д1апазош кшькоси бюциду [9]), спричинюе неоднозначний вплив на реакцш останього етапу глкол1зу нав1ть у таких пор1вняно високостшких бактерш, як S. bovis i M. elsdenii, a добавки клшоптилол1ту за паралельно! ди ПХФ пщвищують актившсть лактатдегщрогенази у кл1тинах B. fibrisolvens на 41, 5 %, у клтинах S. bovis - на 29,8 % i в M. elsdenii - на 5,6 %, хоча дають р1зний кшцевий ефект, зважаючи на загальш об'еми виконано! ензимом роботи пор1внюваних штам1в р1зних бактерш. Отже, клшоптилол1т посилюе лактогенез, правда р1зною м1рою, як у лактатутворюючих, так i лактатутил1зуючих бактерш. У цщому, на Bei види бактер1ального комплексу рубця вплив клшоптилол1ту е позитивним, що вщм1чалось i при вивченш дп сорбенту на загальну популяцш рубцевих мкрооргашзм1в-симбюнт1в [4, 6, 1012].
318
Рис. 3. Д1я пентахлорфенолу та клшоптилолггу на актившсть внутршньокштинних ензшупв Megasphaera elsdenii LC8 за умов впливу (M
± m; n=5; I -контроль, К; II - К + 40 мкмоль ПХФ; III - К + 100 мкмоль ПХФ + 3 г/пробу Кл; 1- лактатдегщрогеназа, 2 - акоштаза, 3- ¿зоцитратдегщрогеназа, 4 -фумараза, 5 - малатдегщрогеназа, 6 - малкензим, 7 - форм1атдегщрогеназа).
Оскшьки форм1ат е кшцевим продуктом метабол1зму лактатутворюючих i лактатутил1зуючих бактерш, то репрешя й дерепрешя його синтезу, в тому числ1 й актившсть NAD-залежно! форм!атдегщрогенази, може вщповщно послаблюватися д1ею ПХФ i частково вщновлюватися з допомогою клшоптилол1ту. Ця реакщя вважаеться одшею з найхарактершших при вивченш особливостей метабол1зму в кл1тинах р1зних вцщв бактерш [1, 6, 7].
За оцшки ензимно! здатност! акоштази, яка забезпечуе досягнення р1вноваги в цикл! трикарбонових кислот (зокрема вщповщно! кшькост! цитрату, умс-акоштату та ¿зоцитрату), було вщм1чено, що вона у B. fibrisolvens е найчутлившою до дй ПХФ, оскшьки И актившсть у ще! бактерй зменшуеться утрич1, а в S. bovis i M. elsdenii - майже у 2 рази. Клшоптилол1товий захист акоштази вщ токсично! дй ПХФ у дослщжуваних кл!тинах бактерш вщповщно складае ~ 47; 29 i 22 %, але теля врахування неоднакових вих!дних р!вн!в !! активност! в цих м!кроорган!зм!в загальна протекц!я ензиму в них сорбентом стае вщповщно такою 41,6; 78,1 i 71,2%.
Завдяки сорбуючим та шшим властивостям кл!ноптилол!т здатний суттево захищати функцй акон!тази у кл!тинах досл!джуваних штам!в рубцевих бактер!й, особливо в амшол!тичних р!зновидах, як! переважають у бактер!альному комплекс!, сформованому на концентратнш д!ет!. Одночасно в такою ж м!рою сорбентом захищаються i так! гра-м-негативш бактерй, як M. elsdenii, як! синтрофно сп!в!снують з ам!лол!тичними (S. bovis).
319
Якщо окиснення ¿зоцитрату до а-кетоглутарату у кл1тинах дослщжуваних бактерш контрольних BapiaHTiB знаходиться на однаковому piBHi, то за впливу пентахлорфенолу ця реакщя шпбуеться неоднаково: у B. fibrisolvens бшьше, шж у 2 рази, у S. bovis - на 36,4 % i у M. elsdenii - на 30,1 %. Внесения клшоптилол1ту в культуральнне середовище пщвищуе актившсть ¿зоцитратдегщрогенази у кл1тинах B. fibrisolvens на 36 %, у S. bovis - на 24,2 i M. elsdenii - на 22,2 %. Отже, сорбентом здшснюеться вщповщна регуляторна роль, що ч1тко вщм1чаеться за в1рогщного впливу його на вищевказаний етап перетворень, яким л1м1туеться швидюсть цшого циклу трикарбонових кислот.
Оскшьки з допомогою фумарази катал1зуеться гщратащя фумарово! кислоти з утворенням L-малату, то актившсть шранс-приеднання Н+ i ОН- до подвшного зв'язку фумарату в B. fibrisolvens була значно нижчою, шж у S. bovis та M. elsdenii. Пентахлорфенол понижуе актившсть цього ензиму в 5 раз1в у клп-инах B. fibrisolvens, на 25,7 % - в S. bovis i на 21,2 % у M. elsdenii, а доданий у середовище з ПХФ клшоптилол1т пщвищуе И у кл1тинах цих штам1в вщповщно на 44,3 %, на 15,2 % i на 16,7%.
Дослщжуваш кл1тини бактерш мають своерщш особливост1 й меж1 вщхилень на цьому eTani метабол1зму. Аналопчна картина спостеркаеться з останньою реакщею циклу трикарбонових кислот - окиснення L-малату до оксалоацетату: у B. fibrisolvens L-малатдегщрогеназна актившсть е майже у 7 раз1в нижчою, шж у S. bovis i ~ в 4 рази, шж у M. elsdenii. За дй ПХФ вона шпбуеться найбшьше в першого бактер1ального штаму (у 7 раз1в) i тшьки на 24,4 % та на 20,6 % вщповщно у двох шших.
Практично под1бш змши спостеркаються i при анал1з1 змш р1вня активност! оборотно! анаплеротично! реакцй (L-малат + NADP+ ^ шруват + С02 + NADPH + Н+, катал1зовано! малатдегщрогеназою декарбоксилюючою -малжензимом), за рахунок яко! метабол1чна система поповнюеться енерпею й важливими штермед1тами. Важливо вщм1тити те, що малжензим взагал1 мае найнижчу актившсть у B. fibrisolvens, тод1 як вона е вищою в 4 рази у S. bovis i майже в 15 раз1в - у M. elsdenii. Малатдегщрогеназа декарбоксилююча, за нашими спостереженнями, е найчутлившим ензимом до впливу ПХФ у кл1тинах B. fibrisolvens. Актившсть й у цих бактер1альних кл1тинах знижуеться токсикантом бшьше, шж у 4 рази, а в S. bovis - на 31,9 % iß M. elsdenii - на 22,8%. При внесенш в середовище з ПХФ клшоптилол1ту актившсть малкензиму в кл1тинах дослщжуваних бактерш (B. fibrisolvens, S. bovis, M. elsdenii) зростае вщповщно на 47,6 %; 26,1 % i 16,4 %.
Вищенаведеш експериментальш даш, разом з шшими, вказують на досить велику р1зномаштшсть функцюнування ензимних систем у кл1тинах р1зних вид1в бактерш, яю в комплекс! з шшими мкрооргашзмами створюють загальний мкробний комплекс рубця, що за значениям виконано! роботи може прир1внюватися до окремого, своерщно важливого органу травления у жуйно! тварини [4-7]. 1з наведених результата також видно, що окрем1 бактерй цшого м1кробного комплексу, хоч i виконують кожна свою звичайну роль, але в
320
загальному, беруть ще й своерщну участь у процесах зниження р1вня токсично! ди ПХФ. У бюлопчному [6, 11] та практичному аспектах [10-12] у цьому процес! суттеву позитивну роль може вдагравати також i застосування природного сорбенту - клтоптилолту.
На даний час мехашзм бюлопчно! ди одного з найбщьш поширених бюццщв - пентахлорфенолу залишаеться невщомим. Враховуючи проблеми, що виникають теля забруднення навколишнього середовища такими токсикантами, як ПХФ, особливий штерес викликають Bei аспекти !хньо! бюлопчно! ди в шлунково-кишковому тракт! i передуЫм у тих вщдщах, яю густо заселен! м!кроорган!змами-симб!онтами. Адже можна було передбачати, що певна частка токсичност! б!оцид!в мала би знешкоджуватися м!кроорган!змами-симб!онтами. У зв'язку з цим досл!дження б!оцидно! ди ПХФ на змшаш м!кробн! популяцй, асощацп р!зновид!в та кл!тин окремих чистих штам!в е важливими i необхщними. Поряд з цим нев!домою залишаеться роль сорбенту (клтоптилолту) в процесах захисту внутр!шньокл!тинного метабол!зму в чистих штам!в рубцевих бактер!й за умов токсично! ди ПХФ. Одержан! нами експериментальш дан!, на наш погляд, мають певне п!знавальне, науково-теоретичне й практичне значения.
Висновки.
1. Вивчалася ензимна активн!сть кл!тин окремих м!крооргашзм!в-симб!онт!в за умов токсично! ди найб!льш поширеного в довк!лл! бюциду -пентахлорфенолу (ПХФ) та протекторно! здатност! природного сорбенту -клшоптилол!ту, поклади якого т!льки у Закарпатп перевищують 1 млрд. тонн.
2. За актившстю семи ключових внутр!шньокл!тинних ензим!в ч!тко в!др!зняються м!ж собою кл!тини чистих рубцевих штам!в (Butyrivibrio fibrisolvens, Streptococcus bovis i Megasphaera elsdenii).
3. У клтинах дуже чутливо! до б!оциду бактерй B. fibrisolvens актившсть дослщжуваних ензим!в в!рогщно знижуеться за ди нав!ть мало! дози ПХФ (40 мкМ).
4. Актившсть Bcix ензим!в в!рог!дно зменшуеться у кл!тинах, менш чутливих до токсиканту штам!в бактер!й (S. bovis i M. elsdenii), тщьки за впливу у 2,5 раза вищо! ПХФ.
5. Ензимну актив Hi сть у клтинах ycix досл!джуваних чистих штам!в м!кроорган!зм!в-симб!онт!в рубця в!рог!дно п!двищуе додавання кл!ноптилол!ту до шкубацшного бактер!ального середовища з пентахлорфенолом у вищевказаних дозах.
Л1тература
1. Stewart C.S. The rumen bacteria / C.S. Stewart, M.P. Bryant // The rumen microbial ecosystem. - [Rd. P.N. Hobson]. - London-New York, 1988. - P. 21-75/
2. Marounek M. Dynamics of the redox-potential and rH in the rumen fluid of goats / M. Marounek, S. Bartos, G. I. Kalachnyuk // Physiol bohemslov. - 1982. -Vol. 31, № 4. - P. 369-374.
321
3. Калачнюк Г. I. Метабол1зм бактерш рубця за ди зовшшньокл1тинного редокс-потенщалу / Г. I. Калачнюк, М. Мароунек, Л. Г. Калачнюк, О. Г. Савка // Укр. 6ioxiM. журн. - 1994. - Т. 66, № 1. - С. 30-41.
4. Калачнюк Г.1. Симбюз i бютехнолопчш основи пщвищення продуктивное^ тварин / Г.1. Калачнюк // Науковий вюник ЛДАВМ ¿м. С.З. Гжицького. - 2000. - Т.2, №2, 4.2. - С. 104-112.
5. Kmet' V. Rumen ecosystem manipulation of calves and lambs by microbial preparation / V. Kmet', M. Baran, G.I. Kalachnyuk // Oplyvnovanie bachoroveho ekosystemu teliat a jahniat mikrobialnymi preparatami / [ed. K. Bod'a]. - Bratislava: Veda, 1990. - 112 p.
6. Калачнюк Л.Г. Молекулярш аспекти екзогенно! регуляци метабол1зму у клтинах м!крооргашзм!в-симбюнт1в та тварини господаря : автореф. дис. на здобут. наук. ступ. докт. бюл. наук : спец. 03.00.04 "Бюх1м1я" / Л.Г. Калачнюк. - Кшв, 2009. - 40 с.
7. Калачнюк Г.1. Метабол1зм форм1ату за дп лактатпродукуючих i лактатутил1зуючих бактер1й рубця / Г.1. Калачнюк, О.А. Войтюк, О.Г. Савка // Укр. 6ioxiM. журн. - 1994. - Т. 66, № 4. - С. 43 - 51.
8. Yokoyama M.T. Sensitivity of ruminal microorganisms to pentachlorophenol / M.T. Yokoyama, K.A. Johnson, J. Gierzak // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - Vol. 54, № 11. - P. 2619-2624.
9. Метабол1зм мшробних популяцш рубця, сформованих на бюсубстратах i3 р1зною доступшстю, за дп пентахлорфенолу / Л.Г. Калачнюк, О.С. Возна, Г.1. Калачнюк [та ш] // Укр. 6ioxiM. журн. - 2002. -Т. 74, № 3. - С. 31-41.
10. Грабовенский И.И. Цеолиты и бентониты в животноводстве / И.И. Грабовенский, Г.И. Калачнюк. - Ужгород: Карпаты, 1984. - 72 с.
11. Калачнюк Г.И. Физиолого-биохимическое и практическое обоснование скармливания цеолитов / Г.И. Калачнюк // Вестник с.-х. науки. -Москва: Колос, 1990. - № 3. - С. 56-64.
12. Биотехнологические основы эффективных кормо сочетаний с сорбентами / Г.И. Калачнюк, Ю.Н. Лыцур, О.Г. Савка [и др.] // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: 3-я междунар. конф. Россия, 2000 г.: тез. докл. - Россия, Боровск, 2000. - С.94-95.
322
