CC BY
130
14. Shirshev S.V., Nekrasova I.V. Comprehensive evaluation of estriol immunomodulating potency. Immunologiya. 2011; 32 (2): 72-4. (in Russian)
15. Nekrasova I.V., Shirshev S.V. Estriol in regulation of immunocompetent cells functions. Meditsinskaya immunologiya. 2009; 11 (4-5): 327-8. (in Russian)
16. Shirshev S.V., Kuklina E.M., Zamorina S.A., Nikitina N.M., Nekrasova I.V. Method for Determining Phagocytic Activity of Human Peripheral Blood Neutrophils from Bioluminescence Extinction Degree Data. Patent RF№ 2292553, 2007. (in Russian)
Received 27.03.14
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.373.03:616-006.04].012
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Щербаков А.И., Косоруков В.С., Барышников А.Ю.
разработка модели противоопухолевой липосомальной вакцины
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, 115478, г. Москва, Россия
Цель данной работы - создание модели противоопухолевой липосомальной вакцины, содержащей лизат опухолевых клеток крысиной глиомы С6. В процессе работы нами была оптимизирована методика получения клеточного лизата для получения малых однослойных липосом. Липосомы, содержащие лизат клеток линии крысиной глиомы С6, имели размер частиц 185 ± 10 нм, уровень включенного белка при этом составил 60±5%. Методом гель-фильтрационной хроматографии показано, что эффективность лизиса клеток повышалась при дополнении методики «замораживание-оттаивание» ультразвуком с 5-10 до 90-95%. Методом иммуноблот Т-анализа показано, что при ультрацентрифугировании в лизате клеток сохраняются мембранные антигены на том же уровне, что и в лизатах, полученных известными методами.
Ключевые слова: липосомы; лизат; глиома С6; ультразвук; ультрацентрифугирование; гель-фильтрационная хроматография; иммуноблот.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 317-321. AfanasievaD.A., BaryshnikovaM.A., ShcherbakovA.I., Kosorukov V.S., BaryshnikovA.Yu. THE DEVELOPMENT OF ANTICANCER LIPOSOMAL VACCINE MODEL FSBI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» RAMS, Moscow
The aim of this study was to develop model anticancer liposomal vaccine containing a lysate of rat glioma C6. We have optimized the method of cell lysate preparation to get a small single-layer liposomes. The size of liposomes containing a lysate of rat glioma C6 was 185±10 nm, the percent of the included protein was 60±5%. We have confirmed by gel-filtration that the efficacy of cell lysis was increased from 5-10% to 90-95% if we lysed cells using ultrasound technique in addition to freezing- thawing method of cell lysis. We have also shown by Western Blot analysis that ultracentrifugation of cell lysate does not influence the level of membrane antigenes, tested using other approach for cell lysis.
Key words: liposomes; lysate; C6 glioma; ultrasound; ultracentrifugation; gel-filtrational chromatography; immunoblot.
citation: Immunologiya. 2014; 35 (6): 317-321. (in Russian)
введение. В настоящее время активно ведутся поиски новых средств, которые могли бы способствовать мобилизации защитных систем организма на борьбу с онкологическими заболеваниями. Одним из таких средств является вакцинотерапия опухолей, вызывающая и поддерживающая иммунный ответ, который направлен на распознавание и элиминацию опухолевых клеток [ 1-7]. В НИИЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» ведутся разработки противоопухолевых вакцин, некоторые из которых прошли I и II фазы клинических испытаний [8-16]. Новое направление в этих разработках - создание липосомальных противоопухолевых вакцин [17]. Липосомальная лекарственная форма является удобным инструментом для направленной доставки как лекарственных препаратов, так и соединений белковой приро-
Для корреспонденции: Афанасьева Дарья Андреевна, danila459@yandex.ru
For correspondence: Afanas'eva Dar'ya Andreevna,
danila459@yandex.ru
ды, в том числе опухолевых антигенов [18, 19]. Липосомы предохраняют свое содержимое от преждевременного разрушения в организме, а при конъюгировании с различными лигандами они могут направленно доставить его в целевые ткани организма. В качестве лигандов, обеспечивающих специфическое накопление липосом в целевых областях, можно использовать антитела (АТ) к маркерным антигенам определенных тканей, создавая иммунолипосомы. С помощью иммунолипосомальной формы вакцины можно улучшить презентацию опухолевых антигенов, содержащихся в лизате опухолевых клеток, клеткам иммунной системы и вызвать противоопухолевый ответ. В модельном эксперименте в качестве источника опухолевых антигенов использовали лизат клеток перевиваемых линий меланомы, полученных в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [20-22].
Чаще всего лизат клеток используют при создании дендритно-клеточных вакцин. Его получают по стандартной методике «замораживание - оттаивание» [16, 17, 23-29]. Клетки несколько раз замораживают в жидком азоте, затем оттаивают при комнатной температуре или на водяной бане
при 37°С. Разрушенные клетки осаждают центрифугированием и собирают супернатант, содержащий опухолевые антигены.
Однако полученный таким методом лизат имеет ряд недостатков. В составе лизата содержатся достаточно крупные частицы клеточной мембраны, которые невозможно встроить в малые однослойные липосомы [17]. Кроме того, возникает проблема со стерилизацией крупных многослойных липосом [30].
Цель данной работы - создание модели противоопухолевой липосомальной вакцины, содержащей лизат опухолевых клеток крысиной глиомы С6.
Материалы и методы. Клетки для приготовления лизата. Клетки линии крысиной глиомы С6, полученные из банка клеточных линий ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, культивировали в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, HEPES, L-глутамин, гентамицин, витамины, аминокислоты и пируват натрия, при 37°С в атмосфере 5% СО2.
Для получения опухолевого лизата клетки открепляли раствором Версена и один раз отмывали физиологическим раствором.
Электрофорез и иммуноблоттинг. Анализируемые белки растворяли в денатурирующем буфере для нанесения проб, каждую пробу кипятили 5 мин на водяной бане при 96°С. Объем пробы, наносимой на каждую дорожку, составил 20 мкл. Для определения молекулярного веса белка в пробах на одну из дорожек наносили Rainbow Marker RPN800 (Amer-sham). Электрофорез проводили на 12% акриламидном геле по стандартной методике. После окончания электрофореза гель извлекали и использовали для переноса на нитроцеллю-лозную мембрану (Amersham).
Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками и маркером инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с 5% раствором Liquid block RPN 3601 (Amersham) для блокирования неспецифического связывания в буфере А, состоящем из 0,02 М Tris, pH 7,4 и 0,2 М NaCl. Затем мембрану 4 раза отмывали буфером Б, состоящим из 0,02 М Tris, pH 7,4, 0,2 М NaCl и 0,1% Tween 20, по 5 мин. Далее проводили инкубацию в течение 90 мин с моноклональным АТ к внеклеточному фрагменту коннексина-43, разведенными в соотношении 1:1000 в буфере Б. После этого мембрану отмывали 4 раза по 10 мин в буфере Б. Затем мембрану инкубировали с козьими АТ к мышиным IgG (H+L), конъюгированных с щелочной фосфатазой (Bio-Rad, США), разведенными в соотношении 1:1000 в буфере Б, в течение 90 мин, после чего мембрану отмывали 4 раза по 10 мин буфером Б. Мембрану проявляли с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на приборе Syngene с помощью программы Gene tools.
Методика получения липосом, нагруженных лизатом опухолевых клеток. Для получения липидной пленки навески лецитина, холестерина и DSPE ПЭГ-2000 (мольное соотношение компонентов 11:9:1) растворяли в 10 мл хлороформа. Полученную смесь липидов выдерживали до полного растворения липидов, периодически встряхивая колбу. После растворения липидов колбу присоединяли к роторному испарителю и проводили выпаривание хлороформа на водяной бане при температуре 40°С и пониженном давлении, создаваемом водоструйным насосом (4 ± 2 мм рт. ст.). После полного удаления органического растворителя образовавшуюся на стенках колбы тонкую липидную пленку оставляли на досушивание в течение 30 мин для удаления паров хлороформа. Полученную тонкую однородную ли-пидную пленку смывали со стенок колбы при комнатной температуре 3 мл раствора клеточного лизата глиомы С6 в физиологическом растворе в соотношении 1:3 до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки. Полученную липосомальную дисперсию экстру-дировали через поликарбонатные мембраны размером пор
mAu 12001000800600400200-
5,5 6,0
Лизис 5-10%
10 20 30 40 50 60 701
Рис. 1. Хроматограмма лизата, полученного из клеточной линии крысиной глиомы С6 методом «замораживания - оттаивания». Основной пик - клеточный дебрис, органеллы, крупные частицы.
400, 200 и 100 нм последовательно до образования малых однослойных липосом.
Средний диаметр липосом определяли методом лазерной корреляционной спектроскопии светорассеяния на приборе №сотр380 SubmicшnParticleSizer. Пробу для анализа готовили путем тщательного диспергирования капли липосо-мальной дисперсии в 500 мкл дистиллированной воды.
Гель-фильтрационная хроматография. Для определения включения белка в липосомы использовали метод гель-фильтрационной хроматографии. Суть метода заключается в разделении липосом, нагруженных лизатом, и лизата, не попавшего в липосомы.
Процесс разделения проводили на колонке ХК16 с сорбентом Sepharose СЬ-4В при скорости движения элюента (физиологический раствор 0,15 М №С1, рН 7,2) 2 мм/мин с детекцией при длине волны 262 нм. На выходе из колонки собирали две фракции: в первой фракции содержались липосомы, нагруженные лизатом, во второй - не включившийся лизат. Затем в обеих фракциях спектрофотометрически определяли количество белка, а в первой фракции - размер липосом.
С помощью гель-фильтрационной хроматографии также изучали чистоту и приблизительный белковый состав лизата. Для этого лизат пропускали через колонку при той же скорости движения элюента и сорбенте, что и липосомы.
Определение содержания белка в лизате и липосомах, нагруженных лизатом. Количество белка определяли спек-трофотометрически тремя способами: стандартным методом с бицинхониновой кислотой (при X 562 нм), стандартным методом с использованием реактива Бредфорда (при X = 595 нм) и по формуле Калькара (при X 260 нм и X 280 нм): Сбелка = 1,45 • А280 - 0,74 • А260 (в мг/мл). В результате выбрали метод с использованием бицинхониновой кислоты, так как при определении этим методом включения белка в ли-посомах липидный фон был самый низкий. Для разрушения липидов при определении процента включения белка в ли-посомах использовали 5% раствор Тритона Х-100. Уровень белка определяли с учетом фона пустых липосом и самого детергента.
Результаты и обсуждение. Клеточный лизат, получаемый методом «замораживания-оттаивания», оказался непригодным для включения в малые однослойные ли-посомы, поскольку содержал слишком крупные частицы, которые не проходили через мембранные фильтры при экструзии липосомальной дисперсии. Результаты гель-
mAu
Подбор оптимального соотношения белок - липиды для получения малых однослойных липосом
* 5 раз
Рис.2. Хроматограмма лизата, полученного из клеточной линии крысиной глиомы С6 по оптимизированной методике. Малый пик -незначительное количество клеточного дебриса.
фильтрационной хроматографии показали, что процент белковой массы был очень низким (фракция 50-70 мл) (рис. 1). Приняли решение оптимизировать методику приготовления лизата.
Для предотвращения разрушения лизата внутриклеточными протеазами к клеткам добавляли физиологический раствор с 1 мМ раствором ингибитора протеаз фенилметил-сульфонилфторида (PMSF) из расчета 1 мл на 20 млн клеток. Затем клетки разрушали тремя циклами замораживания в жидком азоте и оттаивания при 37°С на водяной бане, после чего обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (SONOPULS HD 2070, ВаЫеНп) в режиме 75-80% мощности
Рис. 3. Иммуноблот с антителами к коннексину 43: М - маркер;
1 - лизирующий буфер, содержащий 0,1% NP40;
2 - лизирующий буфер, содержащий 0,5% NP40;
3 -Cell lysis buffer 1Х («BD Pharmingen»);
4 - лизат, приготовленный методом «замораживание - оттаивание»;
5 - лизат, приготовленный по оптимизированной методике
Соотношение белок-липиды, мг Концентрация белка, мг/мл Объем лизата, мл Примечание
1:12 8,3 3 Экструзия невозможна
1:16 6,3 3 " "
1:24 4,2 3 Экструзия невозможна через фильтр с диаметром пор менее 400 нм
1:32 3,1 3 Экструзия возможна через фильтры с диаметром пор 400, 200 и 100 нм
4 с, через 15 с остывание, 5-7 раз. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием (15 мин при 12 000 g). Отобранный супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Отбирали пробу для определения количества белка в лизате. Готовый лизат помещали на хранение при -20°С. Концентрация белка после лизиса 20 млн клеток в разных партиях составляла 4,5-5 мг/мл.
После того как методику приготовления лизата дополнили ультразвуком, центрифугированием при 12 000 g и фильтрованием супернатанта, выход крупных клеточных частиц при гель-фильтрации значительно снизился. Эффективность лизиса повысилась с 5-10 до 90-95 % (рис. 2). Полученный таким образом клеточный лизат легко проходил через фильтры при экструзии липосомальной пленки.
Для подтверждения наличия мембранных антигенов в лизате, полученном оптимизированной методикой, проводили вертикальный электрофорез с последующим имму-ноблоттингом с моноклональными АТ к внеклеточному фрагменту коннексина-43. Клетки крысиной глиомы С6 лизировали пятью способами: 1) лизирующим буфером, содержащим Tris/HCl, pH 7,4; NaCl, DTT, EDTA,0,1% NP40; 2) лизирующим буфером, содержащим Tris/HCl, pH 7,4; NaCl, DTT, EDTA, 0,5% NP40; 3) Cell lysis buffer 1X (BD Pharmingen); 4) методом «замораживание - оттаивание»; 5) по оптимизированной нами методике. В результате показано наличие коннексина-43 во всех исследуемых образцах (рис. 3).
Методику приготовления липосом оптимизировали для увеличения процента включения лизата в липосомы. Липид-ную пленку смывали лизатом, содержащим 3,1 мг белка в 3 мл физиологического раствора, соотношение белок - липиды, равное 1:32, обеспечивало наиболее высокий процент включения белка в липосомы, а также свободное прохождение через мембранные фильтры при экструзии полученной липосомальной дисперсии (см. таблицу).
Размер полученных липосом, определенный методом лазерной корреляционной спектроскопии светорассеяния, составил 185 ± 10 нм. На основе сравнения количеств белка в исходном лизате, оставшегося в очищенных липосомах и не связавшегося с липосомами, определили содержание включенного белка в липосомы - 60 ± 5%.
Выводы
1. Оптимизирована методика получения лизата из клеточной линии крысиной глиомы С6. Показано, что в полученном по этой методике лизате сохраняются мембранные антигены на том же уровне, что и в лизатах, полученных другими известными методами.
2. Подобрано оптимальное соотношение белок-липиды для получения малых однослойных липосом. Разработана модель липосомальной лекарственной формы противоопухолевой вакцины, содержащей лизат клеточной линии крысиной глиомы С6.
3. Получены липосомы с клеточным лизатом глиомы С6. Размер полученных липосом составил 185 ± 10 нм, содержание включенного включения белка в липосомы - 60 ± 5%.
литература
1. Барышников А.Ю. Дендритные противоопухолевые вакцины. ВестникРОНЦ им. Н.Н. Блохина. 2001; 12(2): 50-4.
2. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии. Вестник РАМН. 2004; 12: 6-12.
3. Барышников А.Ю. Биотерапия опухолей: неудачи и перспективы. Опухоли женской репродуктивной системы. 2007; 1: 13-6.
4. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н. Биотерапия рака: от эксперимента к клинике. Вестник РАМН. 2007; 10: 46.
5. Балдуева И.А., Новик А.В., Моисеенко В.М. и др. Противоопухолевые вакцины. Практическая онкология. 2003; 4(3): 157-66.
6. Моисеенко В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи. Практическая онкология. 2001; 8 (4): 58-64.
7. Никитин К.Д., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока. Российский биотерапевтический журнал. 2007; 6(2): 3-12.
8. Бережной А.Е., Сапрыкина Н.С., Козлов А.М. и др. Изучение противоопухолевой активности вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ. Российский биотерапевтический журнал. 2006; 5(4): 47-53.
9. Лукашина М.И., Смирнова А.В., Алиев В.А. и др. Дентрит-ные вакцины в терапии колоректального рака. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. 2008; 19(3): 35-40.
10. Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С. и др. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. Российский биотерапевтический журнал. 2010; 9(3): 47-50.
11. Манина И.В., Сапрыкина Н.М., Козлов А. М. и др. Повышение эффективности цельноклеточной GM-cSF секретирую-щей противоопухолевой вакцины путем преинкубации с ци-токинами. Российский биотерапевтический журнал. 2011; 10(3): 61-6.
12. Михайлова И.Н., Барышников К.А., Бурова О.С. и др. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой гено-модифицированной вакцины. Оценка иммунного статуса. Российский биотерапевтический журнал. 2006; 5(3): 51-4.
13. Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы. Российский биотерапевтический журнал. 2007; 6(2): 39-45.
14.. Никитин К.Д., Рубцова М.А., Утяшев И.А., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе дендридом. Российский онкологический журнал. 2010; 2: 48-53.
15. Носов Д.А., Борунова А.А., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия на основе дендритных клеток у больных почечно-клеточным раком. Онкоурология. 2010; 2: 22-32.
16. Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Буркова А.А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения. Российский биотерапевтический журнал. 2002; 1(3): 55-61.
17. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины. Российский биотерапевтический журнал. 2011; 10(4): 62-6.
18. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов. Вестник РАМН. 2012; 3: 23-31.
19. Барышников А.Ю., Барышникова М.А. Иммунолипосомы и мишени их действия. Российский химический журнал. Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева. 2012; 56(3-4): 60-7.
20. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Морозова Л.Ф. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН. 2005; 7: 37-40.
21. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экс-
прессия раково-тестируемых антигенов в клетках меланомы человека. Сибирский онкологический журнал. 2010; 37(1): 29-39.
22. Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Morozova L.F. et al. Cancer/ testis genes expression in human melanoma cell lines. Melanoma Res. 2008; 18(5): 303-13.
23. Ji B., Chen Q., Liu B. et al. Glioma stem cell-targeted dendritic cells as a tumor vaccine against malignant glioma. Yonsei Med. J. 2013; 54(1): 92-100.
24. Kandalaft L.E., Chiang C.L., Tanvi J. et al. A phase I vaccine trial using dentritic cells pulsed with autologous oxidized lysate for recurrent ovarian cancer. J. Transl. Med. 2013; 11: 149-74.
25. Kim D.S., Kim D.H., Goo B. et al. Immunotherapy of malignant melanoma with tumor lysate-pulsed autologous monocyte-derived dentritic cells. Yosei Med. J. 2011; 52(6): 990-8.
26. Kuwabara K., Nishishita T., Morishita M. et al. Results of a phase I clinical study using dendritic cell vaccinations for thyroid cancer. Thyroid. 2007; 17: 53-8.
27. Valle R.D., Cerio A.L.D., Inoges S. et al. Dendritic cell vaccination in glioblastoma after fluorescence-guided resection. World J. Clin. Oncol. 2012; 3: 142-9.
28. Vleeschouwer S.D., Arredouani M., Ade M. et al. Uptake and presentation of malignant glioma tumor cells by monocyte-de-rived dentritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 2005; 54: 372-82.
29. Yu J.S., Liu G., Ying H. et al. Vaccination with tumor lysate-pulsed dentritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Res. 2004; 64: 4973-9.
30. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С. и др. Стерилизация многослойных протеолипосом. Российский биотерапевтический журнал. 2012; 11(1): 13-8.
references
1. Baryshnikov A.Yu. Dendritic anticancer vaccines. Vestnik RONTs im. N.N. Blokhina. 2001; 12 (2): 50-4. (in Russian)
2. Baryshnikov A.Yu. Principles and practice of vaccinotherapy. VestnikRAMN. 2004; 12: 6-12. (in Russian)
3. Baryshnikov A.Yu. Biotherapy of tumors: failures and prospects. Opukholi zhenskoy reproduktivnoy sistemy. 2007; 1: 13-6. (in Russian)
4. Baryshnikov A.Yu., Demidov L.V., Mikhaylova I.N., Peten-ko N.N. Cancer biotherapy: from experiment to clinic. Vestnik RAMN. 2007; 10: 46. (in Russian)
5. Baldueva I.A., Novik A.V., Moiseenko V.M. et al. Anticancer vaccines. Prakticheskaya onkologiya. 2003; 4(3): 157-66. (in Russian)
6. Moiseenko V.M. Vaccinotherapy of skin melanoma. Prakticheskaya onkologiya. 2001; 8 (4): 58-64. (in Russian)
7. Nikitin K.D., Baryshnikov A.Yu. Development of anticancer vaccines on the basis of heat shock protein. Rossiyskiy biotera-pevticheskiy zhurnal. 2007; 6(2): 3-12. (in Russian)
8. Berezhnoy A.E., Saprykina N.S., Kozlov A.M et al. Anticancer activity of vaccine based on genetically modified tumor cells producing GM-KSF. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2006; 5(4): 47-53. (in Russian)
9. Lukashina M.I., Smirnova A.V., Aliev V.A et al. Dendritic vaccine in the treatment of colorectal cancer. Vestnik RONTs im.i N.N. Blokhina RAMN. 2008; 19(30): 35-40. (in Russian)
10. Manina I.V., Peretolchina N.M., Saprykina N.S. et al. Preclinical study of skin melanoma immunotherapy by whole-cell anticancer vaccines producing GM-CSF. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2010; 9(3): 47-50. (in Russian)
11. Manina I.V., Saprykina N.M., Kozlov A. M. et al. Pre-incubation of whole-cell GM-CSF producing anticancer vaccine with cyto-kines increases the efficacy of treatment. Rossiyskiy bioterapev-ticheskiy zhurnal. 2011; 10(3): 61-6. (in Russian)
12. Mikhaylova I.N., Baryshnikov K.A., Burova O.S. et al. The first phase of clinical trials of anticancer genetically modified vaccine: the immune response. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2006; 5(3): 51-4. (in Russian)
13. Mikhaylova I.N., Petenko N.N., Chkadua G.Z. et al. Treatment
of metastatic melanoma by dendritic cell' vaccine: the results of clinical trial of I/II phase. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhur-nal. 2007; 6(2): 39-45. (in Russian)
14. Nikitin K.D., Rubtsova M.A., Utyashev I.A., Baryshnikov A.Yu. Development of anticancer vaccine on the basis of dendridoms. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2010; 2: 48-53. (in Russian)
15. Nosov D.A., Borunova A.A., Chkadua G.Z. et al. The treatment of patients with clear cell renal cell carcinoma by dendritic cells vaccine. Onkourologiya. 2010; 2: 22-32. (in Russian)
16. Chkadua G.Z., Zabotina T.N., Burkova A.A. et al. The adoptation of assay of dendritic cells isolation from monocytes of peripheral blood for clinical application. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2002; 1(3): 55-61. (in Russian)
17. Mikhaylova T.V., Baryshnikova M.A., Klimenko O.V. et al. Development of liposomal vaccine for anticancer therapy. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal . 2011; 10(4): 62-6. (in Russian)
18. Baryshnikov A.Yu. Nanostructured liposomal systems in the delivery of anticancer drugs. Vestnik RAMN. 2012; 3: 23-31. (in Russian)
19. Baryshnikov A.Yu., Baryshnikova M.A. Immunoliposomes and the targets of their action. Zhurnal Rossiyskogo klinicheskogo obshchestva im. D.I. Mendeleea. 2012; 56(3-4): 60-7. (in Russian)
20. Mikhaylova I.N., Lukashina M.I., Morozova L.F. et al. Melanoma cell lines as the basis for anticancer vaccines. Vestnik RAMN. 2005; 7: 37-40. (in Russian)
21. Mikhaylova I.N., Kovalevskiy D.A., Burova O.S. et al. Expression of cancer-testis antigens in melanoma cells. Sibirskiy onkolo-gicheskiy zhurnal. 2010; 37 (1): 29-39. (in Russian)
22. Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Morozova L.F. et al. Cancer-testis genes expression in human melanoma cell lines. Melanoma Res. 2008; 18(5): 303-13.
23. Ji B., Chen Q., Liu B. et al. Glioma stem cell-targeted dendritic cells as a tumor vaccine against malignant glioma. Yonsei Medical J. 2013; 54(1): 92-100.
24. Kandalaft L.E., Chiang C.L., Tanvi J. et al. A phase I vaccine trial using dentritic cells pulsed with autologous oxidized lysate for recurrent ovarian cancer. J. Transl. Med. 2013; 11: 149-74.
25. Kim D.S., Kim D.H., Goo B. et al. Immunotherapy of malignant melanoma with tumor lysate-pulsed autologous monocyte-derived dentritic cells. YoseiMed. J. 2011; 52(6): 990-8.
26. Kuwabara K., Nishishita T., Morishita M. et al. Results of a phase I clinical study using dendritic cell vaccinations for thyroid cancer. Thyroid. 2007; 17: 53-8.
27. Valle R.D., Cerio A.L.D., Inoges S. et al. Dendritic cell vaccination in glioblastoma after fluorescence-guided resection. World J. Clin. Oncol. 2012; 3: 142-9.
28. Vleeschouwer S.D., Arredouani M., Ade M. et al. Uptake and presentation of malignant glioma tumor cells by monocyte-de-rived dentritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 2005; 54: 372-82.
29. Yu J.S., Liu G., Ying H. et al. Vaccination with tumor lysate-pulsed dentritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma. Cancer Res. 2004; 64: 4973-9.
30. Mikhaylova T.V., Baryshnikova M.A., Bagirova N.S. et al. The sterilization of multilayer proteoliposomes. Rossiyskiy biotera-pevticheskiy zhurnal. 2012; 11(1): 13-8. (in Russian)
Received 25.03.14
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛЕТОЧНАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616-056.43-092:612.017.1]-078.33-092.9
Чудаков Д.Б., Рязанцев Д.Ю., Каширина Е.И., Бержец В.М.1, Свирщевская Е.В.
роль дозы аллергена в индукции у мышей юе-антител на белки из клещей домашней пыли
ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, 117997, г Москва; 1ФГБУ «Научно-исследовательский Институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г Москва, Россия
Механизмы возникновения IgE-антител (АТ) до настоящего времени понятны плохо. Очевидно, что низкий уровень белков из аллергенов, попадающих в контакт с иммунной системой, является определяющим для возникновения аллергии. Целью данной работы стало изучение продукции IgG-, IgA- и IgE-АТ на рекомбинантные белки Der f 1 и Der f 2 из клещей домашней пыли Dermatophagoides farinae в зависимости от количества введенного аллергена. Иммунизацию мышей линии CD1 проводили 12 раз интраперитонеально смесью 1:1 белков Der f 1 и Der f 2 в фосфатном буфере без адъювантов в дозах 10 000, 1000, 100, 10 и 1 нг/инъекция на 1 мышь. Продукция специфических IgG и IgA возрастала с увеличением дозы иммунизации, в то время как продукция IgE возрастала с уменьшением дозы антигена и была наивысшей в группе 1 нг. Между дозами, вызывающими IgG- и IgE-продукцию, существует «пустое окно» доз, при которых отсутствует специфический гуморальный ответ. Ответ на белки Der f 1 и Der f 2 был независимым и подчинялся общей кинетике. Результаты анализа содержания субклассов IgG показали, что доминирующим являлось содержание IgG1-AT, титр которых был максимальным и синтез которых наблюдали при дозах более чем 100 нг/инъекция на 1 мышь, тогда как IgG2a-, IgG2b- и IgA-AT определяли только в группах 1 и 10 мкг. IgG3-AT регистрировали только в группе 10 мкг. С помощью синтетических пептидов показали, что антитела IgG1-, IgG2b- и IgA-AT распознают общий эпитоп Der f 1 90-101, тогда как IgG2a-AT имеют другую специфичность. IgE-AT имели низкую аффинность и не распознавали синтетические пептиды. Таким образом, показано, что селекция IgE-продуцирующих В-клеток в ответ на растворимый белок возможна только при отсутствии IgG- и IgA-продуцентов, конкурирующих за антиген.
Ключевые слова: IgE; IgG; доза антигена; мыши; клещи домашней пыли Dermatophagoides farina.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 321-328.
Для корреспонденции: Свирщевская Елена Викторовна, esvir@ibch.ru For correspondence: Svirshchevskaya Elena Viktorovna, esvir@ibch.ru
