CC BY
49
УДК 547.972
СТИЛЬБЕНЫ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ ГМЕЛИНА
© С.З. Иванова , Т.Е. Федорова, С.В. Федоров, В.А. Бабкин
Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) E-mail: [email protected]
В коре лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) впервые обнаружены стильбеновые соединения. Из луба (флоэмы) выделены астрингенин, астрингенин-3'-О-Р^-глюкопиранозид и пицеид, структура которых установлена спектральными методами (УФ, ЯМР 'Н и 13С). В корке (ритидоме) методом ТСХ идентифицирован астрингенин.
Ключевые слова: лиственница Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.), кора, стильбены, ЯМР 'Н и 13С.
Введение
Стильбены образуют сравнительно небольшую группу фенольных соединений. Ранее считалось, что их распространение ограничивается несколькими семействами растений. Отмечалось, что стильбены обладают биологической активностью: в растениях действуют фитоалексины, проявляют антимикробное и фунгицидное действие по отношению к разрушающим древесину грибам [1-3].
В последнее десятилетие интерес к этому классу соединений резко возрос. Увеличивающийся поток научной информации свидетельствует о существенно более широком и распространении стильбенов в растительном мире и спектре их биологической активности [4-9]. В патенте [10] по разработке новых методов выделения резвератрола из растительного сырья приводится внушительный перечень лечебных свойств, выявленных для этого соединения, в том числе такие, как кардиопротекторные, антибактериальные, антивирусные, противовоспалительные, подавление агрегации тромбоцитов, а также антиоксидантная и противоопухолевая активности и др.
Род Larix относится к семейству Pinaceae, в древесине и коре представителей двух родов которого - ели (Picea A. Lietr.) и сосны (Pinus L.) - к середине 70-х гг. было идентифицировано около двух десятков стиль-бенов как в свободном виде, так и в виде метиловых эфиров и гликозидов [11,12]. По имеющимся у нас данным, в научной литературе отсутствуют сведения об обнаружении стильбеновых соединений в представителях рода Larix.
Данная работа посвящена выделению и идентификации стильбеновых соединений, обнаруженных в лубе и корке лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr).
Экспериментальная часть
Стильбеновые соединения выделяли из этилацетатного экстракта луба лиственницы Гмелина, произрастающей в Хилокском районе Читинской области (время отбора проб - март 2006 г.).
Измельченный луб (1650 г, размер частиц 5-10 мм, влажность 55,9%) настаивали с этилацетатом при комнатной температуре в течение 2-х суток, операцию повторяли 3 раза. Этилацетат из объединенных экстрактов удаляли под вакуумом при 35-40 °С. Водный остаток разбавляли равным объемом воды и трижды экстрагировали растворителями различной полярности: хлороформом, диэтиловым эфиром и бутанолом. Выход хлороформрастворимых веществ составил 18,9 г (2,6% от массы а.с. луба), эфирорастворимых - 8,5 г (1,2%), бутанолрастворимых - 32,1 г (4,4%).
* Автор, с которым следует вести переписку.
Спектры ЯМР 1Н и 13С образцов регистрировали на приборе Bruker DPX 400 с рабочей частотой 400 и
100 МГц соответственно, в (CD3)2CO (нативные соединения) и CDCl3 (ацетаты). Отнесение химических сдвигов (ХС) резонансных сигналов в спектрах ЯМР :Н и 13С соединений 1 - 3, 2а и 3а осуществлено с использованием двумерной спектроскопии: методик HMQC, HMBC, COSY, NOESY.
УФ спектры соединений регистрировали на приборе СФ-26, растворитель - метанол.
Соединение 1 - белое аморфное, УФ спектр: Хмах 305, 325 нм; спектры ЯМР :Н и 13С (табл. 1).
Соединение 2 - белое аморфное, УФ спектр: Хмах (log е) 305(4,58), 320(4,61) нм. При ацетилировании (уксусный ангидрид-пиридин) получен гептаацетат (2а) - т.пл. 146-149 0С (белые иглы, ацетон-бензол); спектры ЯМР 1Н и 13С (табл. 2).
Соединение 3 - белое аморфное, УФ спектр: Хмах 310, 320 нм. Гексаацет (3а) - УФ спектр: Хмах 300, 310, 325 (плечо) нм; спектры ЯМР :Н и 13С (табл. 3).
Обсуждение результатов
Данная работа является продолжением работ по изучению полифенольных соединений коры лиственниц сибирской (Larix sibirica L.) и лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) [13-16]. В указанных работах объектом исследования была корка, данное исследование посвящено выделению и идентификации фенольных соединений, обнаруженных в лубе лиственницы Гмелина.
Из эфирного и бутанольного экстрактов луба колоночной хроматографией на силикагеле (элюент хлороформ - метанол 10 : 0—>10 : 5 соотн.об.) были выделены соединения 1-3. Полученные фракции анализировали методом ТСХ (Silufol).
Соединение 1, выделенное из эфирного экстракта (выход - 2,7% от массы эфирного экстракта), при анализе ТСХ показало зачениия Rf = 0,35 и 0,64 в системах (бензол - ацетон, 2 : 1) и (хлороформ-метанол, 7 : 1) соответственно. Обнаружение соединения проводили в УФ-свете по характерной ярко-синей флуоресценции и по цветной реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой (ДСК).
Соединения (2) и (3), выделенные из бутанольного экстракта луба (выход 2 - 16,9%, выход 3 - 8,7% от массы бутанольного экстракта), при анализе методом ТСХ показали значительно более низкие, по сравнению с соединением 1, значения Rf , характерные для гликозидов, а именно: значение Rf = 0,60 и 0,50 (бензол
- ацетон - метанол, 6 : 6 : 1) и Rf = 0,37 и 0,23 (хлороформ-метанол 7:1) для 3 и 2, соответственно.
Кислотный гидролиз соединений 2 и 3 (по 0,02 г) проводили 10% HCl (5 мл) при нагревании на водяной бане (80-90 °С) в течение 3 ч. Охлажденную реакционную смесь экстрагировали диэтиловым эфиром и аг-ликоны анализировали ТСХ (бензол - ацетон, 2 : 1, Silufol). Анализ показал идентичность соединения 1 и агликона соединения 2. Водный остаток нейтрализовали на анионообменной смоле АВ-17 (ОН-), упаривали, в остатке углеводы анализировали методом бумажной хроматографии сравнением с аутентичными образцами (бутанол - пиридин - вода, 6 : 4 : 3, Whatman, Sigma-Aldrich). В гидролизатах соединений 2 и 3 идентифицирована глюкоза.
В УФ спектрах выделенных соединений 1-3 и их производных в области 300-330 нм наблюдается интенсивная полоса, характерная для стильбеновых соединений, обладающих высоко коньюгированной системой, причем наблюдаемый двойной максимум этой полосы свидетельствует о транс-изомерии выделенных стиль-бенов [11, 12, 17]. Характер замещения ароматических колец был установлен методом ЯМР :Н и 13С (табл. 13). В результате анализа данных УФ и ЯМР спектроскопии, установления их соответствия литературным данным [12, 17, 18-20] выделенные соединения были идентифицированы как астрингенин - (Е)-3,3',4',5-тетра-гидроксистильбен (1), глюкозид астрингенина - (Е)-3,4',5-тригидроксистильбен-3'-О-р-Э-глюкопиранозид (2) и пицеид - (Е)-4',5-дигидроксистильбен-3-О-р-Э-глюкопиранозид (3).
,р -D-Glcp
2: R=H 2а: R=Ac
3: R=H 3а: R=Ac
Таблица 1. Данные спектроскопии ЯМР и 13С астрингенина (1)
Атом 1
5 13С, м.д. 5 *Н, м.д. (Т/ Гц)
С(1) 140,4
С(2) 105,4 6,51 а(2,0)
С(3) 158,8 8,16 - OH
С(4) 101,7 6,25 1 (2,0)
С(5) 158,8 8,16 - OH
С(6) 105,2 6,51 а(2,0)
а 126,0 6,81 а (16,4)
в 128,6 6,94 а (16,4)
С(1') 130,1
С(2') 113,3 7,06 а(2,0)
С(3') 145,5 7,88 - OH
С(4') 145,8 8,01 - OH
С(5') 115,4 6,79 а(8,3)
С(6') 119,3 6,89 аа (8,3; 2,0)
Таблица 2. Данные спектроскопии ЯМР 1Н и 13С (Е)-3, 4',5-тригидроксистильбен-3'-О-в-О-глюкопиранозида (2) и его ацетата (2а)
Атом 2 2а
5 13С, м.д. 5 *Н, м.д. (Т/ Гц) 5 13С, м.д. 5 *Н, м.д. (Т/ Гц)
С(1) 139,5 139,1
С(2) 104,5 6,51 а (2,2) 116,9 7,10 а(2,0)
С(3) 158,3 8,15- OH 151,3
С(4) 101,5 6,25 1 (2,2) 114,5 6,81 1 (2,0)
С(5) 158,3 8,15- OH 151,3
С(6) 104,5 6,51 а (2,2) 116,9 7,10 а(2,0)
а 126,4 6,88 а (16,1) 127,7 6,92 а (16,4)
в 127,6 6,96 а (16,1) 129,5 7,00 а (16,4)
С(1') 129,4 135,8
С(2') 116,0 7,46 а(2,0) 113,3 7,12 а(1,8)
С(3') 145,3 148,3
С(4') 147,4 7,93 - OH 151,3
С(5') 115,6 6,83 а(8,3) 123,5 7,01 а(8,3)
С(6') 122,6 7,12 аа (8,3; 2,0) 121,6 7,15 аа (8,3; 1,8)
в-О-глюкопиранозил в-О-глюкопиранозил
С(1) 103,4 4,81 а(7,3) 98,5 5,14 а(7,6)
С(2) 73,5 3,52 т 70,5 5,30 т
С(3) 76,9 3,55 т 72,5 5,30 т
С(4) 70,2 3,45 т 68,4 5,13 т
С(5) 76,3 3,53 т 71,9 3,98 т
С(6) 61,4 3,73 т 62,1 8 8 <ч 44 аа (2,5; 12,3) аа (5,8; 12,3)
*СИ3СО 20,4-21,1 (7 сигн,) 2,01-2,30 (7 сигн,)
СИ3*СО 168,9-170,6 (7 сигн,)
Интересно, что гликозидирование осуществляется у соединения 2 в кольце Б, а у соединения 3 в кольце А. Для стильбенов более характерно гликозидирование по кольцу А. Впервые у природных стильбенов гликозидирование в кольце В было установлено А.С. Громовой и соавторами для резвератролозида и пино-стильбенозида, выделенных из луба сосны сибирской ^тш sibirica R. Mayr) [22], позднее эти два гликозида были обнаружены и в лубе сосны обыкновенной ^тш sylvestris L.) [23], выделение из корней ревеня и установление строения соединения 2 впервые описано в работе [17]. В работах [17, 22] для установления места присоединения углеводного остатка в исследуемых стильбеновых гликозидах авторы использовали многостадийный химический метод. Современные методы ЯМР-спектроскопии позволяют получить однозначные данные о структуре этих соединений.
Таблица 3. Данные спектроскопии ЯМР 1Н и 13С пицеида (3) и его ацетата (3а)
Атом 3 3а
5 13С, м.д. 5 *Н, м.д. (Т/ Гц) 5 13С, м.д. 5 *Н, м.д. (Т/ Гц)
С(1) 139,6 140,6
С(2) 105,3 6,79 аа (2,2; 1,7) 113,6 6,99 т
С(3) 159,0 158,4
С(4) 102,6 6,45 1 (2,2) 110,4 6,67 1 (2,0)
С(5) 158,1 8,35 - OH 152,5
С(6) 106,9 6,65 аа (2,2; 1,7) 115,3 6,98 т
а 125,2 6,88 а (16,4) 128,2 6,96 а (16,4)
в 128,4 7,07 а (16,4) 130,4 7,06 а (16,4)
С(1') 128,6 135,3
С(2') 127,5 7,40 а (8,6) 128,5 7,50 а (8,6)
С(3') 115,2 6,82 а (8,6) 122,8 7,10 а (8,6)
С(4') 157,0 151,3
С(5') 115,2 6,82 а (8,6) 122,8 7,10 а (8,6)
С(6') 127,5 7,40 а (8,6) 128,5 7,50 а (8,6)
в-О-глюкопиранозил в-О-глюкопиранозил
С(1) 100,8 4,93 а (7,6) 99,7 5,14 а (7,6)
С(2) 73,5 3,53 т 71,9 5,30 т
С(3) 76,6 3,50 т 73,7 5,30 т
С(4) 70,2 3,45 т 69,2 5,18 а(9,8)
С(5) 76,8 3,50 т 73,5 3,91 т
С(6) 61,5 3,73 т 62,9 4,19 4,29 аа (2,3; 12,3) аа (5,5; 12,3)
*СН3СО 22,0-21,4 (6 сигн,) 2,32-2,1 (6 сигн,)
СН3*СО 171,4-170,0 (6 сигн,)
Спектры ЯМР 1Н соединений 1 и 2 в ароматическом и олефиновом диапазонах содержат сигналы двух олефиновых протонов, трех протонов, характерных для 1,3,5-замещенного бензольного кольца, и сигналы трех протонов кольца пирокатехинового типа (1,3,4-замещенного бензольного кольца) (табл. 1 и 2). Значения КССВ протонов двойной связи (/ = 16,4 и 16,1 Гц, соответственно) показывают, что она имеет трансконфигурацию в этих соединениях. Эти данные указывают на 3,3',4',5-тетрагидроксизамещенный транс-стильбен - астрингенин.
В спектре ЯМР 1Н соединения 3 также наблюдаются сигналы двух олефиновых протонов, трех протонов, характерных для 1,3,5-замещенного бензольного кольца, и сигналы четырех протонов кольца пара-оксифенильного типа (1,4 - дизамещенного бензольного кольца) (табл. 3). Транс-конфигурация протонов двойной связи подтверждается значением КССВ (/ = 16,4 Гц). Анализ спектральных данных указывает на 3,4',5-тригидроксизамещенный транс-стильбен - резвератрол.
В спектрах соединений 2 и 3 кроме сигналов атомов стильбеновых агликонов присутствуют сигналы протонов углеводной единицы. Значения ХС и КССВ аномерного протона (5 4,81 м.д., а, J = 7,3 Гц и 4,93 м.д., а, J = 7,6 Гц, соответственно) характерны для О-р-О-глюкопиранозного остатка. Обнаружение глюкозы в гидролизатах соединений 2 и 3 подтверждает, что 2 является глюкозидом астрингенина, а 3 -глюкозидом резвератрола.
Положение гликозидной связи в соединениях 2 и 3 подтверждали данными спектров НМВС и МОБ8У.
Полная эквивалентность протонов Н-2 и Н-6 (5 6,51 м.д. (2Н, а, J=2,2 Гц) и фенольных гидроксилов 3-ОН и 5-ОН (5 8,15 м.д.) в кольце А стильбенового фрагмента соединения 2 (астрингенина) предполагает присутствие углеводного заместителя в кольце В. Это однозначно подтверждает наличие кросс-пика сигнала аномерного протона глюкопиранозной единицы с сигналом одного из гидроксизамещенных атомов углерода (5 145,3 м.д.) кольца В в спектре НМВС соединения 2. Этот же атом углерода показал взаимодействие с протонами Н-2' (5 7,46 м.д.), Н-6' (5 7,12 м.д.) и Н-5' (5 6,83 м.д.). Эти наблюдения поддерживаются корреляцией в спектре МОБ8У 2 - аномерного протона (5 4,81 м.д.) и протона Н-2' (5 7,46 м.д.) кольца В стильбенового агликона, показывающей, что углеводная единица присоединена по 3'-положению кольца В. Таким
образом, на основании вышеизложенных данных было установлено строение соединения 2 - (E)-3,4',5-тригидроксистильбен-3'-О-р-Э-глюкопиранозид.
В спектре ЯМР соединения 3 сигналы протонов Н-2 и Н-6 стильбенового агликона (резвератрола) неэквивалентны и наблюдаются как два триплета при 5 6,79 и 6,65 м.д. (t, J=2,2 Гц) соответственно. В спектре NOESY ацетата 3а сигнал протона при аномерном атоме углерода углеводной единицы дал кросс-пики с сигналами протонов Н-2 (5 6,99 м.д.) и Н-4 (5 6,67 м.д.), на основании чего было сделано заключение о гли-козидировании 3-положения кольца А стильбенового фрагмента. Таким образом, соединение 3 является (E)-4',5-дигидроксистильбен-З-О-р-Б-глюкопиранозидом (пицеидом).
В корке астрингенин присутствует в следовых количествах. Его обнаруживали при разделении этилаце-татного экстракта коры лиственницы во фракциях, содержащих мономерные флавоноидные соединения [23], методом ТСХ в вышеприведенных условиях.
Следует отметить, что расположение заместителей в стильбенах 1-3 находится в полном соответствии с 5,7,4'- и 5,7,3',4'-положениями заместителей в ранее обнаруженных флавоноидных соединениях коры лиственниц сибирской и Гмелина [13-16], что, очевидно, обусловлено биогенезом этих соединений.
Выводы
Из луба лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) впервые выделены стильбеновые соединения
- астрингенин, астрингенин -3'-О-в-Б-глюкопиранозид и пицеид. В ритидоме обнаружен астрингенин.
Список литературы
1. Биохимия фенольных соединенй / под ред. Дж. Харборна; пер. с англ. М., 1968. 451 .
2. Запрометов М.Н. Фенольные соединения. М., 1993. 272 с.
3. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. Новосибирск, 2000. 664 с.
4. Cuendet M., Potterat O., Salvi A., Testa B., Hostettmann K. A stilbene and dihydrochalcones with radical scavenging activities from Loiseleuriaprocumbens // Phytochemistry. 2000. V. 54. P. 871-874.
5. Jong Pill Lee, Byung Sun Min, Ren Bo An et al. Stilbenes from the roots of Pleuropteris ciliinervis and their antioxidant activities // Phytochemistry. 2003. V. 64. P. 759-763.
6. Tombola F., Campello S., De Luka L. et al. Plant polyphenols inhibit VacA, a toxin secret-ed by the gastric pathogen Helicobacter pylori // FEBS Letters. 2003. №543. P. 184-189.
7. Pena-Neiro A., Hernandez T., Garcia-Vallejo C., Estrella I., Suares J.A. A survey of phenolic compounds in Spanish wines of different geographical origin // Eur. Food Res. Technol. 2000. V. 210. P. 445-448.
8. Stecher G., Huck C.W., Popp M., Bonn G.K. Determination of flavonoids and stilbenes in red wine and related biological products by HLPC and HLPC-ESI-MS-MS // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 371. P. 73-80.
9. Fuendjiep V., Wandji J., Tillequin F., Mullholland D.A., Budzikiewicz H., Fomum Z.T., Nyemba A.M., Koch M. Chalcon-oid and stilbenoid glycosides from Guibourtia tessmanii // Phytochemistry. 2002. V. 60. P. 803-806.
10. Патент 22944919 С1 РФ. Способ получения резвератрола из растительного сырья / Э.Э. Шульц, Т.Н. Петрова, Н.И. Комарова, Н.Ф. Салахутдинов, Г.А. Толстиков / Б.И., 2007. №7.
11. Громова А.С. Фенольные соединения коры некоторых видов ели, пихты и сосны: дис. ... канд. хим. наук. Новосибирск, 1975. 160 с.
12. Громова А.С., Луцкий В.И., Тюкавкина Н.А. Стильбены из коры некоторых видов семейства Pinaceae // Химия древесины. 1979. № 3. С. 103-109.
13. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В. и др. Флавоноидные соединения коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2002. №4. С. 1-15.
14. Федорова Т.Е., Иванова С.З., Иванова Н.В., Федоров С.В. и др. Лариксидинол - новый спиробифлавоноид из коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2003. №2. С. 5-8.
15. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В., Бабкин В.А. Трифлариксинол - новый спирофлавоноид из коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 37-41.
16. Федорова Т.Е., Иванова С.З., Федоров С.В., Бабкин В.А. Ларизинол - новый спиробифлавоноид из коры лиственницы Гмелина // Химия природных соединений. 2007. №2. С. 172-173.
17. Kashiwada Y., Nonaka G., Nishiora I. Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma). VI. Isolation and characterization of stilbenes // Chem. Pharm. Bull. 1984. V. 32. №9. P. 3501-3517.
18. Tatal A. Aburjai. Anti-platelet stilbenes from aerial parts of Rheum palaestinum // Phytochemistry. 2000. V. 55. P. 407-410.
19. Nyemba A.M., Ngando Mpondo T., Kimbu S.F., Connoly J.D. Stilbene glycosides from Guibourtia tessmannii // Phytochemistry. 1995. V. 39. P. 895-898.
20. Steynberg J.P., Brandt E.V., Burger J.W.F., Bezuidenhoudt B.C.B., Ferreira D. Stilbene glycosides from Guibourtia coleo-sperma: connectivities by homonuclear Nuclear Overhauser Effect difference spectroscopy// J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1988. №1. P. 37-41.
21. Громова А.С., Тюкавкина Н.А., Луцкий В.И., Калабин Г.А., Кушнарев Д.Ф. Оксистильбены внутренней коры Pinus sibirica // Химия природных соедиений. 1975. №6. С. 677-682.
22. Pan H., Lundgren L.N. Phenolics from inner bark of Pinus sylvestris // Phytochemistry. 1996. V. 42, №4. P. 1185-1189.
23. Гордиенко И.И, Федорова Т.Е., Иванова С.З., Бабкин В.А. Влияние экстрагента на компонентный состав фенольного комплекса, извлекаемого из коры лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2008. №2. С. 35-38.
Поступило в редакцию 21 февраля 2008 г.
