CC BY
18
© Фартушна А.М., Костенко В.О. УДК 616.311.2-008.9-092.9: 615.916'175
СТАН ОКИСНЮВАЛЬНИХ ПР0ЦЕС1В У ТКАНИНАХ ЯСЕН Б1ЛИХ ЩУР1В У ДИНАМ1Ц1 ХР0Н1ЧН01 1НТ0КСИКАЦ11 Н1ТРАТ0М НАТР1Ю
Фартушна А.М., Костенко В.О.
ВДНЗУ «Украшська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
В эксперименте на 40 белых крысах исследовано состояние процессов свободнорадикального окисления, анти-оксидантной системы и энергетического обмена в тканях десны в динамике хронической интоксикации нитратом натрия (14, 30 и 90 сутки). Выявлено, что в условиях эксперимента в тканях десны отмечается прогрессивное увеличение продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной (начиная с 14-х суток интоксикации) и микросомальным (на 90-е сутки интоксикации) электронно-транспортными цепями. На 14-е сутки хронической интоксикации нитратом натрия в тканях десны выявляется увеличение активности анти-оксидантного фермента каталазы без признаков активации процессов пероксидного окисления липидов. В дальнейшем (на 30-е и 90-е сутки интоксикации) наблюдается активация этого процесса (увеличение концентрации ТБК-активных соединений) на фоне существенного снижения антиоксидантного потенциала (увеличение прироста концентрации ТБК-активных соединений за время 1.5 часовой инкубации в прооксидантном буферном растворе, уменьшение активности каталазы). Длительное введение избыточного количества нитрата натрия угнетает энергетический метаболизм в тканях десны крыс (уменьшается концентрация в тканях АТФ и АДФ, увеличивается содержание АМФ). В динамике изменений энергетического обмена в десне при хронической нитратной интоксикации отмечается определенная фазность: период активации биоэнергетических процессов, проявляющееся ростом энергетического потенциала, изменяется на 30-е сутки эксперимента периодом их прогрессирующего угнетения.
Ключевые слова: хроническая интоксикация нитратом натрия, свободнорадикальное окисление, антиоксидан-тная система, энергетический обмен, десна.
Епщемюлопчш дослщження вказують на високу розповсюдженють основних стоматолопчних захво-рювань у населення в еколопчно несприятливих реп-онах [1]. Захворювання пародонта (у т.ч. ясен) пось дають друге мюце по частой та поширеност пюля ка-рieсу. Частота пнпвтв у дтей та пщл™в досягае вщ 30 до 80% випадгав, у дорослих - 32-46% [5].
Недостатньо з'ясований патогенез захворювань ясен у мешкан^в еколопчно несприятливих регюшв, зокрема, забруднених штратами територй Остановлено, що ушверсальний мехашзм дм штра^в пов'язаний з утворенням оксиду азоту (N0) [2,4]. Останшй характеризуемся важкопрогнозованим характером дм на активнють втьнорадикального окис-нення, енергетичний обмш, пролферативн процеси, бере участь у патогенезi захворювань пародонта [7,15]. ЗмЫи окислювальних процеав у тканинах ясен у динамiцi хрошчноТ Ытоксикаци штратом натрю за-лишаються нез'ясованими.
Метою ^е'Т роботи було вивчення стану процеав втьнорадикального окиснення, антиоксидантноТ сис-теми та енергетичного обмшу в тканинах ясен бтих щурiв у динамiцi хронiчноТ iнтоксикацiТ нiтратом натр^.
Матерiали та методи досл1ження
Дослщження були проведен на 40 бтих щурах ль нп Вiстар масою 180-210 г. У першiй серп необхщы показники вивчали у штактних тварин (контрольна серiя); у друпй, третiй i четвертiй - пюля вщтворення хронiчноТ iнтоксикацiТ нiтратом натрю вiдповiдно про-тягом 14, 30 та 90 дiб.
Нiтрат натрю вводили тваринам щоденно протя-гом термшу експерименту в дозi 200 мг/кг маси тта у виглядi водного розчину. Введення здiйснювали внут-рiшньошлунково за допомогою спецiального зонду. Використання ^еТ методики дозволяе вщтворити над-
лишкове утворення NO та депонування його у BMnr^i парамагштних комплексiв з гемовим та негемовим за-лiзом [2]. Евтаназiю тварин виконували методом дис-локацп шийних хребцiв пiд ефiрним наркозом.
Утворення супероксидного анюн-радикала ( О 2) у тканинах ясен оцЫювали при проведены тесту з шт-росиым тетразолieм з iндукторами у виглядi нкотина-мiдаденiндинуклеотиду вiдновленого (НАДН) та шко-тинамiдаденiндинуклеотидфосфату вiдновленого (НАДФН) [6].
Рiвень ПОЛ у тканинах оцшювали по утворенню в реакцп тюбарбпуровоТ кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забарвленого триметЫового комплексу до i пiсля 1,5-годинноТ iнкубацiТ [3]. Активнють антиоксидантноТ системи оцЫювали за приростом концентраци ТБК-активних продуктiв за час твторагодинноТ шку-бацiТ у залiзоаскорбатному буферному розчинi, а та-кож за активнiстю каталази [3].
Концентра^ю аденозинтрифосфату (АТФ) у шти-нах ясен визначали за допомогою вимiрювання опти-чноТ густини реагуючих речовин, яка пропорцiйна вмь сту АТФ у пробi [12]. Вмiст аденозинди- та монофосфату (АДФ i АМФ) визначали в одшй пробi за допомогою сполучених реакцм [10]. На основi одержаних результат обчислювали значення енергетичного поте-нцiалу за формулою D.E. Atkinson [9].
Отриман данi пщдавали статистичнiй обробцi. Для перевiрки розподту на нормальнiсть було засто-совано розрахунок критер^ Шапiро-Вiлка. Якщо дат вщповщали нормальному розподiлу, то для Тх порiв-няння використовували t-критерм Ст'юдента для неза-лежних вибiрок. У випадку, коли ряди даних не пщля-гали нормальному розподту, статистичну обробку здiйснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-Birni. Статистичн розрахунки прово-
Том 16. N 5-6 2012 р.
дили з використанням програм "Мюгобой Ежее! 2007" та '^а^^евой 6.0".
Результата та 1х обговорення
При вщтворенш 14- та 30-добовоТ Ытоксикацп шт-ратом натрiю продукцiя О - мiкросомальним елект-
ронно-траспортним ланцюгом (ЕТЛ) (табл. 1) iстотно не змЫюеться, проте пiдвищуeться його утворення мiтохондрiями - вiдповiдно до 24.42±1.01 нмоль/гс (на 14.4%, р<0,05) та 27.67±1.03 нмоль/г с (на 29.7%, р<0,001).
Таблиця 1
Змiни вльнорадикальних процесв та антиоксидантного захисту в тканинах ясен блих щурiв за умов надлишкового
надходження до органiзму нiтрату натрiю (М+т, п=20)
Показники 1нтактна група Час введення н1трату натр1ю
14 д1б 30 д1б 90 д1б
Продукц1я О 2 , нмоль/г с м1кросомальним ЕТЛ Продукц1я О 2 м1тохондр1альним ЕТЛ 18.42±0.64 21.34±0.82 19.57±0.96 24.42±1.01 * 20.26±1.07 27.67±1.03 * 22.34±0.58 * 30.26±0.97 *
ТБК-реактанти, мкмоль/г до Ыкубацп п1сля 1нкубацИ прир1ст 27.1±2.8 44.0±3.3 16.9±1.3 26.5±3.3 43.3±4.1 16.8±1.6 35.3±2.5 * 57.2±3.2 * 21.9±1.2* 37.3±2.1 * 60.0±2.6 * 22.7±1.0 *
Каталаза, мкат/г 2.84±0.28 3.57±0.14 * 1.99±0.13 * 1.56±0.10 *
Примiтка. У табл. 1-2: * - р<0,05 у пор'внянш з даними iнтактноi'
За умов 90-добовоТ штоксикаци штратом натрю достг^рно збтьшуеться продук^я О 2 не ттьки мь тохон^альним ЕТЛ - до 30.26±0.97 нмоль/гс (на 41.8%, р<0,001), але i мiкросомальним - до 22.34±0.58 нмоль/г с (на 21.3%, р<0,001).
Збiльшення продукци О - за умов утворення ве-ликоТ кiлькостi N0 з екзогенного джерела створюе пе-редумови для генерацп високотоксичного пероксишт-риту (^N00-), який, як сильний окиснювач, може здiйснювати нiтрування та штрозування бiомолекул [17].
При вiдтвореннi 14-добовоТ iнтоксикацiТ нiтратом натрiю достовiрних змЫ концентрацiТ ТБК-реактантiв та Тхнього приросту не виявлено. У той же час актив-нють каталази достовiрно збiльшуeться - до 3.57±0.14 мкат/г с (на 25.7%, р<0,05). Це, вочевидь, е реакцieю на утворення надлишковоТ кiлькостi АФК, оскiльки ак-тивнiсть цього ферменту iндукуеться на рiвнi транс-ляцп Н2О2 [14].
За умов 30-денного введення штрату натрiю вщмь чаеться вiрогiдне зростання концентраци ТБК-реактантiв до Ыкубацп - до 35.29±2.5 мкмоль/г (на 30.2%, р<0,05) - та пюля 1,5-годинноТ iнкубацiТ тканин ясен в залiзоаскорбатному буферному розчинi - до 57.2±3.2 мкмоль/г (на 30.0%, р<0,02).
У цей же час виявляеться суттеве пiдвищення приросту концентрацiТ ТБК-реактан^в за час iнкубацiТ - до 21.9± 1.2 мкмоль/г (на 29.6%, р<0,02). Це вказуе на розвиток антиоксидантноТ недостатностi у тканинах ясен, що також пщтверджуеться зниженням активнос-т каталази - до 1.99±0.13 мкат/г (на 29.9%, р<0,02).
Вважаеться, що зниження активност каталази може бути пов'язано iз зв'язуванням цього ферменту з продуктом метаболiзму штра^в - N0 - та утворенням менш активноТ ферiкаталази-N0 [11].
сера.
На 90 добу Ытоксикацп штратом натр^ виявленi змiни прогресують. Концентра^я ТБК-реактантiв до iнкубацiТ зростае - до 37.3±2.1 мкмоль/г (на 37.6%, р<0,02) - та пiсля 1,5-годинноТ Ыкубацп тканин ясен в залiзоаскорбатному буферному розчинi - до 60.0±2.6 мкмоль/г (на 36.4%, р<0,01). Прирют концентрацiТ ТБК-реактантiв за час Ыкубацп пiдвищуеться - до 22.7±1.0 мкмоль/г (на 34.3%, р<0,01). Активнiсть каталази знижуеться - до 1.56±0.1 мкат/г (на 45.1%, р<0,01).
Виснаження антиоксидантного потен^алу, в пев-шй мiрi, може бути зумовлене також N0-залежним пригнiченням активностi СОД через здатнють N0 вза-емодiяти з юном м^ активного центру ферменту [13], порушенням глутатiоновоТ й аскорбатноТ систем, зниженням вмiсту вп"амЫу Е [8]. Адже всi перелiченi сполуки е компонентами антиоксидантного захисту в тканинах пародонта.
Порушення енергетичного обмЫу розглядаються як один з головних механiзмiв ушкодження тканин за умов хрошчноТ iнтоксикацiТ нiтратом натрю який реа-лiзуеться через утворення у ходi бiотрансформацiТ нiтрат- та штрит-юшв оксиду азоту [2,4].
Через 14 дiб вiд початку введення бтим щурам ш-трату натрю концентрацiя АТФ у тканинах ясен вiро-гiдно зростае на 11.2% (р<0,02) - до 2.08±0.04 мкмоль/г (табл. 2).
Концентра^я АМФ зменшуеться на 19.1% (р<0,001) - до 0.72±0.03 мкмоль/г. Вiдмiчаеться змiна стввщношення аденiннуклеотидiв, що супроводжу-еться збтьшенням величини енергетичного потен^а-лу - на 6.8% (р<0,02) - до 0.663±0.014, що також пщ-тверджуе посилення ресинтезу макроерпв. Такi змЫи, вочевидь, вiдображують активацiю бiоенергетичних процеав при адаптацiТ органiзму до впливу токсичного агенту.
Таблиця 2
3mï ни вмсту та спiввiдношення aôeHÎHHyKneomuôie у тканинах ясен за умов надлишкового надходження до органзму
Himpamy натрю (M+m, n=20)
Показники 1нтактна група Час введення ытрат натр^
14 дiб 30 дiб 90 дiб
АТФ, мкмоль/г 1.87±0.03 2.08±0.04 * 1.35±0.03 * 1.21±0.03 *
АДФ, мкмоль/г 1.26±0.03 1.35±0.06 1.11±0.04 * 0.98±0.03 *
АМФ, мкмоль/г 0.89±0.02 0.72±0.03 * 1.88±0.06 * 2.12±0.06 *
Сума aденiн-нуклеотидiв, мкмоль/г 4.02±0.09 4.14±0.18 4.34±0.15 4.31±0.13
Енергетичний потен^ал 0.621±0.007 0.663±0.014 * 0.438±0.016 * 0.394±0.011 *
Через 30 дiб вщ початку введення бтим щурам ш-трату натрю в^^чаеться суттеве зниження концентраци АТФ i АДФ - вiдповiдно на 27.8% (р<0,001) та 11.9% (р<0,02) - до 1.35±0.03 та 1.11±0.04 мкмоль/г. Вмiст АМФ зростае - в 2.1 рази (р<0,001) - до 1.88±0.06 мкмоль/г, що свщчить про обмеження акти-вностi ресинтезу АТФ у тканинах ясен.
Енергетичний потен^ал у цей термш зменшуеться
- на 29.5% (р<0,001)- до 0.438±0.016, що свiдчить про обмеження активности ресинтезу АТФ у тканинах ясен.
Така спрямованють зрушень збер^аеться в дина-мiцi розвитку хрошчноТ нiтратноï iнтоксикацiï. Най-бiльш тяжк порушення бiоенергетичних процесiв вiдмiчаються за умов 90-денного введення нiтрату на-трiю. В цей термiн вмют АТФ i АДФ зменшуеться -вщповщно на 35.3% (р<0,001) та 22.2% (р<0,001) - до 1.21±0.03 та 0.98±0.03 мкмоль/г. Концентрацiя АМФ зростае - в 2.4 рази (р<0,001) - до 2.12±0.06 мкмоль/г.
Енергетичний потен^ал у цей термш зменшуеться
- на 36.6% (р<0,001) - до 0.394±0.011, що свщчить про прогресування порушення ресинтезу АТФ у тканинах ясен.
Порушення бюенергетичних процеав у яснах за умов надлишкового надходження у оргашзм штрату натрю, вочевидь, опосередкуються утворенням продукту Ух метаболiзму - NO, який у великих концентра-^ях пригнiчуе у клiтинах активнють аконiтази в циклi трикарбонових кислот, мiтохондрiальних ферментних комплексiв (МФК) - НДЦН-убiхiноноксидоредуктази (МФК-1), сукцинат-убiхiноноксидоредуктази (МФК-2), ключового ферменту глiколiзу - глщеральдегщ-3-фосфатдегщрогенази [16]. Нiтрозилювання FeS груп (що беруть участь в транспорт електрошв вiд флавь нового компоненту на убiхiнон) в активному центрi МФК-1 i МФК-2 порушуе окиснення основних субстра-^в тканинного дихання. Не виключаеться шпбуюча дiя NO на iншi флавiновi ферменти, якi мiстять FeS центри (наприклад, ацидо-КоА-дегiдрогеназу, а-глiцерофосфaтдегiдрогенaзу). Акоштаза (акоштат-гiдротaзa) пригнiчуеться NO, ймовiрно, за рахунок зв'язування з юном двовалентного зaлiзa, що входить в активний центр цього ферменту.
Висновки
1. У динaмiцi хронiчноï штоксикаци нiтрaтом нaтрiю у тканинах ясен бтих щурiв вiдмiчaеться прогресивне збтьшення продукци супероксидного aнiон-рaдикaлa мiтохондрiaльним (починаючи з 14-Ï доби iнтоксикaцiï) та мiкросомaльним (на 90-ту добу штоксикаци) елект-ронно-транспортними ланцюгами. На 14-ту добу хро-
нiчноï iнтоксикaцiï штратом натрю в тканинах ясен виявляеться збтьшення активности антиоксидантного ферменту каталази без ознак активаци процеав пе-роксидного окиснення лiпiдiв. У подальшому (на 30-ту та 90-ту добу штоксикаци) спостер^аеться aктивaцiя цього процесу на iстотного зниження антиоксидантного потен^алу.
2. Тривале введення надлишковоТ кiлькостi нiтрaту нaтрiю пригшчуе енергетичний метaболiзм у тканинах ясен щурiв. У динaмiцi змiн енергетичного обмшу в яснах при хрошчшй нiтрaтнiй iнтоксикaцiï вiдмiчaеться певна фазнють: перiод aктивaцiï бiоенергетичних процесiв, що виявляеться зростанням енергетичного потен^алу, змшюеться на 30-ту добу експерименту перюдом Ух прогресуючого пригнiчення.
Лiтература
1. Годованець О.1. Особливостi клiнiчного переб^у хронь чного катарального гiнгiвiту в дтей, що проживають на територи з пiдвищеним рiвнем нiтрaтiв у питнш водi / О.1. Годованець, М.М. Рожко, З.Б. Попович // Галицький лкарський вюник. - 2007. - №3. - С.15-17.
2. Костенко В.О. Мехаызми порушення окисних процеав у тканинах при надлишковому утвореннi оксиду азоту з екзогенних попередниюв / В.О. Костенко, А.Г. Костенко, С. В. Денисенко [та Ы.] // КлЫ. та експ. патол. - 2004. -Т.3, № 2 (Ч.1). - C.202-204.
3. Методи шычних та експериментальних дослщжень в медицин / [ Л.В.Беркало, О.В.Бобович, Н.О.Боброва та ш.] ; За ред. 1.П.Кайдашева. - Полтава, 2003. - 320 с.
4. Реутов В.П. Цикл оксида азота как механизм стабилизации содержания NO и продуктов его превращения в организме млекопитающих / В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, А.И. Гоженко [и др.] // Актуал. пробл. трансп. мед. -2008. - № 1 (11). - С. 22-28.
5. Фера О.В. Особливост розвитку захворюваност орга-ыв ротовоТ порожнини серед дтей мюта Ужгород вком 6-12 роюв / О.В. Фера, М.О. Фера, Г.-С.1. Свалявчик, О.М. Рошко // Наук. вюн. Ужгородськ. ун-ту, Сер. «Медицина». - 2012. - Вип. 1. - С. 155-161.
6. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофо-тометрическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом / О.И. Цебржинский // Актуальн проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академи. - 2002. - Т. 2, №1. - C.96-97.
7. Чайковська 1.В. Роль порушень метaболiзму оксид азоту в пaтогенезi хроычного генерaлiзовaного пародон-титу / 1.В. Чайковська // Арх. клЫ. та експерим. мед. -2008. - Т. 17, № 2. - С. 226-228.
8. Шугалей И.В. Влияние интоксикации нитритом натрия на активность ферментов антиоксидантной защиты и процессы пероксидации в эритроцитах мыши / И.В. Шугалей, И.В. Львов, И.В. Целинский, В.И. Баев // Укр. биохим. журн. - 1992. - Т.64, №2. - C. 111-114.
9. Atkinson D.E. The energy charge of the adenylate pools as a regulatory parameter: Interaction with feedback modifiers / D.E. Atkinson // Biochemistry. - 1968. - V.7, №11. - P. 4030-4034.
10. Jaworeck D. Adenosin-5'-diphosphat und Adenosin-5'-monophosphat / D. Jaworeck, W. Gruber, H.U. Bergmeyer
TOM 16. N 5-6 2012 P.
// Methoden der enzymatischen Analyse. - Bd. II. - 14. Weinheim : Verlag - Chemie, 1974. - S. 2179-2181.
11. Kim Y.S. Superoxide reactivates nitric oxide-inhibited catalase / Y.S. Kim, S. Han // Biol Chem. - 2000. - V.381, 15. №12. - P. 1269-1271.
12. Lamprecht W. ATP; Bestimmung mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat - Dehydrogenase / W. Lamprecht, I. Trautschold // Methoden der enzymatischen Analyse. - 16. Bd. II. - Weinheim : Verlag - Chemie, 1974. - S. 21512159.
13. Monzani E. Binding of nitrite and its reductive activation to nitric oxide at biomimetic copper centers / E. Monzani,
G.J. Anthony, A. Koolhaas [et al.] // J Biol Inorg Chem. - 17. 2000. - V.5, №2. - P. 251-261.
Ponrdenz E. Alteration of antioxidant enzyme expression in response to hydrogen peroxide / E. Ponrdenz, R. Kahl // Free Radical Biol Med. - 1998. - V.24, №1. - P. 27-38. Sa Siqueira M.A. Nitric oxide and oral diseases: can we talk about it? / M.A. de Sa Siqueira, R.G. Fischer, C.M. da Silva Figueredo [et al.] // Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. - 2010. - V.8, №2. - P. 104-112. Shiva S. Nitric oxide partitioning into mitochondrial membranes and the control of respiration at cytochrome c oxidase / S. Shiva, P.S. Brookes, R.P. Patel [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci USA. - 2001. - V. 98, №13. -P. 72127217.
Szabo S. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics / C. Szabo, H. Ischiropoulos, R. Radi // Nature Reviews. - 2007. - V. 6. - P. 662-680.
Summary
THE CONDITION OF OXIDATION PROCESSES IN GINGIVAL TISSUES OF WHITE RATS IN THE DYNAMICS OF CHRONIC SODIUM NITRATE INTOXICATION A.M. Fartushna, V.O. Kostenko
Key words: chronic sodium nitrate intoxication, free radical oxidation, antioxidant system, energy metabolism, gum. 40 white rats were used to study the condition of free radical oxidation, antioxidant and energy metabolism in gingival tissues in the dynamics under chronic sodium nitrate intoxication (on the 14th, 30th and 90th days). It has been revealed that under the experimental conditions in gingival tissues the progressive increases in production of superoxide anion radical by mitochondrial (starting on the 14th day of intoxication) and microsomal (on the 90th day of intoxication) electron transport chains have been detected. On the 14th day of chronic sodium nitrate intoxication the increasing activity of the antioxidant enzyme catalase without activation of lipid peroxidation has been revealed in gingival tissues. Later on (the 30th and 90th days of intoxication) this process (increasing of the concentration of TBA-active compounds) was observed to become more active due to the significant reduction in antioxidant capacity (increase in the increment of TBA-active compounds concentration for the 1.5-hour incubation in the pro-oxidant buffer solution, and decrease in the catalase activity). Prolonged administration of excessive sodium nitrate inhibits the energy metabolism in the gingival tissues of rats (lowering of ATP and ADP concentration in the tissues, and decrease of AMP content). The dynamics of changes in energy metabolism in the gums under chronic nitrate intoxication enables to reveal certain staging: the period of activation of bioenergy processes, manifested by the growth of the energy potential, changes on the 30th day of the experimental period of their progressive depression.
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepiaë Hadiümoe do pedaKU,ii 15.11.2012 p.
