CC BY
61
УДК 547.587
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ЛУБА ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ И ЛИСТВЕННИЦЫ ГМЕЛИНА
© С.З. Иванова1, А.Г. Горшков2, А. В. Кузьмин2, И.И. Гордиенко1, В.А. Бабкин1
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия), e-mail: fte@irioch.irk.ru babkin@irioch.irk.ru 2Лимнологический институт СО РАН, Россия, ул. Улан-Баторская, 3,
Иркутск, 664033 (Россия), e-mail: gorchkov_ag@mail.ru
Представлены результаты исследования фенольных соединений луба лиственницы сибирской (Larix sibirica Le-deb.) и лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.). идентифицированы флавоноиды, стильбены, фенолокисло-ты на основании химических, хроматографических и спектральных данных. Впервые в коре рода Larix обнаружен кверцетин-З-О- a-L- рамнопиранозид. Определено, что в лубе исследуемых видов лиственницы преобладают фенольные соединения с пирокатехиновым типом замещения ароматического кольца.
Ключевые слова: фенольные соединения, Larix sibirica Ledeb., Larix gmelinii (Rupr.) Rupr., фенолокислоты, стиль-бены, флавоноиды.
Введение
К настоящему времени структура, свойства и практическая значимость фенольных соединений коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) хорошо исследованы, опубликован большой ряд научных статей и патентов [1-8], но все данные относятся к внешней коре - ритидому, по лубу таких работ нами не найдено. Луб (флоэма) - это наиболее важная для растения внутренняя часть коры, граничащая с камбием, осуществляющая проведение продуктов ассимиляции, создающая нисходящий ток веществ, участвующая в накоплении веществ, используемых в процессе жизнедеятельности растения [9]. В наших работах по исследованию фенольных соединений луба лиственницы Гмелина [10, 11] опубликованы данные по выделению и установлению строения стильбеновых соединений и эриодиктиола, впервые обнаруженных в коре рода Larix. В данной работе представлены результаты выделения и идентификации фенольных соединений луба двух видов - лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина.
Экспериментальная часть
Объектами исследования были луб лиственницы сибирской, произрастающей в Завальском лесничестве Куйтунского района иркутской области, и луб лиственницы Гмелина из леспромхоза «Рассвет» Хи-локского района Читинской области. Пробы луба отбирались в марте с комлевой части стволов на высоте 100-110 см.
измельченный луб (размер частиц 5-10 мм) настаивали с этилацетатом при комнатной температуре в течение 2-х суток, операцию повторяли З раза. Этилацетат из объединенных экстрактов удаляли под вакуумом при 35-40 °С. Концентрированный остаток разбавляли 3-кратным объемом воды и исчерпывающе экстрагировали растворителями различной полярности: хлороформом, диэтиловым эфиром и бутанолом. Выход фракций представлен в таблице 1.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Таблица 1. Содержание экстрактивных веществ в этилацетатных экстрактах луба лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина
Количество луба, г Влажность, % Масса абсо- В ыхо О ф р и % О4 а. с. а б у л
Вид лиственницы лютно сухого луба, г хлороформ- растворимая эфиро- растворимая бутанол- растворимая
Larix sibirica Ledeb. S60 21% 6S0 5,2 0,3 2,1%
Larix gmelinii (Rupr.)Rupr. 3630 5S% 1530 5,6 0,4 2,5
Из эфирорастворимых фракций (ЭФ) этилацетатных экстрактов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина методом колоночной хроматографии (силикагель, хлороформ - метанол с градиентным увеличением доли последнего от D до 1D об.%) были получены фракции, содержащие мономерные флавонои-ды, стильбены и фенолокислоты.
Анализ фенольных соединений осуществляли методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ. Флавоноиды и стильбе-ны идентифицировали ТСХ (Silufol, Sorbfil; системы бензол - ацетон 2 : 1, 3 : 1), фенолокислоты - методами БХ на Whatman 1CHR (England), ТСХ на пластинках Lucefol в системе 2% уксусная кислота и Silufol (бензол - ацетон 4 : 1) сравнением с аутентичными образцами, проявители - AlCl3, УФ, диазотированная сульфаниловая кислота, раствор ванилина в конц. HCl и ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Милихром А-02». Анализ методом ВЭЖХ проводили на колонке 2*75 мм, сорбент Nucleosil 1DD-5, C1S, эффективность колонки 4DDD т.т. по пику хризена. Элюенты: А - вода; В - 0,1% НСООН в ацетонитриле (1 сорт, осч, НПК «Криохром»). Температура колонки 35 °С, объем вводимой пробы 2 мкл.
Из бутанолрастворимых фракций (БФ) этилацетатных экстрактов методом колоночной хроматографии (силикагель, хлороформ-метанол с градиентным увеличением доли последнего от D до 1DD об.%) выделяли фракции, содержащие (+)-катехин, флавоноидные и стильбеновые гликозиды. Анализ фракций осуществляли методом ТСХ (Sorbfil, толуол - этилацетат - этанол - вода 5 : 2 : 2 : 1), проявители - AlCl3, УФ-диазотированная сульфаниловая кислота и ВЭЖХ. Смесь гликозидов кверцетина разделяли методом ВЭЖХ на препаративном жидкостном хроматографе «Agilent 1200», колонка 21 х 25D мм, сорбент Zorbax, XDB-C1S PrepHT, 7 мкм. Элюенты: А - вода, B - ацетонитрил (1 сорт, осч, НПК «Криохром»).
Анализ методом ВЭЖХ/МС проводили на хроматомасс-спектрометре «Agilent HPLC 1200, MS-TOF», колонка 2,1 * 150 мм, сорбент Zorbax, SB 300, C1S, 5 мкм. При детектировании с диодно-матричным детектором использовали элюенты: А - вода, Б - ацетонитрил. Градиент элюента Б от 20 до 100% за 30 мин, скорость потока 0,2 мл/мин, температура колонки 25 °С, объем вводимой пробы 2 мкл. При детектировании элюатов в режиме MS-TOF с регистрацией отрицательных ионов использовали элюенты: А - водный NH4HCO3, 0.05 M; Б - ацетонитрил (1 сорт, осч, НПК «Криохром»).
УФ спектры выделенных соединений получены на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35 UV/VIS. Спектры ЯМР 1И и 1ЗС образцов регистрировали на приборе Bruker DPX 400 с рабочей частотой 400 и 100 МГц соответственно. Масс-спектры выделенных индивидуальных соединений получены на хромато-масс-спектрометре «Shimadzu GC-MS-QP5050A» с прямым вводом образцов, энергия ионизации 70 эВ.
1. (+)- Катехин (Т) - бесцветные призмы, т.пл. 174-176оС; М+ 290; УФ-спектр (СНЗОН, X max, нм): 27S; ЯМР 1И спектр в (CD3 )2CO (м.д.): S,0 (3-ОН группы), 6,S5 (д, J=2,1, Н-2'), 6,74(м, Н-5', Н-6'), 5,9S (д, J=2,3, Н-6), 5,S3 (д, J=2,3, И-S), 4,52 (д, J=7,5, Н-2), 3,96 (м, Н-3), 2,SS (дд, J=5,4, 16,1, H-4a), 2,5 (дд, J=S,1, 16,1, Н-4Р); ЯМР 1ЗС спектр (CD3)2CO (м.д.): S2,0 (С-2), 67,7 (С-3), 2S,4 (С-4), 156,54 (С-5), 95,6 (С-6), 157,05 (С-7), 94,S (С-S), 156,21 (С-9), 99,99 (С-10), 131,5 (С-1'), 114,6 (С-2'), 145,05 (С-3'), 145,05 (С-4'), 115,01
(С- 5'), 119,4 (С-6').
2. Кверцетин-З-О-а-Ь-рамнопиранозид (19) - Аморфный желтый порошок, [a]26D - 119° (с 0,14; СНЗ ОН); УФ-спектры с добавками (СНЗОН, X max, нм): 256, 267 пл, 301 пл, 349; + AlCl3 : 275, 305 пл, 326 пл, 432; + AlCl3/HCl : 271, 301 пл, 355, 400; + NaOAc: 272, 323 пл, 370; + NaOAc/H3BO3: 262, 295 пл, 370; + CH3ONa: 271, 327 пл, 39S, ЯМР 1И (^DsN + следы Н2О ), 5 м.д., J/ Гц): S,02 (д, J=2,1, Н-2' ), 7,1 (дд, J=2,1, S,2, Н-6' ), 7,3 (д, J=S,2, Н-5'), 6,7 (д, J=1,7, И-S), 6,65 (д, J=1,6, Н-6 ), 6,3 (д, J=1,2, Н-1"), 5,1 (с ушир., Н-2"), 4,66 (дд, J=3,3, 9,2, Н-3"), 4,4 (м, J=H-5"), 4,3 (т, J=9,3, 9,3, Н-4"), 1,4S (д, J=6,1, СИЗ); ЯМР 1ЗС ((С5D5N + следы Н2О ), 5 м.д.): 179,06 (С-4), 165,S (С-7), 15S,16 (С-2), 157,69 (С-9), 14S,0 (С-4'), 147,2S (С-3'), 135,4 (С-3), 122,3 (С-1'), 122,2 (С-6'), 117,07 (С-2'), 116,47 (С-5'), 105,46 (С-1"), 104,0 (С-10), 99,7 (С-6), 94,5 (С-S), 73,3 С-2"), 72,5 (С-5"), 72,05 (С-3"), 72,0 (С-4").
Обсуждение результатов
Фракции, содержащие флавоноиды, стильбены и фенолокислоты, получены колоночной хроматографией эфирорастворимых фракций (ЭФ) этилацетатного экстракта луба лиственницы Гмелина и лиственницы сибирской. Процесс колоночной хроматографии экстрактов двух исследуемых видов лиственницы и анализ получаемых фракций осуществлялся одновременно и в одинаковых условиях, при этом качественных различий в составе фенольных соединений выявлено не было.
Методом ТСХ были идентифицированы нарингенин (1), эриодиктиол (2), дигидрокемпферол (3), ди-гидрокверцетин (4), кемпферол (5), кверцетин (6), (+)-катехин (7), резвератрол (8) и астрингенин (9). Идентификация флавоноидов и стильбенов подтверждена посредством применения ВЭЖХ, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии. Спектральные характеристики этих соединений представлены в таблице 2 и соответствуют литературным и расчетным данным. Следует отметить, что ранее все эти соединения, за исключением эриодиктиола, резвератрола и астрингенина, были идентифицированы в коре (ритидоме) изучаемых видов лиственницы [1, 3, 4].
Кроме флавоноидов и стильбенов в ЭФ луба методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ идентифицированы я-гидроксибензойная (10), ванилиновая (11), сиреневая (12), цис-, транс-п-кумаровая (13,14) и цис-, транс-феруловая (15,16) кислоты, а также транс-ферулаты и транс-кумараты высших алифатических спиртов, в основном н-эйкозанола. я-Гидроксибензойная кислота выделена в индивидуальном состоянии (т.пл. 208 °С, Хшах 255 нм, М+ 138). Все перечисленные кислоты и их производные раннее были идентифицированы в коре исследуемых видов лиственницы, где кроме них были найдены протокатеховая и кофейная кислоты [1, 3, 5], которые в ЭФ луба нами не обнаружены.
Интересно, что гликозиды перечисленных фенолокислот присутствуют в бутанольных фракциях луба (БФ) в следовых количествах, судя по результатам кислотного гидролиза, тогда как в хвое исследуемых видов лиственницы фенолокислоты были обнаружены только в виде глюкозидов [12]. Можно сделать предположение, что отсутствие протокатеховой и кофейной кислот, а также гликозидов кислот обусловлено весенней активизацией биохимических процессов в корневой и стволовой системах за счет запасенных веществ при отсутствии продуктов фотосинтеза хвои.
Таблица 2. Времена удерживания и спектральные характеристики флавоноидов и стильбенов, обнаруженных в лубе лиственниц Ьагіх і'іЬігіса и Ьагіх gmelinii
Соединение ВУ, мин. X тах, нм М+
Флаваноны
1. Нарингенин 20,8 289, 326 272
2. Эриодиктиол 17,6 288, 332 288
Дигидрофлавонолы
3. Дигидрокемпферол (аромадендрин) 15,2 290, 330 пл, 288
4. Дигидрокверцетин таксифолин) 12,4 290, 327 пл, 304
Флавонолы
5. Кемпферол 21,9 253 пл,, 265, 293 пл,,322 пл,, 368 286
6. Кверцетин 18,5 256, 268 пл,, 300 пл,,370 302
Флаван-3-олы
7. (+)-Катехин 7,0 278 290
Стильбены
8. Резвератрол 16,6 306, 320 228
9. Астрингенин 13,5 305,325 244
1. Я = Н 2. Я = ОН
3. Я = Н
4. Я = ОН
5. Я = Н 6. Я = ОН
он
но
н<
он
■он
но
он
7
8. Я = н
9. Я = он
соон
соон
он
10. Яі = Я2 = н 11. Я1 = осн3; Я2 = н 12. Я1 = Я2 = осн3
13, 14. Я = он
15, 16. Я = осн3
Основными фенольными соединениями в БФ луба являются (+)-катехин и продукты его конденсации, стильбеновые гликозиды - транс-астрингенин-З'-О-Р-Э-глюкопиранозид (17) со следами пицеида (18) и гликозиды кверцетина. Содержание этих трех приблизительно равных в количественном отношении групп фенольных соединений в БФ луба составляет ~ 80%.
Следует отметить, что в коре исследованных видов лиственницы были обнаружены три флаван-3-ола - (+)-катехин, (-)-эпиафцелехин и (-)-эпикатехин [1,4], а в лубе только (+)-катехин (7), причем его количество достигает 15-20%, а с учётом продуктов конденсации - 30% от общего содержания ФС луба.
Вторым доминирующим фенольным соединением луба является транс-астрингенин-З'-О-Р-Э-глюкопиранозид, его содержание достигает 20-25% от общего содержания ФС луба. Количество пицеида на порядок ниже, поэтому его идентифицировали в лубе лиственницы сибирской хроматографическими методами, сравнением с аутентичным образцом, выделенным нами ранее [10].
Гликозид астрингенина (17) и (+)-катехин (7) выделены в индивидуальном виде, спектральные характеристики этих соединений (УФ, ЯМР 1Н, 13С) соответствовали литературным [10, 13].
Более сложным объектом исследования оказались флавоноидные гликозиды. З.А. Лейман и соавторы [3, 14] из коры лиственницы сибирской выделили и идентифицировали три флавоноидных гликозида: квер-цетин-3-О-а-Ь-рамнофуранозид (кверцитрин), кверцетин-3-О-а-Ь-арабинофуранозид (авикуларин) и кверце-тин-3-О-а-Ь-арабинопиранозид (гуаявирин). При исследовании фенольных соединений коры лиственницы методом ТСХ нами также было отмечено присутствие флавоноидных гликозидов (среди пятен флаван-3-ол-спиробифлавоноидных олигомеров), но их количество было очень низким. В лубе их содержание оказалось значительно выше, но выделить их в индивидуальном виде методом колоночной хроматографии нам не удалось, несмотря на использование разных сорбентов (силикагель, полиамид, ЬИ-20) и подвижных фаз.
Найдено, что совместно с флавоноидными элюировались стильбеновые гликозиды, причем все они характеризовались практически одинаковым хроматографическим поведением - очень близкими значениями Яь в применяемых хроматографических системах. В результате была выделена фракция, содержащая, по данным ТСХ, одно четко локализованное пятно, совпадающее по с пятном аутентичного образца кверце-тин-3-О-арабинозида. УФ спектр фракции, снятый с добавками, соответствовал УФ-спектру кверцетин-3-О-рамнозида [15, спектр 68]. В продуктах кислотного гидролиза этой смеси (10% нсі) обнаружены кверцетин и углеводы - рамноза и арабиноза. Можно предположить, что рамноза и арабиноза, не являясь сильными хро-
17. Я1 = н, Я2 = -о-Р-Б-Гл 18. Я1 = -Р-Б-Гл, Я2 = н
мофорами и находясь в одном и том же положении молекулы кверцетина вносят практически, одинаковый вклад в УФ-спектр гликозида (Д X тах I полосы - 6-8 нм [14]), либо в смеси доминирует рамнозид. По полученным результатам было сделано предположение, что фракция флавоноидных гликозидов представляет собой смесь двух соединений - кверцетин-З-О-арабинозида (19) и кверцетин-З-О-рамнозида (20).
Смесь флавоноидных гликозидов 19 и 20 нам удалось разделить методом препаративной ВЭЖХ (рис. 1).
Первая часть смеси флавоноидных гликозидов (~ 20% от суммарного количества) представлена двумя соединениями (пики 1 и 2, рис. 1). Для минорного компонента (пик 2) структура не установлена, а для соединения пика 1 на основании результатов кислотного гидролиза, УФ (X тах 256, 267, 300 пл., 356 нм, рис. 1Б) и масс-спектра (М+ 434,0974, т/7 [М-1]- 433.0776; рис. 2Б; С20Н18Оц М 434.0849) предложена структура кверцетин-3-О-арабинозида (19).
Соединение пика 3 было выделено в большем количестве (~ 80% от суммарного количества) (рис. 1). Полученные для этого соединения УФ- (X тах 256, 267, 300 пл.., 348 нм, рис. 1 Б) и масс-спектральные (М+ 448,1203, т^ [М-1]- - 447.0933, рис. 2 В; С21Н20Оц М 448.1006) характеристики позволили установить, что оно является кверцетин-3-О-рамнозидом (20). Конфигурацию гликозидной связи и величину окисного цикла рамнозы определяли методами ЯМР-спектроскопии :Н, 13С и С-Н - корреляции НБрС, для соединения 19 это не было сделано из-за малого количества вещества. Спектры соединения 20 были зарегистрированы в пиридине-Э5, содержащем небольшое количество воды. Вероятно, это привело к незначительному сдвигу сигналов в слабое поле по сравнению со спектрами в ДМСО-Э6, но величины констант спин-спинового взаимодействия протонов углевода остались практически неизменными и соответствуют КССВ кверцетин-3-О-а-Ь-рамнопиранозида [16, 17].
Рис. 1. Препаративное разделение смеси флавоноидных гликозидов методом ВЭЖХ: А -хроматограмма смеси; Б -УФ спектры соединений в пиках 1 и 3
Рис. 2. А - Масс-хроматограммы - ПИТ 1+2 -смесь соединения 19 и соединения с
неустановленной структурой (пики 1 и 2, рис. 1); ПИТ 3 -соединение 20 (пик 3, рис. 1); Б - масс-спектр соединения 19, В - масс-спектр соединения 20
20
Выводы
В результате проведенных исследований этилацетатных экстрактов луба лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) идентифицировано 20 фенольных соединений, которые представлены фенолокислотами, флавоноидами и стильбенами. Доминирующими в лубе исследуемых видов (~ 80% от суммы фенольных соединений) являются соединения с пирокате-хиновым типом замещения ароматического кольца: транс-астрингенин и его 3'-О-р-Б-глюкопиранозид, (+)-катехин, кверцетин и его гликозиды, тогда как во внешней коре (ритидоме) преобладают фенольные соединения с п-гидроксифенильным типом замещения ароматического кольца [4]. Кверцетин-3-O-a-L-рамнопиранозид в коре лиственницы обнаружен впервые. Определено, что стильбены, наличие которых установлено в лубе исследованных видов лиственницы, не обнаружены в ритидоме, при этом в лубе отсутствуют спиробифлавоноиды, доминирующие среди фенольных соединений ритидома.
Список литературы
1. Лейман З.А. Изучение полифенолов коры лиственницы сибирской : автореф. дис. ... канд. хим. наук. Алма-Ата, 1974.
2. Черненко Г.Ф., Шмидт Э.Н. Экстрактивные вещества коры некоторых видов хвойных семейства Pinaceae: выделение, состав, применение // Химия в интересах устойчивого развития. 1997. Т. 5, №1. С. 95-103.
3. Иванова Н.В., Остроухова Л.А., Бабкин В.А., Иванова С.З., Попова О.А. Комплекс мономерных фенольных соединений коры лиственницы // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 5-7.
4. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В., Остроухова Л.А., Малков Ю.А., Бабкин В.А. Фла-воноидные соединения коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2002. №4. С. 5-13.
5. Федорова Т.Е., Иванова С.З., Иванова Н.В., Остроухова Л.А., Федоров С.В., Бабкин В.А. Алкилкумараты коры лиственницы сибирской и даурской // Химия растительного сырья. 2002. №2. С. 89-91.
6. Fedorova T.E., Ivanova S.Z., Babkin V.A. Spiroflavonoid Compounds: Structure and Distribution in Nature Review// Russian J. of Bioorganic Chemistry. 2010. V. 36, N7. Pp. 11-20. DOI: 10.1134/S1068162010070022.
7. Патент №2188031 (РФ). Фитокомплекс, обладающий антиоксидантной активностью, и способ его получения / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Н.В. Иванова, Ю.А. Малков, С.З. Иванова, Н.А. Онучина // БИ. 2002. №24.
8. Патент №2252028 (РФ) Новый комплекс биологически активных соединений из коры лиственницы - пикно-лар / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Ю.А. Малков, Н.В. Иванова, С.З. Иванова, Д.В. Бабкин, Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, М.П. Долгих, Г.А. Толстиков // БИ. 2005. № 14.
9. Лотова Л.И. Анатомия коры хвойных. М., 1987. 152 с.
10. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Федоров С.В., Бабкин В.А. Стильбены коры лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2008. №4. С. 83-88.
11. Иванова С.З., Бабкин В.А. Полифенольные соединения луба лиственницы Гмелина // Химия природных соединений. 2011. №1. С. 109-110.
12. Медведева С.А., Тюкавкина Н.А., Иванова С.З. Гликозиды фенолокислот хвои Larix sibirica // Химия природных соединений. 1971. №6. С. 844.
13. Hemingway R.W., Tobiason F.L., Steinberg J.P. Conformation and Complexation of Tannins: NMR Spectra and Molecular Search Modeling of Flavan-3-ols // Magnetic Resonance Chemistry. 1996. V. 34, N6. Pp. 424-433.
14. Чумбалов Т.К., Пашинина Л.Т., Лейман З.А. Флавоноиды коры Larix sibirica // Химия природных соединений. 1970. №6. С. 763.
15. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The Systematic Identification of Flavonoids. Spriger-Verlag, Berlin-Heilderberg; New York, 1970.
16. Marzouk M.S., El-Toumy S.A.A., Merfort I., Nawwar M.A.M. Polyphenolic metabolites of Rhamnus disperma // Phytochemistry. 1999. V. 52. Pp. 943-946.
17. Markham K.R., Ternai B. NMR of Flavonoids--II. Flavonoids other then Flavone and Flavonol Aglycones// Tetrahedron. 1976. V. 12, N21. Pp. 2607-2612.
Поступило в редакцию 27 апреля 2011 г.
