CC BY
32
РАЗРАБОТКА МОДИФИЦИРОВАННОГО НЕИНВАЗИВНОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI
Цодиков Г.В.1, Зякун А.М.2, Морозова Н.А. 1 1 МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, email: [email protected] 2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН
Представлена технология модифицированного уреазного дыхательного теста с 13С-мочевиной и доказательства ее диагностической точности. В основе - добавление к 13С-мочевине лимонной кислоты с низким содержанием природного 13С-изотопа.
Инфицированность НеНсоЬаСег ру1оп ( Hp) взрослого населения России составляет 70-92% [1,2]. С Нр связывают развитие хронических воспалительных и эрозивно-язвенных поражений верхнего отдела желудочно-кишечного тракта. Для большинства отечественных лечебных учреждений «золотым» стандартом остается морфологический метод исследования, чувствительность и специфичность которого составляет 90-95% [3], а достоверность его повышается на 5% с изучением каждого дополнительного биоптата. В стремлении предупредить ятрогенный путь передачи инфекции, избавить пациента от необходимой повторной эндоскопии с биопсией слизистой оболочки предпочтение
13
отдается неинвазивным методам детекции Нр, к которым относится С-уреазный дыхательный тест (УДТ) [3]. В основе метода лежит регистрация возрастающего
13
«количества» СО2 в выдыхаемом воздухе после приема мочевины, содержащей повышенное количест во стабильного 13С - изотопа по сравне-нию с его природным содержанием в организме.
Данная методика не обременительна для пациентов, проста в исполнении для медицинского персонала, но предусматривает использование специальной аппаратуры для анализа изотопных вариаций углерода на уровне природных концентраций [4].
Цель работы заключалась в модифицировании неинвазивного 13С - УДТ в сравнении с зарубежными и изучении чувствительности, специфичности предложенного метода.
Материалы и методы
13
Методы неинвазивной диагностики с использованием С - мочевины предусматривают отбор проб выдыхаемого воздуха до приема 13С - мочевины ( per os) и через 30 минут после однократного приема 75-100 мг тестового препаратах [5].
13
В России до 2003 г. С - мочевина не производилась, что сдерживало его разработку и внедрение в практическое здравоохранение. Модификациия 13С УДТ для снижения количества используемой импортной 13С-мочевины без потери достоверности получа-емых данных, проведена за счет использования в качестве пробного завтрака лимонной кислоты, с известным изотопным составом [6]. Прием лимонной кислоты давал ряд эффектов: "закисление" желудка, удлинение контакта изотопа с телом и дном желудка, активизация уреазной активности Нр, потенцирование поступления «эндогенной» мочевины в желудок за счет индукции цикла трикарбоновых кислот [6]. В результате отбора оптимального сорта лимонной кислоты (ЛК), предпочтение отдано ЛК с понижен-ным содержанием изотопа 13С с заметно обедненной 13С относительно базальной СО2 [6]. Для проверки этого предположения проведено определение Нр указанными выше двумя методами одной и той же группы лиц (15 человек), страдавших язвенной болезнью.
Всем пациентам проведено эндоскопическое исследование с прицельной биопсией слизистой оболочки желудка. Нр определялся по общепринятому методу
- окраской гистологических препаратов гематоксилином и эозином. Всем выполнен УДТ в двух вариантах: точечный с дозой 75 мг импортной мочевины и кинетический с 20мг 13С - (импортной) мочевины с измерением содержания 13СО2 в порциях выдыхаемого воздуха с помощью масс-спектрометрии. Параллельно применяли ПЦР на ДНК Нр в биопсийном материале и кале пациента, бактериологический и морфологический методы.
При двухразовом анализе изотопного состава СО2 в выдыхаемом воздухе
13
пациента одно измерение изотопного СО2 проводили до приема С - мочевины, второе - через 30 мин. после приема препарата. Пациент принимал натощак 150 мл апельсинового сока, а через 30мин.- 75мг 13С - мочевины. Второй вариант УДТ предусматривал многократную регистрацию изотопного состава СО2 после приема
13 13 13
С-препарата по сравнению с содержанием С-изотопа в СО2 до приема С-
13
мочевины. Пациент натощак принимал 20 мг С - мочевины и 2 грамма лимонной кислоты, растворенных в 150 мл кипяченной воды. Каждая порция выдыхаемого воздуха после приема раствора 13С-мочевины собиралась на 10-й, 15-й, 20-й, 25-й, 30-й, 40-й, 60-й минутах в отдельную стеклянную емкость объемом 50 мл, которая затем герметично закрывалась резиновой пробкой. Всего собиралось по 8 проб. На основании этих показателей устанавливалась кинетика выделе- ния 13С углекислого газа в выдыхаемом воздухе.
Проверка сохранности газа в такой емкости показала возможность ее хранения до нескольких недель без потери информативности. Путем криогенной дистилляции в вакууме количественно отделяли метаболическую углекислоту от других газов и паров воздуха, затем вводили в масс-спектрометр (СН-7 Вариан, Германия). В обоих случаях количественные изменения содержания 13С-изотопа в СО2 (5) определяли с помощью выражения 513С =( Я /Д0-1)х1000%, где Яо/Я
13 12 13
отражало содержания С и С изотопов в СО2 до приема и после приема С -мочевины. Величина ошибки измерения разности в содержании 13С в анализируемой углекислоте относительно лабораторного стандарта не превышала 0,3 %0 . Обследовано 15 пациентов (12 мужчин и 3 женщины) в возрасте от 19 до 70 лет , страдавших язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в стадии обострения в течение 3-40 лет. Диагноз подтвержден эндоскопическим исследованием, анамнестическими данными.
13
Результаты и обсуждение: после приема лимонной кислоты с С-
13
мочевиной изо - топный состав СО2 имел пониженное содержание С при отсутствии Нр (рис. 1).
3
1 1
/ \
/
2
а^^х^'йГ''" "фэ а
\ ^^
г. 2
---.--------.---___^ НИН
■3 10 20 30 40 50 60
Рис. 1. Кинетика изотопного состава выдыхаемой углекислоты обследуемых пациентов в зависимости от времени наблюдения после приема через рот 13С-мочевины.
1 - кривая выхода 13СО2 с высокой степенью уреазной активности на 25 минуте;
2 - кривая со следовой реакцией выделения 13СО2 на 30 минуте;
3 - у обследуемого больного Нр-инфекция отсутствует
При наличии бактерий в желудочно-кишечном тракте отмечено сначала увеличение содержания 13С в выдыхаемой углекислоте, а затем его постепенное
13
снижение до исходного уровня. Положение максимума выноса СО2 на временной шкале существенно различалось. Для большинства больных максимум выноса 13СО2 с выдыхаемым воздухом достигал через 15 минут, а у больных язвенной болезнью - в пределах 20-40 минут.
Результаты УДТ с различными дозировками мочевины (75мг и 20 мг на пробу) оказались сопоставимыми и положительными в 100 % случаев. Однако выявлены некоторые различия показателей УДТ и других методов исследования, сопровож- дающихся изучением биопсийного материала (табл. 1).
Таблица 1. Результаты определения Нр инфекции у пациентов с помощью инвазивных и неинвазивных методов (до эрадикационной терапии)
Больной Фам. Возраст ПЦР на Нр в кале ПЦР на Нр в би-оптате Микро биологический метод УДТ 75 мг УДТ + 20 мг лимон.к-та Морфологич. метод (степень обсеменения Нр ) х10 х 15
В. 23г + + + + + 2-3
Б. 45л. + + - + + 2-3
С. 38л. + + + + + 3
Х. 22л + + + + + 3
Ш. 24г + - + + + 2-3
К.70л + + + + + 3
Д.59л. + + + + + -
Х. 30л + + - + + 3
Т.68л + + - + + 3
Р.27л + + - + + 3
С. 20 + + + + + 3
К.20г. - - - + + 3
М.19л + + + + + 1
З.21г. - - - + + 1
Ж.41г. + - - + + 1
" + " положительный ответ, " - " отрицательный ответ.
13
Различия между показателями С-УДТ и результатами микробиологического метода, а также ПЦР на ДНК Нр в биоптате объянены ограниченным количеством биопсийных кусочков с разной обсемененностью слизистой оболочки Нр, а также артефактами в сохра-нении активных культур в анаэробной среде при доставке ее в микробиологическую лабо - раторию. Полученные результаты микробиологического метода коррелируют с частотой выделения чистой культуры Нр по данным мировой литературы, которая колеблется от 33 до 97%. Этот фрагмент работы позволил в последующем использовать тестовый препарат для УДТ на Нр в количестве 20мг и обследовать в 3 раза больше пациентов, чем ранее предложенным способом. Для точечного УДТ пороговым показателем считается 5%0 -СО2 5, а для кинетического УДТ этот
показатель составил > 2 %о , т. е, в два раза выше ( рис. 2 ). На основании
проведенных исследований установлено, что разработанная методика 13С УДТ с
13
использованием 20 мг С мочевины и лимонной кислоты с определенным
13
изотопным составом, показала аналогичные результаты с исходным С УДТ, в котором использовалась нагрузка в 75мг. Нам удалось добиться снижения тестовых доз 13С-мочевины без снижения информативности и чувствительности метода за счет индукции цикла трикарбоновых кислот лимонной кислотой *.
Рис. 2. График изотопных вариаций 13С в выдыхаемой углекислоте А - точечный 13С-УДТ с пороговым показателем 5%0 Б - кинетический 13С-УДТ с пороговым показателем 2%0
Заключение
УДТ является интегральным показателем уреазной активности, легко воспроизводим для медицинского персонала, при этом достоверность результатов УДТ сопоставима с результатами современных методов выявления Нр (морфологический, ПЦР, бактерио-логический). Микробиологический метод диагностики Нр требует особо тщательного соблюдения условий хранения, транспортировки и последующего посева на элективные среды. Основная причина негативных результатов заключается в особенностях соблюдения
микроаэрофильных условий при подготовке материала к его транспортировке. В
отделении гастроэнтерологии МОНИКИ совместно с ИБМФ им. Г.К. Скрябина РАН разработана модификация УДТ с использованием 20мг 13С - (импортной) мочевины вместо традиционно используемых 75-100мг*.
1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника.-Триада Х,-Москва, 1998,-483 с.
2. 2. Щербаков П.Л. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori// ИвашкинВ.Т.,Мегро Ф., ЛапинаТ. Л., ред. Helicobacter pylori :революция в гастроэнтерологии//Москва:Триада-Х;-1999-С.14-20.
3. ИсаковВ.А., ДомарацкийИ.В.Хеликобактериоз//Медпрактика-Москва-2003.-С.229-235.
4. 4. Barthel J.S.,Everett E.D. Diagnosis of Campylobacter pylori infection: the "gold standard" and the alternatives.- Rev.Inf.Dis., -1990-v.12. -s.l. -p. S107-S114.
5. Graham D.Y.,Klein P.D.,Evans D.J.et al.Campylobacter pylori detected non-invasively by the 13C-ureabreath test.//Lancet.-1987.-ii:P.1174-1177
6. Logan R.P.H., Polson R.J., et al. A simplified single 13C urea breath test for Helicobacter pylori; сomparisos with histology, culture and ELISA serology.\\Gut.-1991.-Vol.32.-P.1461-1464.
* на представленный «Способ неинвазивной диагностики хеликобактерной инфекции» (Зякун А.М., Цодиков Г.В., Сакович Л.В.) получен патент на изобретение 27 мая 2004. Заявка N2001133784/14(036532) от 18.12.2001.
DEVELOPMENT OF THE MODIFIED UNINVASIVE METHOD OF DIAGNOSTICS HELICOBACTER PYLORI.
MONIKI named after M.F.Vladimirsky, email: [email protected]
Technology of modified breath ureasa test with 13C-urea and demonstration its diagnostic precisions. Based on the addition citric acid with low level of 13C-isotop.
