Стерилизация многослойных протеолипосом Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»



ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СТЕРИЛИЗАЦИЯ МНОГОСЛОЙНЫХ... 13

УДК 577.352.2:612.014.482 Т.В. МихайловаI, М.А. Барышникова1, Н.С. Багирова1, Н.В. Дмитриева1, В.Р. Дуфлот2, А.Ю. Барышников1 СТЕРИЛИЗАЦИЯ МНОГОСЛОЙНЫХ ПРОТЕОЛИПОСОМ

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, Москва 2Филиал ФГУП «НИФХИ им. Л.Я. Карпова», Обнинск

Контактная информация:

Барышникова Мария Анатольевна, канд. фарм. наук, старший научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-10-65 e-mail: ma ba@mail.ru

Статья поступила: 16.01.2012; подписана в печать: 18.01.2012

Резюме

Цель работы - исследование возможности использования у-облучения для стерилизации лиофильно-высушенных многослойных протеолипосом.

Лиофильно-высушенный липосомальный препарат, содержащий лизат клеточных линий меланомы человека, облучали на источнике 60Со дозами 5; 12; 17 и 25 кГр. Оптимальная доза у-облучения протеолипосом составила 12 кГр, т.к. при этом обеспечивается стерильность и сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата.

Методами оптической и электронной микроскопии показано, что после у-облучения дозой 12 кГр форма, размер и структура многослойных протеолипосом не изменились. Методом иммуноблот показано, что после у-облучения лиофильно-высушенных протеолипосом стабильность белка hsp-70 и высокая степень нагрузки лизата в липосомы сохранились. Полученные результаты служат основанием для применения гамма-облучения при стерилизации липосомальных препаратов.

Ключевые слова: у-облучение, липосомальные вакцины, стерилизация, физико-химическая стабильность.

T.V. Mikhailova1, M.A. Baryshnikova1, N.S. Bagirova1, N.V. Dmitrieva1, V.R. Duflot2, A.Yu. Baryshnikov1 STERILISATION OF MULTILAYER PROTEOLIPOSOMES

1FBSI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

2Branch of L.Ya. Karpov Research Physical-Chemical Institute, Obninsk Abstract

The aim of this work was to investigate the possibilities and limitations of gamma-irradiation as a sterilization method for freeze-dried multilayer proteoliposomes.

Freeze-dried liposomes with cell lines lysate mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z were irradiated by 60Co source with doses of 5; 12; 17 and 25 kGy. The optimal dose of y -irradiation was 12 kGy as while ensuring sterility preserved basic physical and chemical properties of multilayer proteoliposomes.

No changes in liposomal shape, size and structure were registered after y -irradiation with dose of 12 kGy as demonstrated by optical and electron microscopy. Immunoblot method showed that after y-irradiation of freeze-dried liposomes stability of the protein hsp-70 and a high degree of loading of the lysate into liposomes was preserved. The results obtained provide the basis for application of y-irradiation sterilization of liposomal vaccines.

Keywords: y-irradiation, liposomal vaccines, sterilization, chemical and physical stability.

Введение

Получение и применение липосомальных лекарственных форм препаратов - активно развивающаяся область в фармации и медицины. Способность липосом включать в себя различные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул дает поистине уникальные возможности для решения многих медицинских проблем [1]. В 1971 г. впервые была произведена попытка создания протеолипосом путем включения в липо-сомы вещества белковой природы. Включенные в готовые липосомы путем простой инкубации альбумин, инсулин, иммуноглобулины оставались связанными с ними даже после гель-фильтрации, что свидетельствует о прочной ковалентной связи между ними [3].

Примером многослойных липосом, нагруженных антигенным материалом, могут служить липосомы, содержащие мембранные белки клеток

лимфомы, липосомы, содержащие очищенный мембранный протеин N. meningitidis, липосомы с кадгерином, многослойные липосомы, содержащие полисахаридный антиген и белковый адъювант. Во всех примерах было показано, что липосомы являются средством доставки, обеспечивающим сохранность антигена и вызывающим иммунный ответ, что дает возможность применять протеолипо-сомы в качестве вакцин.

К сожалению, липосомальные лекарственные формы обладают рядом недостатков. Одним из них является сложность стерилизации липосом с помощью большинства методик в связи с деградацией липидов.

Липосомы, взаимодействующие с клетками, органами и тканями организма, должны быть стерильны. В настоящее время принятым производителями стандартом для процесса стерилизации является вероятность нахождения нестерильных единиц менее, чем 1 на 1 млн, что обеспечивает SAL, точность которого равна более чем 10-6 [3].

Учитывая высокую лабильность бислойной липидной мембраны, применение многих традиционных методов стерилизации оказывается невозможным, так как при воздействии высоких температур или некоторых органических растворителей-дезинфектантов липосомы разрушаются. Существует несколько способов стерилизации фармацевтических препаратов.

1. Автоклавирование - метод выбора для водных препаратов по Европейской Фармакопее, однако в связи со слабой физической и химической стабильностью при нагревании, для большинства липосомальных дисперсий обычно рекомендуется стерилизация фильтрацией или асептические условия приготовления [5]. Следует учесть: если размер ли-посом превышает 0,22 нм, метод фильтрации не может быть использован для стерилизации липосомальных препаратов [7]. Асептика на всех этапах производства (стерильные условия, оборудование, материалы) требует высоких материальных затрат.

2. у-облучение. В ранних исследованиях приводились данные о повреждении липосомальных систем после у-облучения, включая липосомы, состоящие из насыщенных фосфолипидов в инертной атмосфере. Поэтому указанный метод стерилизации долго время не использовался [2].

Тем не менее, в ряде дальнейших исследований [6] было показано, что стерилизация облучением не вредит сохранности липидов при облучении лиофильно-высушенных липосомальных препаратов. Гидроксильные радикалы, появляющиеся в результате воздействия излучения на воду, являются основным источником свободных радикалов, наносящих повреждения, поэтому содержание воды играет ключевую роль в стабильности липосом в процессе у-стерилизации. Исследования N.J. Zuidam et al. показали: сублимационная сушка ли-посом не только способствует повышению стабильности, но и обеспечивает подавление нежелательных изменений, индуцированных в процессе облучения [8].

Применение у-стерилизации позволяет сохранить химическую целостность липидов и физикохимические свойства препарата, заключенного в липосомы, тем самым способствуя переходу липо-сомальных препаратов из лаборатории в клинику [2].

Материалы и методы

Получение лизатов

клеточных линий меланомы

Клетки линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z из коллекции РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН культивировали в полной питательной среде RPMI 1640 с 10 %-ной ТЭС. Для получения опухолевого лизата 10 млн клеток в физиологическом растворе разрушали 5 циклами замораживания в жидком азоте и оттаивания при t=40 °С. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием (10 мин при 3000 g). Супернатант отбирали и использовали для постановки электрофореза по стандартной методике [4]. Анализируемые белки растворяли в буфере для проб, на каждую дорожку наносили 20 мкг белка. После окончания электрофореза гель извлекали и использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma).

Получение многослойных протеолипосом с клеточным лизатом

Многослойные протеолипосомы готовили следующим образом: навески лецитина и холестерина (мольное соотношение компонентов 3 : 1) растворяли в небольшом объеме хлороформа. Для предотвращения окисления липидов добавляли антиоксидант - a-токоферола ацетат в количестве 0,01 % от общего количества липидов.

Полученную смесь липидов выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов, после чего колбу присоединяли к роторному испарителю и на водяной бане при температуре +40 °С и пониженном давлении, создаваемым водоструйным насосом, проводили выпаривание хлороформа. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов.

В качестве криопротектора использовали сахарозу в концентрации 10 %. Для этого сахарозу растворяли в физиологическом растворе NaCl. Затем к раствору сахарозы прибавляли лизат с концентрацией общего белка 2,5 мг/мл. После чего липидную пленку смывали этим раствором со стенок колбы до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки.

Лиофилизация

многослойных протеолипосом Для стабилизации протеолипосом проводили сублимационную сушку. 2 мл липосомальной дисперсии во флаконах вместимостью 20 мл из стекла НС-1 помещали на полку в камеру сублимационной установки OTRIST GAMMA 2-1б LSC для замораживания и последующей лиофилизации (толщина слоя б-7 мм).

Препарат загружали на полки сублимационной камеры при температуре +20 °С, охлаждали их до температуры -70 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0)х10-2 мБар в течение 3 ч, далее нагревали от -70 °С до +20 °С со скоростью 4-5 °С/ч. После достижения препаратом температуры +20 °С (минимальное давление в камере 4,0*10-2 мБар) его выдерживали при этой температуре в течение 3 ч. Лиофилизация продолжалась 27 ч. После лиофиль-ного высушивания препарат представлял собой однородный мелкодисперсный порошок, хорошо диспергирующийся в воде.

у-облучение опытных образцов лиофильно-высушенного препарата Запаянные флаконы с образцами лиофильно-высушенных липосом - как нагруженных клеточным лизатом, так и пустых - облучали на у-установке К-200000 с источниками б0Со с варьируемой мощностью дозы 0,01-2 Гр/с. Дозиметрию проводили ферросульфатным дозиметром Фрикке.

Оценка стерильности многослойных протеолипосом Флаконы с лиофилизированным препаратом в завальцованном виде доставлялись в лабораторию микробиологической диагностики и лечения инфекций в онкологии НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им.

Н.Н. Блохина» РАМН. В лаборатории был сделан посев разведенного физиологическим раствором препарата, затем, сразу после посева, во флаконы были внесены тест-культуры S. aureus, E. Coli, C. Albicans. После у-облучения проводился посев обработанного препарата.

Стерильность липосом определяли в соответствии с «Методом бактериологического контроля стерильности» по ГОСТ 28085-89. При проверке на бактериологическое загрязнение проводили высевы на среды МПА, МПБ, МППБ, а при исследовании на грибковую контаминацию - на среду Са-буро. О стерильности судили по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах.

Испытуемые образцы проверяли на контаминацию микоплазмами путем высева в пробирки со средой Эдварда (жидкая, полужидкая и плотная). Об отсутствии роста микоплазм в среде судили по сохранению цвета среды.

Определение продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК)

Для определения ТБК-активных продуктов в образцах 1 мл дисперсии липосом переносили в пробирку с притертой пробкой, добавляли 1 мл буферного раствора (0,15М КС1 и 10мМ Тш-НС1), 0,5 мл 30 %-ной трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67 %-ного водного раствора ТБК. Полученную смесь интенсивно встряхивали и нагревали на водяной бане с температурой 80 °С в течение 30 мин, затем охлаждали в струе холодной воды до комнатной температуры и центрифугировали 10 мин при ю = 3000 об/мин (225§). Полученный раствор переливали из пробирки в кварцевую кювету и измеряли оптическую плотность на длинах волны 532 нм и 550 нм относительно контрольного опыта (дистиллированной воды). Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли по формуле:

„ ЛОВ х УЕ

С =--------X Упп , где

8 X 1

ЛОБ - разность оптических плотностей раствора на длинах волн 532 и 550 нм;

УЕ, Упр - суммарный объем и объем пробы соответственно;

8 - коэффициент экстинкции 1,56*105 л/(моль см);

1 - толщина кюветы.

Измерения рН

Образцы дисперсий липосом исследовали на рН среды рН-метрами марок БаПопш.

Определение остаточной влажности методом термогравиметрии

Для определения остаточной влажности точные навески препарата помещали в сушильный шкаф при температуре от 50 до 100 °С и сушили до постоянной массы.

Остаточную влажность определяли по разнице веса между исходным и опытным образцом:

Ж = т ~ т2 х 100% где т1

т ! - исходный вес образца, т 2 - вес образца после высушивания.

Определение размера и структуры липосом методами оптической и электронной микроскопии Размеры протеолипосом определяли методом оптической микроскопии с помощью интерфе-

ренционно-поляризационного микроскопа иммерсионным методом. Использовали оптический микроскоп МР1-3, увеличение х40.

Пробу для микроскопирования готовили путем тщательного диспергирования 5 мг препарата в 5 мл инертной дисперсионной среды.

В качестве дисперсионной среды использовали вазелиновое масло. Каплю полученной суспензии наносили на предметное стекло пипеткой. Измеряли и изучали не менее 200 частиц, если частицы различались по размерам в несколько десятков раз, и 1000 частиц при большей полидисперсности образца.

Структуру протеолипосом определяли методом электронной микроскопии.

Регидратированный в дистиллированной воде липосомальный лизат (контроль) и липосомаль-ный лизат, облученный дозой 12 кГр (опыт) смешивали 1 : 1 с 1,5 %-ным раствором глутаральдеги-да в фосфатном буфере.

После 30 мин фиксации при 4 °С липосо-мальный лизат в количестве 5 мл центрифугировали 1 ч при ю = 30000 об/мин на ультрацентрифуге L-8 Beckman.

Осадок дважды отмывали от фиксатора дистиллированной водой и проводили постфиксацию 2,5% раствором OsO4 в фосфатном буфере, затем обезвоживали окисью пропилена и этанолом в возрастающих концентрациях и заливали в смесь эпон/аралдит.

Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.

Препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10 000-50 000.

Исследование процента нагрузки лизата

в липосомы методом гель-хроматографии

Для определения степени нагрузки лизата в липосомы использовали метод эксклюзионной хроматографии.

Суть метода заключается в хроматографическом разделении жидкого липосомального препарата на липосомальную («высокомолекулярную») и нелипосомальную («низкомолекулярную») фракции с последующим определением концентрации белка методом спектрофотометрии.

Количество включенного в липосомы белка вычисляли по разности общего содержания белка в препарате и в нелипосомальной фракции.

Жидкий липосомальный препарат с предварительно известным содержанием белка готовили путем диспергирования сухого липосомального препарата в физиологическом растворе с pH 7,2 из расчета 1 г препарата на 10 мл раствора. Диспергирование проводили при энергичном встряхивании в течение 3 мин.

Хроматографическое разделение препарата проводили на сорбенте Sephadex G-50. Разделение проводили на колонке 1 см х 16 см при скорости движения элюента (физиологический раствор с pH 7,2) 2мл/мин с детекцией при 280 нм.

В первой фракции содержались липосомы, нагруженные лизатом.

В ходе разделения отбирали нелипидную фракцию, в которой затем спектрофотометрически определяли содержание белка. Эффективность включения лизата в липосомы (В, %) рассчитывали по формуле:

B = D, х v1x V1 х 100,%, где

D х v х V

D1 - оптическая плотность раствора фракции с очищенным липосомами с лизатом;

D - оптическая плотность раствора исходной липосо-мальной дисперсии;

v1 - объем фракции с очищенным липосомальным лизатом, мл; v - объем исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл;

V1 - величина разбавления фракции с очищенным липо-сомальным лизатом;

V - величина разбавления исходной липосомальной дисперсии.

Иммуноблотинг

Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5 %-ным раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad) для блокирования неспецифического связывания в буфере Б, состоящем из 2М трис, 0,5М ЭДТА, 5М NaCl;

0,1 %-ного реагента Tween 20 (Bio-Rad). Затем мембрану дважды отмывали в 20 мл буфера Б по 10 мин. Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1 : 2000 в буфере Б в течение 90 мин. После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б. Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1 : 3000 в буфере Б, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б. Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на приборе Syngene с помощью программы Gene tools.

Результаты и обсуждение

Лиофильно-высушенные протеолипосомы с лизатом клеточных линий меланомы человека mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z подвергали y-облучению дозами 5кГр; 12 кГр; 17 кГр и 25 кГр. В результате посева образцов препарата до стерилизации в некоторых образцах был выявлен рост Bacillus spp. Перед стерилизацией во флаконы с протеолипо-сомами добавляли контрольные тест-культуры микроорганизмов с физиологическим раствором. Результаты посева препарата после внесения тест-культур и последующего облучения представлены в таблице.

При облучении флаконов без препарата, содержащих только питательную среду и контрольные тест-культуры микроорганизмов, при 5 кГр также был зафиксирован рост C. albicans. При посеве препарата с тест-культурами микроорганизмов без облучения выявлен рост контрольных микроорганизмов и Bacillus spp. Исследование физико-химических характеристик облученных протеолипосом не выявило изменений по сравнению с необлученными протеоли-посомами. При сравнении формы и структуры проте-олипосом до и после облучения методами оптической (рис. 1; см. вклейку) и электронной (рис. 2) микроскопии не было выявлено значительных изменений. Средний размер протеолипосом, определенный с помощью оптической микроскопии, до и после облучения дозами 5кГр; 12кГр; 17кГр и 25кГр составил 6 мкм. Степень нагрузки липосом белковым лизатом, определенная методом эксклюзионной хроматографии, составила 54% до и после облучения липосом дозами 5кГр; 12кГр; 17кГр и 25кГр. При определении продуктов, дающих характерную реакцию с ТБК, было установлено, что после облучения протеолипо-сом дозой 12 кГр концентрация МДА не изменилась по сравнению с таковой в необлученных липосомах и составила 1,8 нмоль/мл. После облучения протеоли-посом дозами 5 кГр концентрация МДА составила 1,8 нмоль/мл, 17 кГр - 2,1 нмоль/мл, 25кГр - 2,8 нмоль/мл (рис. 3). Остаточная влажность лиофильно-высушенного препарата до и после облучения дозами 5кГр; 12 кГр; 17кГр и 25 кГр не изменилась и составила 1,3%. Показатель рН до и после облучения про-теолипосом дозами 5 кГр и 12 кГр составил 5,49. После облучения протеолипосом дозой 17 кГр показатель рН снизился до 4,63; дозой 25 кГр - до 3, 58. Иммуногенность протеолипосом определяли методом иммуноблот по уровню стабильности hsp-70. После анализа программой Syngene было установлено, что уровень hsp-70 после облучения протеолипосом дозой 12 кГр составил 73 % в сравнении с таковым необлу-ченных протеолипосом (контроль; рис. 4). С увеличением дозы облучения количество hsp-70 снижалась по сравнению с контролем: при 5 кГр - 87 %, при 17 кГр

- 70 %, при 25кГр - 51 %. Г-облучение лиофильно-высушенного липосомального препарата, содержащего лизат клеточных линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z, дозами 5; 12; 17 и 25 кГр показало стерилизующее действие дозами от 12 до 25 кГр с сохранением стабильности hsp-70. Оптимальная доза у-облучения протеолипосом составила 12 кГр, т.к. при этом обеспечивается стерильность и сохраняются основные физико-химические показатели липосо-мального препарата.

Таблица

Результаты посева протеолипосом после внесения тест-культур и последующего у-облучения___________

До облучения (инокуляция) Дозы облучения Результат посева после облучения

5 кГр 12 кГр 17 кГр 25кГр

S. aureus ■ Роста нет

E. coli ■ Роста нет

C. albicans ■ Рост C. albicans и Bacillus spp

S. aureus ■ Роста нет

E. coli ■ Роста нет

C. albicans ■ Роста нет

S. aureus ■ Роста нет

E. coli ■ Роста нет

C. albicans ■ Роста нет

S. aureus ■ Роста нет

E. coli ■ Роста нет

C. albicans ■ Роста нет

А

Б

Рис. 2. Электронная микрофотография протеолипосом гамма-облучения дозой 12 кГр. Размер частиц 6 мкм.

А: до; Б: после.

2,5

1,5

0,5

0

I

□ Многослойные протеолипосомы без облучения

□ Многослойные протеолипосомы, облученные дозой 5 кГр

□ Многослойные протеолипосомы, облученные дозой 12 кГр

□ Многослойные протеолипосомы, облученные дозой 17 кГр

□ Многослойные протеолипосомы, облученные дозой 25 кГр

Рис. З. Определение продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой.

з

2

1

1 2 3 4 5

Рис. 4. Уровень hsp-7G в протеолипосомах после у-облучения (б°Со):

1 - контроль (протеолипосомы без облучения); 2 - 5 кГр; 3 - 12 кГр; 4 - 17 кГр; 5 - 25 кГр.

Выводы

Гамма-облучение лиофильно-высушенного липосомального препарата, содержащего лизат клеточных линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z, дозами 5; 12; 17 и 25 кГр показало стерилизующее действие дозами от 12 до 25 кГр.

Оптимальная доза гамма-облучения проте-олипосом составила 12 кГр, т.к. при этом обеспечивается стерильность и сохраняются основные

физико-химические показатели липосомального препарата.

Методами оптической и электронной микроскопии показано, что после гамма-облучения дозой 12 кГр форма, размер и структура многослойных протеолипосом не изменились.

Методом иммуноблот показано, что после у-облучения лиофильновысушенных липосом сохраняются стабильность белка Ьєр-70 и высокая степень нагрузки лизата в липосомы.

Литература

1. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery progress and problems // Tibtech. - 1995. - 13. - P. 527-37.

2. MohammedA.R., Bramwell V.W., CoombesA.G.A., Perrie Y. Lyophilisation and sterilisation of liposomal vaccines to produce stable and sterile products // Methods. - 2006. - 40(1). - P. 30-8.

3. RiazM. Liposome es preparation methods // Pakistan Journal of Pharm.Sciences - 1996. -19(1). - P. 65-77.

4. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual (2nd edn). Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. - P. 1847.

5. Tardi C., Drechsler M., Bauer K.H., Brandl M. Steam sterilisation of vesicular phospholipid gels // Int. J. Pharm. - 2001. - 217.

- P. 161-72.

6. Tinsley P. W., Maerker G.J. Isolation and identification of palmitoylphophocholinepropanediol from. Effect of low-dose gamma-radiation on individual phospholipids in aqueous suspension // Am. Oil Chem. Soc. - 1993. - 70. - P. 187-91.

7. Weiner A.L. Liposomes for protein delivery: selecting manufacture and development processes//Immunomethods. - 1994. - 4. - P. 201-9.

8. Zuidam N.J., Versluis C., Vernooy E., Crommelin D.J.A. Gamma-irradiation of liposomes composed of saturated phospholipids // Biophys. Acta (BBA)-Biomembr. - 1996. - 1280. - P. 135-48.