CC BY
17
Том 16. N 5-6 2012 р.
© Стасюк О.А., Костенко В.О. УДК 616.316-092.9 : 615.916'175
ВПЛИВ СКЕВЕНДЖЕР1В ПЕР0КСИН1ТРИТУ НА 0КИСНЮВАЛЬН1 ПРОЦЕСИ У ТКАНИНАХ СЛИННИХ ЗАЛОВ Б1ЛИХ ЩУР1В ЗА УМОВ СП1ЛЬН0Г0 НАДЛИШКОВОГО НАДХОДЖЕННЯ Н1ТРАТУ ТА ФТОРИДУ НАТР1Ю
Стасюк О.А., Костенко В.О.
ВДНЗУ «УкраТнська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
В эксперименте на 20 белых крысах массой 180-200 г исследована роль скэвенджеров пероксинитрита на уровень продукции супероксидного анион-радикала, состояние пероксидного окисления липидов, антиоксидантной защиты в тканях поднижнечелюстных слюнных желез крыс и их белоксинтезирующей функции в условиях со-четанного токсического действия нитрата и фторида натрия. Исследования проведены в таких сериях опытов: в первой - интактные животные (контрольная серия), во второй - после сочетанного введения нитрата натрия (200 мг/кг массы тела) и фторида натрия (10 мг/кг) в течение 30 суток, в третьей и четвертой - в период 30-дневной совокупной токсического действия нитрата и фторида натрия вводили скэвенджеры пероксинитрита - L-селенометионин (3 мг/кг 1 раз в неделю) и мочевая кислота (250 мг/кг 3 раза в неделю). Выявлено, что введение крысам L-селенометионина и мочевой кислоты в этих условиях снижает продукцию супероксидного анион-радикала (микросомальной и митохондриальной электронно-транспортными цепями) и активность пероксидного окисления липидов, улучшает состояние антиоксидантной защиты и белоксинтезирующей функции слюнных желез. Сделан вывод, что нарушение свободнорадикальных процессов в тканях подниж-нечелюстных слюнных желез на фоне бинарной хронической интоксикации нитратом и фторидом натрия являются пероксинитрит-зависимыми.
Ключевые слова: интоксикация нитратом натрия, интоксикация фторидом натрия, оксид азота, пероксинитрит, слюнные железы, супероксидный анион-радикал, пероксидное окисление липидов, антиоксидантная система.
За оцЫками науковц1в, у аграрно-промислових ре- р1внюе 3,7107 М"1с"1). Пероксиытрит легко проникае понах УкраТни значною проблемою е комбЫована д1я через лтщний бшар мембрани i мае значно бтьше
на органам людини та тварин неорганнних азотовмь сних сполук та фторид1в, що супроводжуеться випад-ками гострих та хроычних н1тратно-н1тритних Ытокси-кац1й та ендем1чного флюорозу [1,4].
В останн роки слинн залози (СЗ) розглядаються як важливий орган регуляцп утворення оксиду азоту (NO) у ктькосп, необхщнш для нормального функцю-нування протективних систем слизовоТ оболонки ор-гашв шлунково-кишкового тракту, пщтримання ¡Т цтю-носл [9]. Ктькють NO, що надходить у оргаызм 1з слиною, контролюеться мехашзмом ауторегуляци, вь домим як цикл оксиду азоту [6]. Поряд з NO-синтазним шляхом в СЗ NO утворюеться через шт-рат- та штритредуктазш реакцп [9]. Вважаеться, що саме ця складова циклу NO е ф1зюлопчно необхщною за умов зниження активност1 NO-синтаз, наприклад, за умов ппоксп [6].
У попередых роботах нами показано, що при введены фториду натр1ю на тл1 хрон1чноТ Ытоксикацп н1т-ратом натр1ю у тканинах СЗ порушуються механ1зми ауторегуляци р1вня NO в орган1зм1: типове для 1зольо-ваного призначення н1трату натрю пригн1чення актив-ност1 сумарних NOS змшюеться на зб1льшення Тх активности [7]. Так1 зм1ни можуть бути пов'язан1 з1 здатнь стю фторид-юыв пригн1чувати арг1нази - ферменти конкурентного (щодо NO-синтазного) неокисного шляху метабол1зму 1_-арг1н1ну [2].
Завдяки можливост продукц1Т надлишковоТ ктько-ст1 NO як з екзогенних, так i ендогенних попередник1в, виникае можливють утворення в реакц1Т з супероксид-
ним ан1он-радикалом ( О2) високоактивного перокси-н1триту (.ONOO-). Ця взаемод1я е найшвидшою з ус1х в1домих б1ох1м1чних реакц1й (константа швидкост до-
хiмiчних мiшеней, нiж N0 [14].
Проте у низьких концентра^ях .ONOO- виявляе регуляторнi та протекторы властивост щодо функцií ферментних систем i виживання клiтин, забезпечуе процес сигнально''' трансдукцií. Тому утворення ^N00- може частково нейтралiзувати пряму токсич-
ну дiю N0 або О2. Висок концентрацп ^N00- е ду-же токсичними, пригшчують мiтохондрiальнi фермен-тнi комплекси, викликають фрагментування бiлкiв через ытрування амiнокислот i лiпопротеíнiв [10,14]. Вь дома здатнiсть .0N00- позитивно впливати на утворення О2, пщтримуючи тим самим своерщне «поро-чне» коло.
Метою роботи було вивчення впливу скевенджерiв пероксиштриту (L-селенометiонiну та сечово' кислоти)
на рiвень продукци О 2 , стан пероксидного окиснен-ня лт^в (ПОЛ), антиоксидантного (АО) захисту в тканинах пщнижньощелепних СЗ щурiв та 'х бтоксин-тезуючо' функцп за умов сукупно' токсично' дií штрату та фториду натрiю.
Матерiали та методи дослщження
Дослiдження були проведет на 20 бтих щурах ль нií Вiстар масою 180-200 г у таких серiях дослiдiв: у першш - необхiднi показники вивчали у штактних тварин (контрольна серiя), у другiй - пюля сукупного вве-дення нiтрату натр^ (200 мг/кг маси тiла) та фториду натрю (10 мг/кг маси тта) протягом 30 дiб, у третм та четвертiй - протягом перюду 30-денно' сукупно' токсично' дм нiтрату та фториду натрiю вводилися
Проблеми екологц та медицини
скевенджери пероксинггриту - вiдповiдно L-селенометiонiн i сечова кислота.
L-селенометiонiн (виробництва "Sigma-Aldrich, Inc.", США) вводили внутрiшньоочеревинно в дозi 3 мг/кг [12] 2 рази на тиждень, сечову кислоту (виробництва "Sigma Chemical Co", США) вводили внутрш-ньоочеревинно в дозi 250 мг/кг [11] 3 рази на тиждень протягом перюду 30-денноТ сукупноТ токсично! дií нт-рату та фториду натрiю. Евтаназю тварин виконували методом дислокацiТ шийних хребцiв пiд ефiрним наркозом.
Утворення О2 у гомогенат СЗ оцнювали при проведеннi тесту з ытросишм тетразолieм з шдукто-рами у виглядi НАДН i НАДФН [8]. Рiвень ПОЛ у тканинах оцнювали по утворенню в реакцп тюбарб^уро-воТ кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забар-вленого триметнового комплексу до i пюля 1,5-годинноТ iнкубацiТ [5]. Активнють АО системи оцнюва-ли за приростом концентрацп ТБК-активних продуктiв за час пвторагодинноТ iнкубацiТ у залiзоаскорбатному буферному розчинi, а також за активнютю АО ферме-нтiв - супероксиддисмутази (СОД) та каталази [5].
Активнють у тканинах СЗ а-амтази визначали за методикою Каравея за допомогою набору реактивiв фiрми «Флат^агностика» (УкраТна, м. Днiпро-петровськ) [3].
Таблиця
Вплив скевенджер/в nepoKCUHimpumy на 3MiHU показниюв вльнорадикального окиснення, антиоксидантного захисту у тканинах шднижньощелепних слинних залоз шур/в та Тх секреторну функц/ю за умов надлишкового надходження Утрату та
фториду натр/ю (M+m, n=20)
Отриман дан пщдавали статистичтй обробц. Для nepeBip^ розподту на нормальнють було засто-совано розрахунок критерю Шашро-Втка. Якщо данi вiдповiдали нормальному розподту, то для ïx порiв-няння використовували t-критерм Ст'юдента для не-залежних вибiрок. У випадку, коли ряди даних не пщ-лягали нормальному розподту, статистичну обробку здмснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-В^нк Статистичнi розрахунки проводили з використанням програм "Microsoft Excel 2007" та "StatisticSoft 6.0".
Результата та ïx обговорення
Введення бтим щурам L-селенометюншу за умов бЫарноТ 30-денноТ iнтоксикацiï нiтратом i фторидом натрю достовiрно знижуе вироблення у тканинах СЗ
О 2 мiкросомальним та мiтоxондрiальним ЕТЛ (див. табл) - вщповщно на 23.9% (p<0,001) та 14.9% (p<0,01) у порiвняннi з даними друго'1' серп. При введены сечовоТ кислоти також достг^рно знижуеться
продукцiя у тканинах СЗ О 2 мiкросомальним та мь
тоxондрiальним ЕТЛ - вщповщно на 11.9% (p<0,01) та 19.7% (p<0,001) у порiвняннi з даними друго'1' сери.
Серп дослав
Показники lнтактнi Сукупне введення нтрату та фториду натрiю
тварини Контроль + L-селеноме-тiонiн + сечова кислота
Продукця О 2 , нмоль/ г х с
1мкросомальним ЕТЛ 15.86 ±0.53 21.12±0.34 * 16.07±0.69 ** 18.61±0.55 */**
мтохощ^алыним ЕТЛ 14.08±0.41 18.94±0.32 * 16.12±0.59 */** 15.21±0.51**
Концентрацiя ТБК-реактантв, мкмоль/г
до iнкубацiï 22.7±0.4 35.8±1.2 * 27.9±1.4 */** 28.5±1.3 */**
пiсля Ыкубацп 30.0±1.2 50.1±1.4 * 39.4±2.08 */** 39.8±1.77 */**
Прирiст 7.3±0.3 14.3±0.4 * 11.5±0.6 */** 11.3±0.5 */**
СОД, од. акт. 0.22±0.01 0.15±0.01 * 0.20 ±0.01 ** 0.22±0.01 **
Каталаза, мкат/г 2.89±0.10 2.34±0.07 * 2.72±0.11 ** 2.74±0.13 **
а-Амтаза, мг/год * г 70.32±1.97 60.11±1.89 * 68.14±2.00 ** 68.74±1.95 **
Прим1тка: * - р<0,05 у пор1внянн1 з даними ¡нтактних щур1в;
** - р<0,05 у пор1внянш з даними другоТ cepiï.
Обмеження генерацп О 2 мiкросомальним та мь тоxондрiальним ЕТЛ при дм скевенджерiв пероксишт-риту, вочевидь, вiдбиваe здатнiсть ONOO" порушува-ти у клiтинаx функцюнування цих ланцюгiв (нактиву-вати НАДН- та НдДФН-залежж оксидоредуктази, руй-нувати FeS-кластери) [14]. У мiтоxондрiяx пероксинт-рит окиснюе цiстеïновi та метiонiновi залишки бiлкiв, iнгiбуe комплекси I та II, аконтазу, АТФ-азу, Mn-СОД, креатинкiназу та глутатiонпероксидазу, знижуе рiвень вiдновленого глутатiону. Дисфункцiя мiтоxондрiально-го ЕТЛ вважаеться провщним чинником пперпродукцп
О 2 внутрiшньою мембраною мппхондрм [13].
Введення тваринам L-селенометiонiну на тгп хро-нiчноï iнтоксикацiï нтратом i фторидом натрiю досто-
вiрно зменшуе концентрацiю ТБК-реактантiв до Ыку-бацiï - на 22.1% (p<0,01), пiсля iнкубацiï - на 21.4% (p<0,01). Величина приросту концентрацiï ТБК-активних сполук за час пвторигодинноТ Ыкубацп у за-лiзоаскорбатному буферному розчин - знижуеться на 19.6% (p<0,01) у порiвняннi з даними друго'1' серiï.
Введення щурам сечовоТ кислоти на тлi xронiчноï Ытоксикаци нiтратом i фторидом натрiю також досто-вiрно зменшуе концентрацiю ТБК-реактантв до Ыку-баци - на 20.4% (p<0,01), пiсля iнкубацiï - на 20.6% (p<0,001). Величина приросту концентрацп ТБК-активних сполук за час ^вторигодинноТ Ыкубацп у за-лiзоаскорбатному буферному розчинi - знижуеться на 21.0% (p<0,001) у порiвняннi з даними друго'1' серiï.
Достовiрне зменшення приросту концентрацiï ТБК-активних сполук за час шкубаци при введенн скевен-джерiв пероксинiтриту вказуе на 1'хню здатнiсть обме-
Том 16. N 5-6 2G12 р.
жувати зниження АО потен^алу в тканинах СЗ при дм токсикан^в, що також пщтверджуеться достовiрним пщвищенням у тканинах активностi АО фермен^в. Так, при введеннi тваринам L-селенометiонiну на тлi хронiчноí iнтоксикацií ытратом i фторидом натрiю ак-тивнють СОД i каталази збiльшуеться - вщповщно на 33.3% (р<0,01) та 16.2% (р<0,02) у порiвняннi з дани-ми друго' сери. При введены сечово' кислоти актив-нють зазначених ферментiв - збiльшуеться вщповщно на 46.7% (р<0,001) та 17.1% (р<0,02) у порiвняннi з даними друго' сери.
0триманi результати вказують на той факт, що зростання у тканинах СЗ активносл ПОЛ та зниження АО потен^алу на ™ бiнарноí хронiчноí iнтоксикацií штратом i фторидом натрiю е пероксиштрит-залежними процесами. '0N00" окиснюе N4- i ЭИ-групи бiлкiв, ДНК, призводить до Ыактивацп фермен-^в (a1-iнгiбiтора проте'наз, тканинного iнгiбiтора ме-талопроте'наз тощо), пригнiчуе активнiсть Ои-7п-СОД i Мп-СОД шляхом нiтрування и тирозинового залишку, а також через зв'язування з мщдю i змшою и валент-ностi [14,15]. У присутност '0N00" утворюються т1Т-льн радикали глутатiону, в результатi чого останнш перетворюеться з антиоксиданту в прооксидант, який Уцтое процеси ПОЛ.
Введення тваринам L-селенометiонiну та сечово' кислоти на тлi бiнарноí хрошчно''' iнтоксикацií нiтратом i фторидом натр^ пiдвищуе у тканинах пщнижньоще-лепних СЗ активнють a-амiлази - вщповщно на 13.4% (р<0,02) та 14.4% (р<0,01) у порiвняннi з даними дру-го' серií.
З урахуванням результат власних дослiджень та даних лп"ератури [10,14,15] можна вiдмiтити таю основы мехашзми патогенно' дм '0N00": 1) порушення фосфорилювання тирозину; 2) ^^а^я втьнорадика-льних реакцм; 3) зниження антиоксидантного потен-^алу; 4) порушення функцií важливих бткових молекул; 5) посилення протеолiзу бiлкiв.
Висновки
1. Порушення втьнорадикальних процесiв у тканинах пщнижньощелепних слинних залоз на тл бша-рно' хронiчноí iнтоксикацií нiтратом i фторидом натрiю е пероксинiтрит-залежними.
2. Введення щурам скевенджерiв пероксинiтриту ^-селенометюншу та сечово' кислоти) за цих умов знижуе продук^ю супероксидного анюн-радикала (мь кросомальним i мiтохондрiальним електронно-транспортними ланцюгами) та активнiсть пероксидного окиснення лт^фв, покращуе стан антиоксидантного захисту та секреторно' функцп слинних залоз.
Лтратура
1. Белкова 1.В. Стан питноТ води та Tí вплив на виникнен-ня захворювань порожнини рота у населення Полтав-ськоТ областi / 1.В. Белiкова // Вiсн. соц. rir. та орг. охор. здор. - 2004. - №4. - С. 33-36.
2. Геворкян М.Л. Строение активного центра печеночной аргиназы млекопитающих. II. Субстраты и ингибиторы / М.Л. Геворкян, М.А. Давтян // Биолог. журн. Армении. -2008. - №4. - С. 16-26.
3. Лабораторные методы исследования в клинике / [Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотиницкая Р.П. и др.] - М. : Медицина, 1987. - 368 с.
4. Лаврушенко Л.Ф. Довктля, токсиканти у харчових продуктах та стан окисних процеав в органiзмi / Л.Ф. Лаврушенко // Експрес - новини: наука, технка, виробниц-тво. - 1998. - № 9-10. - С. 13 -14.
5. Методи шычних та експериментальних дослщжень в медицин / [ Л.В.Беркало, О.В.Бобович, Н.О.Боброва та ш.] ; За ред. 1.П.Кайдашева. - Полтава, 2003. - 320 с.
6. Реутов В.П. Цикл оксида азота как механизм стабилизации содержания NO и продуктов его превращения в организме млекопитающих / В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, А.И. Гоженко [и др.] // Актуал. пробл. трансп. мед. -2008. - № 1 (11). - С. 22-28.
7. Стасюк О.А. Змши окиснювального метаболiзму у слинних залозах щурiв за умов стильного надлишково-го надходження ытрату та фториду натр^ / О.А. Стасюк, В.О. Костенко // Актуальн проблеми сучасноТ ме-дицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. -2012. - Т. 12, №4. - C.197-171.
8. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофо-тометрическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом / О.И. Цебржинский // Актуальн проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2002. - Т. 2, №1. - C.96-97.
9. Björne H.H. Nitrite in saliva increases gastric mucosal blood flow and mucus thickness / H.H. Björne, J. Petersson, M. Phillipson [et al.] // J Clin Invest. - 2004. -V.113, №1. - P. 106-114.
10. Calcerrada P. Nitric oxide-derived oxidants with a focus on peroxynitrite: molecular targets, cellular responses and therapeutic implications / P. Calcerrada, G. Peluffo, R. Radi // Curr Pharm Des. - 2011. - V.17, №35. - P. 39053932.
11. Durante P. Effect of uric acid on nephrotoxicity induced by mercuric chloride in rats // P. Durante, F. Romero, M. Pérez [et al.] // Toxicol Ind Health. - 2010. - V.26, №3. -P. 163-174.
12. Laude K. NO produced by endothelial NO synthase is a mediator of delayed preconditioning-induced endothelial protection / K. Laude, J. Favre, C. Thuillez [et al.] // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2003. - V.284, №6. - P. H2053-H2060.
13. Murphy M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species / M.P. Murphy // Biochem J. - 2009. - V. 417. - P. 1-13.
14. Szabó S. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics / C. Szabó, H. Ischiropoulos, R. Radi // Nature Reviews. - 2007. - V. 6. - P. 662-680.
15. Zhang X. Peroxynitrite mediated oxidation damage and cytotoxicity in biological systems / X. Zhang, D. Li // Life Sci J. - 2006. - V.3, № 3. - P. 41-44.
Summary
EFFECT OF PEROXYNITRITE SCAVENGERS ON OXIDATIVE PROCESSES IN SALIVARY GLAND TISSUES OF WHITE RATS UNDER SODIUM NITRATE AND FLUORIDE COMBINED EXCESSIVE INTAKE O.A. Stasiuk, V.O. Kostenko
Key words: sodium nitrate intoxication, sodium fluoride intoxication, nitric oxide, peroxynitrite, salivary glands, superoxide anion radical, lipid peroxidation, antioxidant system.
The role of peroxynitrite scavenger on the level of production of superoxide anion radical, the state of lipid peroxidation, antioxidant defense in submandibular salivary gland tissue under combined sodium nitrate and fluoride excessive intake have been studied in the experiment on 20 white rats.
The study was performed in the series of experiments: the first - intact animals (control series), the second - after combined administration of sodium nitrite (200 mg/kg body weight) and sodium fluoride (10 mg/kg) for 30 days, in the third and fourth - introducrion of peroxynitrite scavenger - L-selenomethionine (3 mg/kg, 1 time per week), and uric acid (250 mg/kg 3 times per week) during the 30-day cumulative toxic effect of sodium nitrate and sodium fluoride. We have
npoSAeMH eKOAoriï Ta MejHUHHH
found that L-selenomethionine and uric acid introduction in these conditions results in the decrease of superoxide anion radical production (by microsomal and mitochondrial electron transport chain) and lipid peroxidation activity, improving the antioxidant defence and protein synthesis in salivary glands. It has been concluded that free-radical processes disturbances in submandibular salivary gland tissues under binary chronic intoxication with sodium nitrate and sodium fluoride are peroxynitrite-dependent.
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepiaë Hadiümoe do pedaKU,ii 15.11.2012 p.
