CC BY
137
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ... 61
УДК 616-006-085:615.371:577.352.2 Т.В. Михайлова, М.А .Барышникова, О.В. Клименко, НА. Оборотова, А Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Михайлова Татьяна Витальевна, научный сотрудник лаборатории НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-1065 e-mail: tania-05@list.ru
Статья поступила: 13.10.2011, принята к печати 25.10.2011
Резюме
Использование липосомальной формы противоопухолевых вакцин позволяет обеспечить сохранность антигенов, способствует повышению иммуногенности и увеличению эффективности доставки антигенов к клеткам иммунной системы. Цель работы - разработка и изучение биофармацевтических свойств липосомальной вакцины, содержащeй лизат клеточных линий меланомы, экспрегсирующих максимальное количество hsp-70.
Липосомы с лизатом клеточных линий меланомы человека mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z получали методом пассивной загрузки. Был подобран оптимальный режим лиофильного высушивания, обеспечивающий сохранение физико-химических свойств липосом и стабильности hsp-70. Включение hsp-70 в липосомы составило 65 %. Средний размер везикул после регидратации липосом составил 6000 нм. Полученные результаты служат основанием для дальнейшего изучения липосомальной вакцины.
Ключевые слова: противоопухолевые вакцины, лиофильная сушка, липосомы, криопротекторы, иммуноблот.
T.V. Mikhailova, M.A. Baryshnikova, O.V. Klimenko, N.A. Oborotova,А.Yu. Baryshnikov, Yu. V. Shishkin CREATION OF LIPOSOMAL ANTITUMOR VACCINE
N.N Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Usage of liposomal forms of antitumor vaccines provides stability of antigens, promotes increase of an immuno-genicity and improvement of antigen presentation. The purpose of present research was obtaining of liposomes with lysate of human melanoma cell-line mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z, expressing maximum quantity of hsp-70.
Liposomes were obtained by method of passive loading. Selection of lyophilization technique and size of liposomes analysis were performed. Stability of hsp-70 after lyophilization was shown. Inclusion of hsp-70 in liposomes was 65 %. The average vesicle size after rehydration was 6000 nm. The received results form the basis for further studying of liposomal vaccine.
Key words: antitumor vaccines, lyophilization, liposomes, cryoprotector, immunoblot.
Введение
В настоящее время активная иммунотерапия при помощи специфических вакцин является признанным методом профилактики и лечения некоторых видов злокачественных новообразований, в том числе меланомы. Основной задачей противоопухолевой вакцинации является индукция и поддержание иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию иммунорезистентных опухолевых клеток [1; 2]. Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей опухолеассоциированные антигены, в том числе - белки теплового шока. Уровень экспрессии белка теплового шока 1кр70 имеет прогностическое значение в опухолях различного типа и используется для стимуляции иммунного ответа при вакцинотерапии злокачественных новообразований [3]. Современные исследования в области создания противоопухолевых вакцин включают два основных направления: совершенствование существующих технологических этапов и разработку нового поколения вакцин на основе достижений молекулярной биологии и иммунологии. Использование липо-сомальных препаратов - одно из наиболее активно развивающихся направлений в медицине [8]. Способность липосом включать в себя различные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера моле-
кул дает поистине уникальные возможности для решения многих медицинских проблем [4; 9; 10]. Липо-сомальная форма вакцины обеспечивает сохранность антигенов, увеличивает эффективность доставки антигенов к клеткам иммунной системы и способствует повышению иммуногенности [11]. Для достижения длительной стабильности липосомальных препаратов используется сублимационная сушка [6]. В процессе лиофилизации происходит удаление воды из системы, что предотвращает гидролиз фосфолипидов. В результате получается твердый продукт с низкой молекулярной подвижностью, что также ведет к подавлению химической и физической нестабильности [5; 7].
Цель работы - разработка липосомальной вакцины, содержащeй лизат клеточных линий меланомы, экспрегсирующих максимальное количество hsp-70, и изучение ее биофармацевти-ческих свойств.
Материалы и методы
Препараты и реактивы
Фосфатидилхолин (Lipoid); холестерин (Sigma); а-токоферола ацетат PN №-001153/01-2002 10%-ный раствор в масле (ОАО «ICN Марбиофарм»); хлороформ (Химмед); сахароза (ГОСТ 5833-75); физиологический раствор NaCl 0,9%-ный (Химмед); Sephadex G-50 superfine (Amersham Biosciences).
Акриламид/бис-акриламид 30%-ный раствор (Sigma); электродный буфер - l0x Tris/Glycine/SDS Buffer (Bio-Rad); буфер для проб Laemmli Sample buffer (Bio-Rad), буфер для переноса - 10х Tris/Glycine buffer (Bio-Rad); натрия додецил сульфат (SDS) (Bio-Rad); краситель Bromophenol Blue Sodium salt (Helicon); аммония персульфат (Helicon); ТЕМЕД (Helicon); фосфатно-солевой буфер рН 7,4 (ПанЭко); 2-меркаптоэтанол (Helicon); неионогенный детергент Triton X-100 (Bio-Rad).
Приборы и аппаратура
Электронные весы Sartorius LA 1200 S; роторный испаритель с водяной баней (BUCHI Rotavapor R-200);ультрaцентрифугa Optima TLX (Beckman Coulter); хроматографическая колонка C 4/16; детектор UVis-920; рекордер REC 111 (Amersham Biosciences); сублимационная установка OTRIST GAMMA 2-16 LSC; анализатор влажности Sartorius MA 100.
Прибор для анализа гелей Syngene; спектрофотометр Beckman Coulter DU 800; центрифуга Eppendorf 5417 R; шейкер Biosan PSU -2T; вортекс Heidolph Reax top; камера для электрофореза и им-муноблота Bio-Rad Power Pac HC (Bio-Rad).
Получение лизатов
клеточных линий меланомы
Клетки линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z из коллекции РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН культивировали в полной питательной среде RPMI 1640 с 10%-ной ТЭС.
Для получения опухолевого лизата 10 млн клеток в физиологическом растворе NaCl разрушали 5 циклами замораживания в жидком азоте и оттаивания при t=40 °С. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием (10 мин при 3000 g). Супернатант отбирали и использовали для постановки электрофореза по стандартной методике [10]. Анализируемые белки растворяли в буфере для проб, на каждую дорожку наносили 20 мкг белка. После окончания электрофореза гель извлекали и использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma).
Иммуноблотинг
Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5%-ным раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad) для блокирования неспецифического связывания в буфере Б, состоящем из 2М трис, 0,5 М ЭДТА, 5М NaCl, 0,1 %-ный реагент Tween 20 (BioRad). Затем мембрану дважды отмывали в 20 мл буфера Б по 10 мин.
Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1: 2000 в буфере Б в течение 90 мин.
После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б. Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1:3000 в буфере Б, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере Б.
Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на приборе Syngene с помощью программы Gene tools.
Получение липосом с клеточным лизатом
Экспериментальные серии липосомальной вакцины готовили следующим образом: навески лецитина и холестерина (мольное соотношение компонентов 7 : 3) растворяли в небольшом объеме хлороформа.
Получали дисперсию с конечной концентрацией липидов 20 мг/мл. Для предотвращения окисления липидов добавляли антиоксидант - а-токо-ферола ацетат в количестве 0,01% от общего количества липидов.
Полученную смесь липидов выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов. После полного растворения липидов колбу присоединяли к роторному испарителю и на водяной бане при температуре +40 °С и пониженном давлении, создаваемым водоструйным насосом (4+2 мм рт.ст.), проводили выпаривание хлороформа. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов.
В качестве криопротектора использовали сахарозу в концентрации 10%. Для этого сахарозу растворяли в 0,9%-ном изотоническом растворе. Затем к раствору сахарозы прибавляли клеточный лизат в различных соотношениях лизат : липиды (1 : 5; 1 : 10; 1 : 20 по объему).
Образовавшуюся липидную пленку смывали этим раствором со стенок колбы при температуре 38 °С до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки.
Количественное определение
содержания лизата в липосомах
Определение процента включения белка в ли-посомы проводили методом спектрофотометрии при длине волн 260 нм и 280 нм.
Отделение липосом с лизатом от невключив-шихся белков проводили ультрацентрифугированием при 50 тыс об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий невключившийся антиген, декантировали, а осадок липосом ресуспендировали в физиологическом растворе и снова центрифугировали.
Процесс промывания липосом повторяли до удаления остаточного количества белка в супернатанте, содержание которого контролировали на спектрофотометре.
После последнего центрифугирования осадок липосом ресуспендировали в требуемом объеме физиологического раствора, после чего разрушали 5 %-ным р-ром Тритона Х-100. Концентрацию белка (С, мг/мл) рассчитывали по формуле:
С = (1,55 X А280 - 0,76 X А260) х Р1, где
А260 и А280- оптическая плотность разведенного раствора при 260 нм и 280 нм соответственно;
Р1 - разведение.
Эффективность включения белка (В, %) рассчитывали по формуле:
0 (С X100%)
в =-----—--------, где
С.исх
С - концентрация белка, определенная после разрушения липосом;
С исх. - концентрация белка при включении в липосомы.
Определение режима лиофильного высушивания липосомального лизата Для стабилизации липосомального лизата проводили сублимационную сушку с использованием в качестве криопротектора 10 %-ного раствора сахарозы. 2 мл липосомальной дисперсии во флаконах вместимостью 20 мл из стекла НС-1 помещали на полку в камеру сублимационной установки CHRIST GAMMA 2-16 LSC для замораживания и последующей лиофилизации (толщина слоя составляла 6-7 мм).
На каждом этапе процесса сублимационного высушивания проводили исследование препарата с целью контроля физико-химических характеристик и иммуногенности.
Исследование процента нагрузки белка в липосомы методом гель -хроматографии Для определения степени включения антигенов в липосомы использовали метод эксклюзионной хроматографии.
Суть метода заключается в хроматографическом разделении жидкого липосомального препарата на липосомальную («высокомолекулярную») и нелипосомальную («низкомолекулярную») фракции с последующим определением концентрации белка методом спектрофотометрии.
Количество включенного в липосомы белка вычисляли по разности общего содержания белка в препарате и содержания белка в нелипосомальной фракции.
Жидкий липосомальный препарат с предварительно известным содержанием белка готовили путем диспергирования сухого липосомального препарата в физиологическом растворе с pH 7,2 из расчета 1 г препарата на 10 мл раствора. Диспергирование проводили при энергичном встряхивании в течение 3 мин.
Хроматографическое разделение препарата проводили на сорбенте Sephadex G-50. Разделение проводили на колонке 1 см х 16 см при скорости движения элюента (физиологический раствор с pH 7,2) 2 мл/мин с детекцией при 280 нм. В первой фракции содержались липосомы, нагруженные лизатом. В ходе разделения отбирали нелипидную фракцию, в которой затем спектрофотометрически определяли содержание белка. Эффективность включения лизата в липосомы (В, %) рассчитывали по формуле:
Д х V1 х V л то/
B = —-----1----1 х 100%, где
D х v х V
Dj - оптическая плотность раствора фракции с очищенным липосомами с лизатом;
D - оптическая плотность раствора исходной липосомальной дисперсии;
v1 - объем фракции с очищенным липосомальным лизатом, мл;
v - объем исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл;
V1 - величина разбавления фракции с очищенным липо-сомальным лизатом;
V - величина разбавления исходной липосомальной дисперсии.
Определение остаточной влажности методом термогравиметрии Остаточную влажность рассчитывали по формуле:
W = m1 + m х100%
m
, где
m 1 - исходный вес образца, m 2 - вес образца после высушивания.
Определение размера липосом
методом оптической микроскопии
Размеры липосом определяли методом оптической микроскопии с помощью интерференционно-поляризационного микроскопа иммерсионным методом. Использовали оптический микроскоп МР1-3, увеличение х20.
Пробу для микроскопирования готовили путем тщательного диспергирования 5 мг препарата в 5 мл инертной дисперсионной среды. В качестве дисперсионной среды использовали вазелиновое масло.
Каплю полученной суспензии наносили на предметное стекло пипеткой. Измеряли и изучали не менее 200 частиц, если частицы различались по размерам в несколько десятков раз, и 1000 частиц при большей полидисперсности образца.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы «BIOSTAT» (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v. 5.0. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Для приготовления лизата были выбраны клетки линий меланомы человека, экспрессирующие наибольшее количество hsp-70 - mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z [3]. Концентрация белка после лизиса10 млн клеток составила 2,5 мг/мл.
Исследование сочетаемости лизата клеточных линий меланомы и липидов, из которых готовили липосомы, показало их хорошую совместимость. Изучение соотношения «антиген - липиды» показало, что наилучшим являлось соотношение 1:10, обеспечивающее наибольшую стабильность препарата. Был определен оптимальный режим приготовления липосом с лизатом клеточных линий меланомы: диспергирование в течение 2 мин при механическом встряхивании и температуре смеси +38-42 °С.
При микроскопическом исследовании полученного липосомального препарата было установлено, что образующийся комплекс «белки - липосо-мы» представлял собой расположенные равномерно в поле зрения многослойные везикулы, размером от 100 до 100 000 нм, во внутренний объем которых были включены белки (рис. 1). В процессе лиофиль-ного высушивания липосомального лизата оценивали влияние температурного режима сушки на качество готового препарата: его внешний вид (цвет, пористость, однородность), физико-химические характеристики (скорость растворения или ресуспендирования, размер везикул и т.п.). В случае режима 1 флаконы с препаратом загружали на полки сублимационной камеры при температуре +20 °С, охлаждали их до температуры -70 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0)х10-2 мБар в течение 3 ч, далее их нагревали от -70 °С до +20 °С со скоростью 4-5 °С/ч. После достижения препаратом температуры +20 °С (минимальное давление в камере 4,0х10-2 мБар) его выдерживали при этой температуре в течение 3 ч. Лиофилизация продолжалась 27 ч.
64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ...
Таблица
Влияние процесса лиофилизации на размер везикул
Температурные режимы лиофилизации Средний размер везикул, нм
№ ОС До лиофилиза- ции После регидратации
Предварительное замораживание Основная сушка Вторичная сушка Без криопротектора С криопротектором
1 -7Q -5Q ^Q 55QQ 15QQQ 6QQQ
2 -5Q -4Q -25 55QQ 17QQQ 75QQ
З ^Q -2Q -1Q 55QQ 18QQQ 9QQQ
В случае режима 2 флаконы с препаратом помещали на полки и выдерживали при температуре -50 °С и минимальном давлении в камере (4,0-6,0)х10-2 мБар в течение 2 ч, далее их нагревали от -50 °С до +20 °С со скоростью 4 °С/ч. После достижения препаратом температуры +20 °С (минимальное давление в камере 4,0х10-2 мБар) его выдерживали при этой температуре в течение 3 ч. Лиофилизация продолжалась 23 ч.
В случае режима 3 флаконы с препаратом помещали на полки и выдерживали при температуре -30 °С и минимальном давлении в камере 4,0-6,0х10-2 мБар в течение 1,5 ч, далее их нагревали от -30 °С до + 20 °С со скоростью 4-5 °С/ч. После достижения препаратом температуры +20 °С (минимальное давление в камере 4,0х10-2 мБар) его выдерживали при этой температуре в течение 3 ч. Лиофилизация продолжалась 19 ч.
На основании проведенных исследований оптимальным признан режим 1 с использованием 10% раствора сахарозы в качестве криопротектора (см. табл.). После лиофильного высушивания препарат представлял собой однородный мелкодисперсный порошок, хорошо диспергирующийся в воде (см. вклейку; рис. 1).
Включение 1і8р-70 в липосомы, определенное методом иммуноблот с последующей обработкой программой Бу^епе, составило 73 % до лио-фильного высушивания и 65 % после лиофильного высушивания в сравнении с исходным лизатом (рис. 2).
1 2 3
Рис. 2. Определение hsp-7Q до и после лиофилиза-ции липосомальной вакцины методом иммуноблот:
1 - лизат клеточных линий mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z (контроль);
2 - лизат, включившийся в липосомы до лио-фильного высушивания;
3 - лизат, включившийся в липосомы после регидратации лиофильно-высушенных липосом.
Включение лизата, определенное методом гель-хроматографии, составило 54 %. Невысокий показатель можно объяснить возможными потерями белка из-за наличия крупных белково-липидных комплексов, не полностью проходящих сквозь сорбент в хроматографической колонке (рис. 3).
Содержание остаточной влаги в образцах не превышало 1,3 %. Образцы вакцины с различной остаточной влажностью заложены на хранение при температурах +4-6 °С и -10 °С.
В процессе хранения оценивается состояние порошка (слеживаемость, сыпучесть), изменения его реологических характеристик, перекисного окисления липидов, а также изменение биологической активности образцов методом иммуноблот.
Рис. 3. Хроматограмма разделения липосомальной вакцины, регидратированной в физиологическом растворе (скорость движения бумаги в рекордере 2 мм/мин., элю-ент - физиологический раствор NaCl Q,9%):
I - фракция очищенных липосом с клеточным лизатом;
II - нелипосомальная фракция.
Выводы
1. Получены липосомы с лизатом клеточных линий меланомы mel P, mel Kor, mel Mtp, mel Is, mel Z.
2. На основании выбранного состава и технологии получения липосом оптимизирован режим сублимационной сушки, обеспечивающий сохранение физико-химических свойств липосом.
3. Методом иммуноблот показано, что после лиофильного высушивания липосо-мальной вакцины сохраняется стабильность белка hsp-7Q и высокая степень нагрузки лизата в липосомы.
4. Показано, что после регидратации происходит восстановление формы и размеров везикул липосомальной вакцины.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ... 65
Литература
1. Бистрин Ж..-К, Оратц Р., Шапиро Р. Вакцины из частично очищенных опухолевых антигенов. Биологические методы лечения онкологических заболеваний: принципы и практическое применение / Под ред. Винсента Т. Де Вита мл., С. Хеллмана, С. А. Розенберга. - М.: Медицина, 2002. - С. 687-97.
2. Михайлова И.Н., Лукашина МИ, Барышников АЮ. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник российской академии медицинских наук. - 2005. - Т. 7 - С. 37-40.
3. Михайлова ТВ, Барышникова МА, Бурова О.С. и др. Сравнение уровня экспрессии hsp70 на клеточных линиях меланомы человека // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 1. -С. 43-48.
4. Afzal R. Mohammed, Vincent W. Bramwella , Allan G.A. Coombesb and Yvonne Perrie Lyophilisation and sterilisation of liposomal vaccines to produce stable and sterile products // Methods - 2006. - 40(1). - P. 30-8.
5. Chengjun Chen, Dandan Han, Cuifang Cai, Xing Tang. An overview of liposome lyophilization and its future potential // J. of Controlled Release. - 2010. - 142. - P. 299-311.
6. Crowe H, Crowe L.M. Factors affecting the stability of dry lyposomes // Biochim. Biophys Acta. - 1988. -939. - P. 327-34.
7. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery progress and problems // Tibtech - 1995. - 13. - P. 527-37.
8. Mohammad Riaz. Liposome es preparation methods // Pakistan Journal of Pharm. Sciences. - 1996. - 19(1).
- P. 65-77.
9. Subhash C. Basu, Manju Basu. Methods in Molecular Biology // Liposome Methods and Protocols. - 2010.
- 199. - P. 59-85.
10. Volkman Weissig. Liposomes Methods and Protocols // Biological membrane models. - 2010. - 2. - P. 241-50.
11. Zhengua Zhong, Xin Wei, Baowen Q. et al. A novel liposomal vaccine improves humoral immunity and prevents tumor pulmonary metastasis in mice // Int.J.Pharm. - 2010. - 399(1-2) - P. 156-62.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
