CC BY
90
Elman A.R.
STABLE ISOTOPE DIAGNOSTICS IN RUSSIA: RESULTS AND PROSPECTS. 13C-PREPARATIONS, DEVICES, METHODS
Moscow
In recent years in Russia the bases of powerful modern diagnostics of many dangerous diseases by a method of the breath tests with use of the preparations labeled by stable isotope of carbon 13C were developed. The technologies of obtaining 13C-preparations based on domestic isotope raw materials, will allow satisfying completely needs of Russia and many foreign countries. New devices for breath tests, and also diagnostic techniques (mainly, in the field of gastroenterology) will provide mass diagnostics of the population including preventive medical examination. The given results show high effectiveness of 13C-breath tests in diagnostics of GIT diseases, possibility and prospect of their use in oncology, endocrinology, pulmonology; detection of CNS diseases, cardiovascular system, in surgical practice and some other areas of medicine. The prospects of 13C-magnetic resonance methods usage for visualization of tumors, vessels, and study of metabolism processes and energy metabolism in an organism of human and animals with the use of 13C-biomarkers are presented. The most important features of the new domestic diagnostics are high precision, safety (both for patients and for the personnel), simplicity of carrying out the tests, and possibility of usage in different areas. Key words: 13C-carbon stable isotope; diagnostic drugs, devices and methods for breath tests; 13C magnetic resonance imaging; gastroenterology, oncology, endocrinology, vascular medicine.
Эльман А.Р.
СТАБИЛЬНО-ИЗОТОПНАЯ ДИАГНОСТИКА В РОССИИ: ИТОГИ И ПЕРСПЕКТИВЫ. 13С-ПРЕПАРАТЫ, ПРИБОРЫ, МЕТОДЫ
В последние годы в России разработаны основы мощного современного метода диагностики многих опасных заболеваний методом дыхательных тестов с использованием препаратов, меченных стабильным изотопом углерода 13С. Технологии получения 13С-пре-паратов, разработанные на базе отечественного изотопного сырья, позволят полностью удовлетворить потребности России и многих зарубежных стран. Новые приборы для дыхательных тестов, а также диагностические методики (главным образом, в области гастроэнтерологии) способны обеспечить массовую диагностику населения, в том числе, в ходе ежегодной диспансеризации. Приведенные результаты свидетельствуют о высокой эффективности 13С-дыхательных тестов
г. Москва
в диагностике заболеваний ЖКТ, о возможностях и перспективах их использования в онкологии, эндокринологии, пульмонологии, выявлении болезней ЦНС, сердечно-сосудистой системы, в хирургической практике и ряде других областей медицины. Представлены перспективы использования 13С-магниторезонансных методов для визуализации опухолей, сосудов, изучения процессов метаболизма и энергетического обмена в организме человека и животных с помощью 13С-биомаркеров. Важнейшими особенностями нового направления отечественной диагностики являются высокая точность, безопасность (как для пациентов, так и для персонала), простота осуществления тестов и разнообразие областей использования.
—---------д^СФС^з-------------—
~ 122 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
13С-Триглицериды
13С-Крахмал
Панкреатит
13С-Метацетин 13С-Аминопирин 13С-Кофеин 13С-Фенилаланин 13С-Тирозин Мониторинг печени, диагностика активности Р-450
13С-Бикарбонат Na Кислотность в желудке Обмен веществ (питание)
13С-Гликолевая кислота Диагностика желчных кислот
13С-Лейцин
13С-Формиаты
13С-Ацетаты
13С-Глюкоза
Метаболизм
аминокислот,
эндокринология
13С-Мочевина H. pylori
13С-Лактоза
13С-Ксилоза
Нарушение
бактериального
состава
1-13С-Каприловая кислота Перистальтика желудка
Рис. 1. Применение 13С-препаратов для медицинских дыхательных тестов; цветом выделены первые отечественные 13С-препараты (сейчас их около 20).
Стабильно-изотопные дыхательные тесты
В развитых странах диагностика заболеваний методом дыхательных тестов на базе изотопа углерода 13С существует уже более 15 лет. С момента одобрения FDA и EMEA в 1996 г. первого препарата для диагностики Helicobacter pylori (уреазный дыхательный тест на основе 13С-мочевины) перечень разрешенных препаратов постоянно растет. Число публикаций по стабильно-изотопной диагностике (СИД) насчитывает 2 тыс./год, главным образом, в гастроэнтерологии и онкологии, и удваивается каждые 10 лет. В настоящее время только в США ежегодно проводится 5-7 млн. дыхательных тестов на сумму $800 млн., в Европе создаются новые производства тест-наборов в масштабах до 3 млн. шт./год. Уреазный дыхательный тест
(УДТ) признан "Золотым стандартом" диагностики H. pylori [1].
Диагностика СИД основана на способности различных органов метаболизировать 13С-препараты с образованием 13СО2, который кровеносной системой переносится в легкие и может быть обнаружен в выдохе пациента с помощью настольных приборов - масс-спектрометров или ИК-анали-заторов. Диагноз ставят на основании превышения содержания выдыхаемого 13СО2 по сравнению с природным, либо на основе анализа фарма-кокинетичеких зависимостей выдыхаемого 13СО2 во времени. Природное содержание изотопа углерода 13С в любых объектах составляет ~1,1 % (рис. 2), при этом он не обладает радиоактивностью, как и обычный изотоп 12С.
—---------д^СФС^з-------------—
~ 123 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
68.6 g
1.30 Kg
Arv*
5-Ю g
5 Kg
1.50 g
Body weight 50.0 Kg
Heavier isotopes 225 g
Принцип проведения 13С-дыхательного теста очень прост [3, 4]: пациент прини-
Рис. 2. "Изотопный состав" человека [2].
мает С-препарат внутрь (в виде раствора, либо в форме диагностического завтрака) из расчета 1 мг на 1 кг веса и через определенное время собирает выдыхаемый воздух в специальную емкость (вакутейнер или мешочек); затем с помощью вышеуказанного прибора анализируют "нулевую" пробу (до приема муле(1): препарата) и пробы, собранные после
Д = 52-<5Ь (1)
где 81 и 62 - результаты анализов до и после приема 13С-мочевины. Значения 5 (в %о) вычисляют по формуле (2):
(13С/12С)
"»»’ I. ,||.
приема препарата. Классическим примером стал тест на обсемененность желудка
Н. pylori (УДТ), основанный на том, что фермент уреаза бактерии разлагает мочевину с образованием СОг, и после приема 13С-мочевины можно надежно определить изменение содержания изотопов 13С и 12С в выдыхаемом воздухе по фор-
Ссгс)
ст.
подставляя определяемые прибором величины изотопного отношения в образце (13С/12С)обр. выдыхаемого воздуха и в стандарте (13С/12С) СТ.. "Положительным" считают результат, при котором А > 5 %о.
(2)
Тест УДТ весьма эффективен: его чувствительность и специфичность достигают 98-99 % [5]. Кроме того, метод абсолютно безопасен в связи с неинвазивно-стью и отсутствием радиоактивных материалов (рис. 3).
~ 124 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
O
H2N-13C-NH2 + H2O
Уреаза Helicobacter pylori разлагает мочевину с выделением СО2
13CO2 (выдох)
13CO2 + 2NH3
H. pylori вызывает рак желудка и другие болезни ЖКТ
Дыхательные тесты
• неинвазивны (щадящие);
• чувствительны - до 98 %;
• специфичны - 98 %
Страна Ежегодное число тестов, тыс. Количество 13С-мочевины, кг
США 6 000-8 000 500-700
Европа ~1 000 80-100
В мире Более 10 000 -1000
УДТ - «Золотой стандарт» диагностики H. pylori
Рис. 3. Уреазный дыхательный тест на обсемененность H. pylori.
В России стабильно-изотопная диагностика отсутствует, отсутствуют зарегистрированные высокообогащенные 13С-препараты (99% 13С)' и приборы, а также утвержденные методики дыхательных тестов. Проводятся лишь отдельные работы, в основном, в исследовательских целях; при этом используются дорогие и труднодоступные импортные препараты и диагностическое оборудование2. В то же время, приказ МЗиСР РФ
от 25.08.2005 № 539 предусматривает повсе-
местное проведение диагностики населения методом УДТ. Следует добавить, что в 13С-препара-тах остро нуждается не только наше здравоохранение, но также криминалистика, судебно-медицинская экспертиза, спортивная и космическая медицина, экология и многие другие области деятельности.
1 Единственный зарегистрированный препарат "13С-Карбамид-тест" па основе 13С-мочевины с 30 %-м изотопным обогащением [б] в силу ряда причин пе может обеспечить массовой диагностики населения.
2 В основном, применяются ИК-анализаторы (IRIS-2, UBiT IR-300, HeliFAN, POCone, The Oridion BreathIDR) [4] и масс-спектрометры (HeliView, IsoPrime), а также опттогальванический спектрофотометр
LARA. Тест-наборы включают: емкость с 13С-препара-том; пробирки, уплотненные мягкой пластиковой пробкой (или герметизируемые пакетики), и трубочку для выдыхаемого воздуха (см. рис. 4); инструкцию по применению препарата. Чувствительность современных изотопных масс-спектрометров позволяет определять 1000 молекул СО2 в пробе анализируемого газа [7], т.е. величину порядка 10-17 % об. при анализе 1 мл газа (выдыхаемый воздух содержит ~0,04 % об. 13СО2).
—---------д^СФС^з-------------—
~ 125 ...
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
I Фаза теста
Выпить раствор
13с_
препарата
II Фаза теста
Выдохнуть воздух III Фаза теста
Отечественный анализатор отношения 13С/12С в выдыхаемом воздухе
Рис. 4. Проведение дыхательного теста с помощью ИК-анализатора3
Однако в последние годы ситуация резко изменилась. В период с 2007 по 2012 г.г. при содействии Правительства Москвы был выполнен 1-й этап НИОКР по созданию отечественной стабильно-изотопной диагно-стики4. В результате проведенных работ были разработаны технологии получения 30 13С-продуктов, в том числе 18 - медицинского назначения, разработаны и изготовлены опытные образцы прибора для массовой 13С-диагно-стики методом дыхательных тестов (рис. 4), проведена медицинская апробация ряда методов диагностики, главным образом, органов ЖКТ.
Рассмотрим основные диагностические методики, разработанные в ходе выполнения упомянутой программы.
Уреазный дыхательный тест на H. pylori является основным по масштабам применения среди современных методов 13С-диагно-стики, поскольку считается, что бактерия вызывает многочисленные заболевания ЖКТ вплоть до рака желудка5 [9] (а инфици-рованность населения в разных странах составляет от 50 до 80 %). УДТ является обязательной процедурой предполетной проверки экипажей космических кораблей. В ГНЦ РФ-ИМБП РАН разработан тест, позволяющий определить не только наличие или отсутствие активной H. pylori (по пороговому
3 Фотографии предоставлены В.И. Невмержицким
4 Работы выполнялись на основании межотраслевой Научно-технической программы Правительства Москвы по теме: "Новые методы и технологии ранней диагностики онкологических и других опасных заболеваний" под руководством "Научного и клинического центра "Интермедбиофизхим". Работы были инициированы специалистами научно-технической компании "Ростхим", являвшейся головной организацией по разработке методов синтеза 13С-продуктов для стабильно-изотопной диагностики и иных областей [8]. В работах принимали участие 16 научных организаций Москвы, включая институты РАН, РАМН, ВУЗы и ГНЦ.
5 Открытие этой бактерии и ее роли в возникновении болезней ЖКТ в 2005 г. было удостоено Нобелевской премии [10] (Б. Маршалл и Р. Уоррен).
—---------д^СФС^з------------—
~ 126 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
значению 5), но и степень обсемененности ЖКТ в широких пределах (рис. 5).
________________Диагностика Н. pylori
о
о
со ф ф
s
X
со
К
ф “ Ч m о О
х
о
ч
2
Заражен
ЗдороЕ;
12
10
8
6
4
2
0
Степень обсемененности
DOB4.
ф
"
••
•
■и"
-■
♦
ж ж
♦♦♦♦
• мет Нр «1 степень 2 степень •Зстенемь
Степень обсемененности
А Б
Рис. 5. УДТ с 13С-мочевиной (13С-карбамидом) на обсемененность ЖКТ H. pylori: (А) "традиционный" УДТ; (Б) тест на степень обсемененности.
Благодаря высокой чувствительности и на основе большого объема полученных данных, авторы предлагают рассматривать 4 типа результатов теста (по значению А): отсутствие активной H. pylori (менее 1 %о), 1 степень (от 1 до 4 %о), 2 степень (от 4 до 8 %о) и 3 степень (более 8 %о). При этом установлено, что максимальное значение А может достигать 80 %о. Важными факторами являются состояние желудка и время отбора проб: оптимальным признан отбор проб воздуха на 15 и 30 минутах после приема препарата.
В результате совместных работ сформированы требования к тест-набору, разработана готовая форма препарата "Гелико-тест" на основе 99 %-й 13С-мочевины (ГНЦ
NH
O13CH,
P450,
1/2O,
H3C
NH
Тест позволяет с высокой точностью определить параметры работы печени, оценить степень ее детоксикацион-ной активности и даже массу, что чрезвычайно важно в послеоперационный
"НИОПИК"), проведено изучение общей и хронической токсичности (МНИОИ им. П.А. Герцена, РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина РАМН), выполнен проект производства субстанции и подготовлены документы для регистрации препарата.
С учетом мирового опыта, а также при возобновлении всеобщей диспансеризации населения (и согласно приказу МЗиСР РФ № 539) потребности России в препарате "Гели-котест" могут составить десятки млн. тест-наборов в год (что эквивалентно 5-7 т/год 13С-мочевины).
Тест функционального состояния печени основан на метаболизме 13С-метацетина ее ферментными системами (СУР450) также с образованием 13СО2:
OH
+
H213CO
[O]
H13COO-
[O]
13,
CO_
(3)
период (после резекции). Разработанные математические модели позволяют различать все степени циррозов, гепатита и другие заболевания (рис. 6) [11].
~ 127 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
O
O
H3C
Рис. 6. Дыхательный тест функционального состояния печени.
Исследования на базе московской ГКБ № 1 им. Н.Н. Пирогова позволили получить количественные характеристики влияния ожирения печени на снижение ее детоксикационной активности. Результаты метацетинового теста при метастатическом поражении печени и в послеоперационный период позволяют с высокой точностью определить активность интактной ткани, а также наблюдать восстановление ее биохимических показателей.
13С-Метацетиновый тест функции печени
0.00 40 00 80.00 120 00
Время (МИН.)
Рис. 7. Октаноатный дыхательный тест.
—---------д^СФС^з-------------—
~ 128 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
В ГНЦ РФ-ИМБП РАН показана возможность использования метацеинового теста для изучения функциональной активности печени в условиях застоя в венозной системе брюшной полости (венозное полнокровие), достигавшихся размещением пациента в т.н. антиортостатическом положении (под углом -15° к линии горизонта) [12]. Метод позволяет изучать активацию желчевыделительной функции печени, а также определять ее полную (тотальную) метаболическую емкость, включая функционирующую и нефункционирующую (резервную) часть печени6.
Для диагностики эвакуаторной функции желудка по выведению твердой
пищи изучен тест с использованием 1-13С-октаноата натрия и 1-13С-каприловой (октановой) кислоты (рис. 7), метаболизм которых также протекает с образованием 13СО2.
При нарушении перистальтики желудка скорость его опорожнения уменьшается; при этом замедляется и метаболизм указанных препаратов, что вызывает снижение содержания 13СО2 в выдыхаемом воздухе по сравнению с нормой. Установлено, что по методическим соображениям предпочтительнее использовать 113С-октаноат натрия.
Для диагностики мальабсорбции жиров ферментами поджелудочной железы (панкреатическая липаза) применяют дыхательный тест с использованием 13С3-триок-таноина (тройного эфира глицерина и 1-13С-каприловой кислоты). Тест позволяет количественно оценить активность панкреатической липазы в тонком кишечнике, снижение секреции которой наиболее характерно для проявлений хронического панкреатита [3]. В связи с наличием 3-х меток 13С в молекуле препарата тест обладает повышенной чувствительностью. Сопоставление результатов теста с данными октаноатного теста (рис. 7) позволяет различить процессы гидролиза белковой пищи в желудке и тонком кишеч-нике7.
Дыхательный тест с 13С-бикарбонатом натрия в настоящее время рассматривается, как наиболее перспективная неинвазивная методика для определения кислотности в желудке, истинных энергозатрат организма
[О]
Я-13СИ3 ...
при эндокринной патологии, различных видах ожирения, а также для расчетов калорийности питания, что является актуальной проблемой в современной жизни [13]. Проведение дыхательного теста на фоне блокаторов и стимуляторов желудочной секреции позволяют использовать его в дифференциальной диагностике причин, вызывающих изменение секреторной активности слизистой желудка, а использование на фоне проводимой терапии позволит контролировать ее эффективность и воздействие лекарственных средств на слизистую желудка7. Кроме того, тест успешно применяется в пульмонологии для диагностики гиперкапнии (заболевание, вызываемое повышением уровня углекислого газа в крови) [14].
Впервые предложен дыхательный тест с 13С-формиатом натрия для дифференциальной диагностики работы ферментных систем СУР450 на разных стадиях печеночного метаболизма (рис. 8):
[О]
(4)
— H13COO" — HO13COO" — 13CO2 формиат бикарбонат
1 По данным Б.В. Афонина (2011-2012 г.г.).
По данным Б.В. Афонина (2012 г.)
~ 129 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых комму-
никаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390
Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию
Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Рис. S. Формиатный дыхательный тест неченочного метаболизма.
В сочетании с фармакокинетикой 13С-бикарбоната метод позволяет получить количественные значения параметров работы ферментных систем печени (константы скорости) на разных стадиях метаболизма (схема 4). При этом полученные параметры характерны для всех препаратов, имеющих
изотопную метку в метильной группе (таких как 13С-метацетин, 13С2-антипирин, 13С2-эритромицин). Рис. 8, в частности, показывает, что скорость биохимической реакции преобразования формиата в бикарбонат почти в 10 раз превышает все характерные скорости реакций в бикарбонатном пуле8
Подбор дозы 5-фторурацила с 2-13С-урацилом
X
о
ч
2
m
О
О
со
Ф
СО
*
о.
ш
Ч
о
О
0.0
Ноома
Normal (п = 287)
Пониженная активность ферментов: снизить дозу I
60.0 120.0 Time (minutes)
180.0
Рис. 9. Дыхательный тест на диабет.
8 По данным В.И. Невмержицкого (2009 г.).
—---------д^СФС^з-----------—
~130~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Дыхательные тесты с 13С-изотопоме-рами глюкозы, содержащими метку 13С в разных положениях молекулы глюкозы (и в различном количестве), позволяют диагностировать заболевания эндокринной системы, вызывающие нарушения углеводного обмена. На рис. 9 показаны результаты неинвазивного глюкозного теста у больных диабетом.
Различия в динамике образования 13СО2 в результате метаболизма 1-13С-глю-козы и 2-13С-глюкозы могут отражать, с одной стороны, неокислительный метаболизм
Большое значение при химиотерапии опухолей имеет правильный выбор дозы терапевтического препарата [15]. Так передозировка широко известного 5-фторурацила может вызвать сильный токсический эффект вследствие плохой работы ферментных систем, мета-болизирующих препарат. Безопасную дозу 5-фторурацила можно подобрать, используя дыхательный тест с микродозами (5 мг/кг) 2-13С-урацила, поскольку его метаболизм близок к метаболизму 5-фторурацила (рис. 10).
(гликолиз), протекающий в цитозоле (в цикле КАБР^ЧАБРН), а с другой стороны - окислительный метаболизм в митохондриях (в цикле Кребса). Так, исследуя работу ферментных систем, можно диагностировать функциональное состояние органов-ЖКТ (в т.ч. печени и поджелудочной железы), а также мышечной ткани и ЦНС. В частности, показана перспективность разработки указанных тестов для оценки инкреторной функции поджелудочной железы9.
Рис. 10. Подбор индивидуальной дозы препарата в онкологии.
Другим примером использования 13С-препаратов в диагностике онкологических заболеваний (с учетом также УДТ и 13С-ме-тацетинового теста) является применение
13С-глюкозы и 5а-(13С)-тимидина. Эти препараты встраиваются в цепи ДНК и служат индикаторами пролиферации опухолевых клеток.
9 По данным Б.В. Афонина (2012 г.).
—---------д^СФС^з-----------—
~131~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Приведенные результаты показывают, что создан значительный задел в организации отечественной стабильно-изотопной диагностики. Разработка собственных 13С-препара-тов, диагностических приборов и методик фактически ликвидирует отставание России в этой области от развитых стран. Осталось лишь провести медицинскую регистрацию указанных разработок...
Следует учесть, что организация производства 13С-препаратов не требует значительных капитальных затрат, поскольку необходимые количества соответствуют лабораторным масштабам (кроме 13С-мочевины).
В то же время, широкая номенклатура и высокие цены на мировом рынке (сотни долл. за 1 г вещества) делают эту продукцию крайне выгодной с экономической точки зрения.
Необходимо отметить участие в работах по данной тематике ведущих медицинских центров: ГНЦ РФ-ИМБП РАН, ММА им. И.М.
Сеченова, НИИ СП им. Н.В. Склифосовского,
ФМБА России, МКНЦ ЦНИИ Гастроэнтерологии, МНИОИ им. П.А. Герцена, ФГБУ Рис. 11 показывает различия в составе метаболитов дважды меченой глюкозы (1,2-13С2-глюкозы) для здоровой и опухолевой клеток [16].
"Научный центр здоровья детей" РАМН, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
13С-Магниторезонансная диагностика Успехи в развитии работ по стабильно-изотопной (13С) диагностике, в том числе, в области синтезов 13С-продуктов, открыли новые перспективы в изучении живых организмов, а также в диагностике опаснейших заболеваний, включая различные виды рака, болезни Альцгеймера, Канавана, заболевания кровеносных сосудов, эндокринной и других систем. Эти перспективы связаны с возможностью глубокого изучения метаболизма in vivo при различных патологиях с помощью 13С-биомаркеров методами, основанными на явлении 13С-ядер-ного магнитного резонанса (13С-ЯМР). Поскольку ядро изотопа 13С (как и ядро атома водорода - протон) имеет значение спинового числа 1/2, оно обладает магнитным моментом, и его сигнал регистрируется методом 13С-ЯМР.
1,2-
13
2-D-
(1.2-1ЭСг1 glucose tracer /
Glucose-6P
NADP
Fruclose
act ate
О
#
,3C02
Glutarric
Glyceialdehyde-3P ♦
■ Lactate-Pyruvate %
Acetyl-CO A
Krebs cycle ^
Citric acid
О
-kelogiutaraie
■ 'W NAUr 1 k и DO
:tose-6P
■Щ- Xylulose 4^
Huhurto/lP
L J MibOSe-HNAiDMA
^ rNADPH
Lipid synthesis -♦
Plasma 'nemtxane
Amino acids Proteins/
11.2-13C2] glucose tracer
Cell membrane-Circulation
13COo
, Fatty Lactate Acids
13CO-
■ ▼ NADP 1 * RibosenRNA/DN/
:tose-6P
-Ш' Xylulose ^
3ehvde-3P
V rNAOPH
Glyceraldehyde-3P — Lactate-Pyruvate
Acetyl-CoA
Krebs cycle ^
Citric acid
О
. a-ketoglutarate
Rlbose-RNA/DNA Lipid synthesis — ♦
Plasma membrane
e Fatty
Acids
Amino acids Proteins/
Здоровая
клетка
Панкреатическая
аденокарцинома
Рис. 11. Различие метаболизма 1,2-13С2-0-глюкозы в здоровой и опухолевой клетках. Красноватые цвета - усиленный метаболизм, серый и черный - ослабленный или отсутствующий.
~ 132 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Если ввести пациенту 13С-биомаркер эндогенной природы (меченый аналог вещества, участвующего в естественных процессах метаболизма, например - 13С-глюкозу), изотопная метка вскоре перераспределится между другими метаболитами, и можно будет измерить их концентрации 13С-магниторезонансным методом. Важно то, что такое перераспределение может происходить достаточно быстро, например,
при этом уровни метаболитов в пораженных органах и тканях существенно отличаются от нормы. Метод обладает явными преимуществами, поскольку позволяет измерить уровни тех метаболитов, которые характерны для вполне определенного заболевания и которые весьма непросто определить другими методами (учитывая необходимость отбора биожидкостей и сложность биохимических систем живых организмов).
вследствие усиленного метаболизма в опухолях;
В мае 2012 г. журнал Science опубликовал данные о скорости процессов поглощения и выделения 111 различных метаболитов для 60 видов опухолей [17] (рис. 12). Анализ этого материала показал, каким видам опухолей соответствуют те или иные соотношения метаболитов. Появились даже так называемые "карты метаболитов" (или SIDMAP - Stable Isotope-based Dynamic Metabolic Profiling) [16]. Например, скорости выделения аденозина клетками с меланомой (рак кожи и слизистых) на порядок выше, чем у клеток с лейкемией (рак крови); а для другого метаболита - орнитина эта скорость в сотни раз больше, чем у аденозина для всех видов опухолей.
Аденозин
60 Типов опухолей
8 0 06 I
s 004 ш
Ъ
£ 002
'S
О
В
S
• *
і
с
б
Поглощение Выделение
Рис. 12. Относительные скорости поглощения и выделения 111 метаболитов для 60 типов культур раковых клеток (consumption and release - CORE profiling).
—----------д^СФС^з------------—
~ 133 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
При раке легких в пораженных клетках, в отличие от здоровых, наблюдаются очень высокие концентрации молочной и янтарной кислот, а также глютаминовой и некоторых других аминокислот, тогда как концентрации глюкозы понижены (рис. 13) [18]. Установлены "характеристические" значения уровней метаболитов для рака груди, мозга,
печени, толстой кишки, яичников, простаты. Многие из этих результатов получены именно с помощью спектроскопии 13С-ЯМР и оказались весьма информативны для диагностики заболеваний на основе анализа состава 13С-мета-болитов.
Cancer
Ш
Ы -
Ч 5
X V, О £
iS4>CL ><< О.* Х<
30 5 о 1\| ,
jiXjLUI_Jw
Non-cancerous
100
-г-90
~~г~
80
~г-70
-г-1 60
50
—1 40
~I-'
30
-г-'
20
3С Chemical Shift (ppm)
Рисунок 13. Высокий уровень 13С-метаболитов в клетках с раком легких по сравнению с их уровнем в здоровых клетках (результаты 13С-ЯМР анализа экстракта клеток пациента).
Эта работы открывают большие перспективы для диагностики опухолей 13С-магни-торезонансным методом. Уже опубликованы результаты клинического применения такой диагностики. Так, записывая сигналы 13С-ЯМР 13С-креатина и 13С-холина после введения пациенту 13С-глюкозы, с помощью методов математической обработки удалось
получить четкое изображение опухоли мозга (глиобластомы) на обычной томограмме, где эта опухоль не видна (рис. 14А) [19]. Однако такие работы пока еще редкость: значительно больше исследований выполняется на животных (крысы, мыши, собаки) (рис. 14Б) [20].
—---------д^СФС^з-------------—
~ 134 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Диагностика опухоли мозга
LaJ. . jJU—
Jj- gJL
V'H
- лдЛ- jJuL aJUL JLv- JL— Д —
лХІ а,ХлІ— - v wj—-
^-sA*J— — xJLL *AJl. /
. -4A-4L- — ^X- лО— if*
Глиобластома
В направлении стрелки креатин/холин (Cr/Cho) растет, (Cr/Cho - max, NAA - min) N-ацетиласпартат (NAA) - падает
Обнаружение опухоли (лимфомы) у мыши
7.3
7.1
6.9
6.7
6.0
pH
Опухоль выявлена 13С-бикарбонатом натрия по измерению кислотности с помощью 13С-ЯМР
Рис. 14. Визуализация опухолей методом 13С-ЯМР с помощью 13С-биомар-керов. Верхний ряд: (А) обследованная область МРТ-снимка мозга;
(В) совокупность (7х7) сигналов 13С-ЯМР-спектров 13С-метаболитов
Сг, СЬо и КАЛ в обследованной области; (С) изображение опухоли в результате математической обработки спектров. Нижний ряд: изображение лимфомы, привитой мыши (область опухоли обведена контуром); опухоль повышает кислотность среды и может быть обнаружена реакцией сКаН13С03.
—---------д^СФС^з-------------—
~ 135 ...
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
В настоящее время конструируются датчики для обследования человека, например, в форме подголовника для исследования мозга (рис. 15) [21], изучаются режимы записи резонансных сигналов, разрабатываются методики введения 13С-препаратов -как внутривенно, так и путем обычного приема внутрь в виде таблетки, раствора и т.п.
А
Следует подчеркнуть, что для записи спектров 13С-ЯМР используют обычные серийные томографы. И не далеко время, когда мы сможем "увидеть" в организме то, что не под силу обычному МРТ, не прибегая к рентгеновским лучам, радиоактивности или иным "сильным" (а порой и разрушительным) воздействиям.
После введения 1-13С-глюкозы \ \ \ /
с
Вот они!
J
Сі/СІю
***WA
VV’
Glycerol
""Г"...I..... 1
180 170 160
До введения
100
г-р-гт
во
ppm
Н“г
80
Glc - глюкоза
Glu - глютамат
Gln - глютамин
NAA - N-ацетиласпартат
Cr- креатин
Cho - холин
Asp - аспартат
Рисунок 15. 13С-Магниторезонансная диагностика:
(А) катушка-подголовник для исследования мозга; (Б) введение 1-13С-0-глюкозы выявляет метаболиты в мозговой ткани: широкополосное возбуждение позволяет детектировать метаболиты, обогащенные изотопом 13С (кроме глюкозы - бикарбонат, глютамат, глютамин, аспартат), которые ранее в мозге человека не обнаруживали; всего обнаружено более 20 метаболитов с помощью клинического томографа 1,5 Т.
Уже более десяти лет публикуются работы
об огромном увеличении чувствительности 13С-магниторезонансной диагностики, если использовать так называемую процедуру гиперполяризации магнитных моментов ядер 13С. Не вдаваясь в подробности, отметим только, что при этом значительно возрастает доля ядер, 13С реагирующих на магнитное поле томографа, что приводит к увеличению интенсивности сигнала в 10000-100000 раз!
(рис. 16) [22]. А в этом случае можно получать уже не только спектры (чтобы потом накладывать их на снимки МРТ), а столь же качественные снимки внутренних органов, порой даже превосходящие по качеству обычные снимки МРТ (рис. 16) [23]. Метод 13С-МРТ активно развивается, при этом даже используются современные российские
устройства, в частности, СВЧ-генератор ELVA-1 из С.-Петербурга [24, 25].
—---------д^СФС^з------------—
~136~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
А
Магнитный момент ядер 13С
---------Р-
Магнитный момент электронов переносится на ядра 13С
о.
ф
I
о
Тепловое равнове-
Б
Гиперполяризация спи-
Почечная а оте о ия
13
С
Вся кровеносная система
Катетер с 13С-гидрокси-этилакри- 13С-Мочевина,
латом (13СГЭА) 0.7 мМ/кг
Рис. 16. 13С-Магниторезонансная томография (13С-МРТ) с помощью гиперполяризации (ГП) магнитного момента ядер 13С: (А) принцип ГП методом динамической поляризации ядер; (Б) 13С-МРТ снимки инфузии ГП-13С-гидроксиэтилакрилата по катетеру, введенному в почечную артерию свиньи (слева) и кровеносной системы мыши после внутривенного введения ГП-13С-мочевины (справа).
Необходимо отметить, конечно, что существенной проблемой создаваемого метода 13С-МРТ является сравнительно небольшое время сохранения гиперполяризованного состояния 13С-биомаркера: от десятков секунд до нескольких минут (в зависимости от строения 13С-биомаркера). Однако разработанные методики уже позволяют за это время получить десятки и сотни высококачественных снимков. Кроме того, отсутствие радиоактивных веществ, дорогих и массивных синхротронов, а также жестких ограничений по времени (поскольку многие радиофармпрепараты быстро распадаются и теряют свою активность) делают этот метод значительно дешевле и безопаснее по сравнению с позитронно-эмиссионной томографией
(ПЭТ) - одним из наиболее мощных методов современной медицинской диагностики.
Таким образом, в результате проведенных работ созданы основы отечественной стабильно-изотопной медицинской диагностики опасных заболеваний методом дыхательных тестов и показаны перспективы разработки нового мощного метода визуализации внутренних органов, тканей, систем и новообразований - 13С-магниторезонансной диагностики. Впервые в нашей стране разработаны методы получения разнообразных 13С-продуктов (табл. 1) высокого качества, принадлежащих к разным классам соединений, в основном - медицинского назначения.
—---------д^СФС^з-------------—
~ 137 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Табл. 1. 13С-Продукты, синтези рованные в период 2007-2012 г.г.
13С-Мочевина Этиленкарбонат (13С-карбонил)
1-13С-Каприловая кислота Пропиленкарбонат (13С-карбонил)
1-13С-Октаноат натрия 1-13С-Каприловый альдегид
Триоктаноин (13С3-карбонил) 1,4-13С2-Янтарный ангидрид
Метацетин (13С-метокси) 1,4-13С2-Янтарная кислота
1-13С-Б-Глюкоза 1-13С-Б-Манноза
2-13С-Б-Глюкоза 1-13С-Б-Арабиноза
1,2-13С2-Б-Г люкоза Диметилфталат (13С2-карбонил)
1,3-13С2-Б-Глюкоза 4-Третбутилдиметилфталат (13С2-карбонил)
2,3-13С2-Б-Глюкоза Фталевая кислота (13С2-карбокси)
Тимидин (13С-метил) 4-Третбутилфталевая кислота (13С2-карбокси)
13С-Бикарбонат натрия 13С-Метанол
13С-Формиат натрия 13С-Метилиодид
1,4-13С2-5-Аминолевулиновая кислота 13С-Нитрометан
1,4,5-13С3-5-Аминолевулиновая кислота Монооксид 13С-углерода
Организациями-разработчиками выпущены технологические регламенты производства 13С-продуктов, разработаны ТУ, проекты фармакопейных статей и другая нормативно-техническая документация. Созданы установки по производству 13С-продуктов для медицины в укрупненном масштабе, включая 13С-мочевину в объеме 120000 тестов УДТ, 1-13С-кап-риловую кислоту в объеме 7000 тестов, а также установки для наработки 13С-изотопомеров Б-глюкозы, 13С-ме-тацетина и других важных продуктов для стабильно-изотопных дыхательных тестов. На базе синтезированных 13С-продуктов медицинские организации разработали надежные методики диагностики, в том числе, не имеющие аналогов в мировой практике. Все разработанные методы синтеза и технологии оригинальны и защищены патентами РФ. Россия обладает крупнейшим в мире производством стабильных изотопов, в отличие от многих стран, вынужденных импортировать изотопную продукцию. Это ключевое преимущество позволяет обеспечить отечественную медицину столь необходимыми 13С-препаратами, импорт которых весьма дорог. Кроме того, разработанные процессы производства 13С-препаратов, а также прибо-
ров характеризуются высокой эффективностью: их себестоимость во много (порой - в десятки) раз ниже существующих мировых цен, и собственное производство значительно выгоднее, чем закупки по импорту. Все эти обстоятельства позволяют в кратчайшие сроки развить в России стабильноизотопную (13С) диагностику для использования в самых разных областях медицины, как с помощью дыхательных тестов, так и посредством визуализации внутренних органов, тканей и систем 13С-маг-ниторезонанс-ными методами. Освоение серийного выпуска 13С-препаратов и приборов и их широкое внедрение в медицинскую практику способно удовлетворить растущие потребности здравоохранения не только России, но и зарубежных стран.
—---------д^СФС^з-------------—-
~ 138 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
ЛИТЕРАТУРА
1. Current European concepts in the management of Helicobacter pylori infection. The Maastricht Consensus Report // Gut, 1997, V. 41, P. 8-13.
2. URL: http://www.textronica.com/basic/iso-
tope human.htm.
3. Рапопорт С.И., Шубина Н.А., Семенова Н.В. 13С-Дыхательный тест в практике гастроэнтеролога. М.: ИД-МЕДПРАКТИКА-М, 2007.
4. Modak A.S. Stable isotope breath tests in clinical medicine: a review // J. Breath Res., 2007, V. 1, P. R1-R13.
5. Gisbert J.P., Pajares J.M. Review article: 13C-urea breath test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection - a critical review // Aliment. Pharmacol. Ther., 2004, V. 20, P. 1001-1017.
6. Костина Г. Спасительный выдох // Эксперт,
2008, № 29, URL: http://expert.ru/ex-
pert/2008/29/spasitelnuy vydoh.
9. Кудрявцева Л.В., Щербаков П.Л., Иваников И.О., Говорун В.М. Helicobacter pylori-инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей). М.: 2004.
10. URL: http://www.nobelprize.org/no-
bel prizes/medicine/laureates/2005.
11. Новрузбеков М.С., Донова Л.В., Ходарева Е.Н., Андросова М.В., Чжао А.В., Невмержицкий
B.И. Прогностические критерии печеночной недостаточности после резекции печени при ее очаговом поражении // Анн. хирур. гепатол., 2009, Т. 14, № 1, С. 41-48.
12. Афонин Б.В., Ермоленко А.Е., Иноземцев
C.Л. Функциональное состояние печени при моделировании гемодинамических эффектов невесомости в организме человека // Физиология человека, 2012. Т. 38. № 4. С. 1-6.
13. Benzo R., Kurogi Y., Modak A. A non-invasive bicarbonate breath test (SBT) to rapidly evaluate arterial paCO2. // Eur. Respir. J., 2004, V. 24, No. 48, Р. 2081.
14. Modak A.S., Reid J.M., Williams L.A., Hobbs G.R. A simple non-invasive method to detect and monitor hypercapnia: the sodium [13C]bicarbonate breath test // Isotopes in Environmental and Health Studies, 2007, V. 43, No. 1, P. 23-29.
15. Hirth J., Watkins P.B., Strawderman M., Schott
A., Bruno R., Baker L.H. The effect of an individual’s
cytochrome CYP3A4 activity on docetaxel clearance // Clin. Cancer Res., 2000, V. 6, P. 1255-1258.
16. Boros L.G., Serkova N.J., Cascante M.S., Lee W.-N.P. Use of metabolic pathway flux information in targeted cancer drug design // Drug Discov. Today, 2004, V. 4, P. 435-443.
17. Jain M., Nilsson R., Sharma S., Madhusudhan N., Kitami T., Souza A.L., Kafri R., Kirschner M.W., Clish C.B., Mootha V.K. Metabolite Profiling Identifies a Key Role for Glycine in Rapid Cancer Cell Proliferation // Science, 2012, V. 336, P. 1040-1044.
18. Fan T.W.M., Lane A.N., Higashi R.M., Farag1 M.A., Gao H., Bousamra M., Miller D.M. Altered regulation of metabolic pathways in human lung cancer discerned by 13C stable isotope-resolved metabo-lomics (SIRM) //Mol. Cancer, 2009, V. 8, P. 1-19.
19. Sorensen A.G. Magnetic Resonance as a Cancer Imaging Biomarker // J. Clin. Oncol., 2006, V. 24, P. 3274-3281.
20. Kurhanewicz J., Vigneron D.B., Brindle K., Che-
kmenev E.Y.,
Comment A., Cunningham C.H., DeBerardinis R.J., Green G.G., Leach M.O., Rajan S.S., Rizi R.R., Ross
B.D., Warren W.S., Malloy C.R. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research // Neoplasia, 2011, V. 13, P. 81-97.
21. Ross B., Lin A., Harris K., Bhattacharya P., Schweinsburg B. Clinical experience with 13C MRS in vivo // NMR Biomed., 2003, V. 16, P. 358-369.
22. Mansson S., Johansson E., Magnusson P., Chai
C.-M., Hansson G.,
Petersson J.S., StahlbergF., Golman K. 13C Imaging - a new diagnostic platform // Eur. Radiol., 2006, V. 16, P. 57-67.
23.Golman K., Ardenkjsr-Larsen J.H., Petersson J.
S., Mansson S.,
Leunbach I. Molecular imaging with endogenous substances // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, V. 100, P. 10435-10439.
24. Ardenkjsr-Larsen J.H., Fridlund B., Gram A.,
Hansson G.,
Hansson L., Lerche M.H., ServinR., Thaning M., Golman K. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, V. 100, P. 10158-10163.
—---------д^СФС^з-------------—-
~ 139 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
