CC BY
3
здорового донора набухали на 24 ч в среднем в 1,48 раз (p=0,0175) и 3,29 раз (p<0,0001) относительного исходного значения, соответственно. БО и ЛО из чИПСК донора с муковисцидозом демонстрировали отсутствие набухания на 24 ч относительного 0 ч.
Результаты работы демонстрируют клеточный состав бронхиальных и легочных органоидов, а также возможность их применения в качестве модели, для персонализированной оценки проводимости канала CFTR и, в дальнейшем, в качестве модели, для разработки новых методов лечения.
Литература:
1. Kondrateva E, Adilgereeva E, Amelina E et al. Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101933.
2. Salikhova DI, Leonov GE, Bukharova TB et al. Genes and Cells. 2019. V. 14. P. 46-53.
3. McCauley KB, Hawkins F, Kotton DN Curr Protoc Stem Cell Biol. 2018. V. 45. P. e51.
4. Leibel SL, McVicar RN, Winquist AM et al. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020. V. 54. P. e118.
УЧАСТИЕ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ БЕЛКА Р53 В ОСТРЫЙ И РАННИЙ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ ПОСЛЕ ИНСУЛЬТА
С.В. Демьяненко, В.В. Гузенко, С.А. Батальщикова
Лаборатория «Молекулярная нейробиология», Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: деацетилазы гистонов, р53, апоптоз, фо-тотромботический инсульт
Пост-трансляционное ацетилирование остатков лизина гистоновых и негистоновых белков регулирует важнейшие функции клеток [1]. Гистонацетилтрансферазы (НАТ) переносят ацетильные группы от ацетил-коэнзима А на в-аминогруппу остатков лизина, а гистондеацетилазы (HDAC) катализируют удаление ацетильных групп. На клеточных и животных моделях ишемии было показано, что ингибиторы HDAC (iHDAC) защищают нервные клетки и способствуют восстановлению после инсульта [2]. Однако использование неселективных iHDAC имеет ряд побочных эффектов [2]. Поэтому поиск изоформ hAt/ HDAC, участвующих в пост-трансляционной модификации сигнальных белков и факторов транскрипции необходим для выяснения причин цитотоксичности iHDAC и разработки новых модуляторов HAT/HDAC для терапии инсульта.
Все исследования проведены на модели фототром-ботического инсульта (ФТИ). Протеомные исследования позволили определить глобальные регуляторы апоптоза клеток мозга после ФТИ — факторы транскрипции р53, E2F1 и c-Myc, а также изоформы HAT (HAT1, PCAF) и HDAC (HDAC1, HDAC2, HDAC6), участвующие в повреждении и репарации после ФТИ [3]. Исследования показали, что наиболее значительные изменения экспрессии р53 наблюдались через 24 часа после ФТИ причем как в ядрах, так и в цитоплазме клеток ишемической пенумбры, а в нейронах уровень белка оставался высоким и через 7 суток после ФТИ. С помощью базы данных UniProt (http:www.uniprot.org/) и программы GPS-PAIL 2.0 (http:pail.biocuckoo.org/online.php) удалось идентифицировать возможные сайты ацетилирования р53.
In vivo было показано, что ФТИ вызывает рост ацетили-рования р53 по К373 и К320 через 2A часа после ФТИ, ацетилирование р53 по К320 сохраняется и в период репарации. Эксперименты с активатором р53 WR1G65 показали, что ацетилирование р53 по К373 повышает стабильность белка, способствует транслокации р53 в ядра нейронов и росту апоптоза нейронов после ФТИ. Методами Duolink PLA (метод близкого лигирова-ния) и ко-иммунопреципитации было установлено, что р53 непосредственно взаимодействует с ацетилтранс-феразой PCAF и деацетилазами HDAC2 и HDAC6. Однако использование ингибиторов HDAC2 (MI192) и HDAC6 (HPOB, тубастатин А) показало, что модуляция активности р53 путем его ацетилирования по К373 не отвечает за нейропротекцию, опосредованную селективными ингибиторами HDAC2 и HDAC6, их противоапоптотическое действие было связано с сохранением уровня ацетили-рования р53 по К320.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00188.
Литература:
1. Spange S, Wagner T, Heinzel T, Krämer OH. Cell Biol. 2GG9. V.
Aim. P. 185-98.
2. Demyanenko S, Dzreyan V, Sharifulina S. Biomedicines. 2G21.
V. 9(10). P. 1AA5.
3. Demyanenko S, Uzdensky A. Mol Neurobiol. 2G17. V. SA^). P.
6839-6856.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПОСОБОВ
СБОРКИ КАРДИАЛЬНЫХ МЕЗОТЕЛИАЛЬНЫХ
СФЕРОИДОВ
К.В. Дергилев, З.И. Цоколаева, И.Б. Белоглазова,
А^. Гусева, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России,
Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: сфероид, эпикардиальное микроокружение.
Фундаментальные исследования последних лет позволили переосмыслить роль эпикарда в молекулярных и клеточных механизмах онтогенеза сердца и его репарации после повреждения. Однако его изучение крайне затруднено в связи с отсутствием релевантных моделей, моделирующих эпикардиальной микроокружение.
Цель исследования. Сравнить способы сборки эпи-кардиальных сфероидов (эпироидов) и охарактеризовать их свойства.
В работе использованы клетки эпикардиального ме-зотелия, полученные из эмбрионального сердца мыши методом эксплантной культуры. Для сборки эпироидов протестировано несколько подходов культивирования клеток: 1) на чашках с поли-Д-лизином; 2) методом «висячей капли»; 3) в V- образных чашках с низкоадгезионным покрытием. Характеристику сфероидов проводили с помощью иммуногистохимических и иммунофлуорес-центных методов окрашивания, световой и конфокальной микроскопии и анализа изображений с помощью пакета программ MetaMorph®
Показано, что культивирование клеток эпикардиального мезотелия на чашках с поли-Д-лизином и методом «висячей капли» не являются оптимальными подходами для сборки сфероидов. Культивирование в вышеуказанных условиях сопровождалось более длительным периодом формирования первичных клеточных скоплений
(24-72 часа), образованные сфероиды имели неправильную форму, низкий уровень компактизации и характеризовались высокой вариабельностью в размерах (50-320 мкм). При этом часть клеток не принимало участия в сферогенезе. Культивирование суспензии клеток в V- образных чашках с низкоадгезионным покрытием приводило к формированию сфероидов 152+/-23 мкм в течение 48 часов. Гистологические исследования показали, что в составе полученных сфероидов клетки имеют упорядоченную организацию с высоким уровнем ком-пактизации в поверхностном слое и более низким в зоне ядра. Иммунофлуоресцентные окрашивания криосрезов эпироидов показали, что клетки сохраняют экспрессию мезотелиальных маркеров ^и, ЕрюапС1п), формируют плотные контакты, образованные на основе белка ZO-1, а также низкий уровень экспрессии гладкомышеч-ного альфа-актина, виментина и коллагена 1 типа, что указывает на сохранение эпителиоподобного статуса большинства клеток эпикарда в составе эпироидов. При стимуляции ТЭРр1 наблюдалось увеличение уровня ком-пактизации эпироидов и накопление белков внеклеточного матрикса (фибронектина, коллагенов 1 и 3 типа).
Таким образом, культивирования эпикардиальных клеток в V-образных чашках с низкоадгезионным покрытием может рассматриваться в качестве оптимального способа для сборки эпироидов в сравнении с другими исследованными подходами. Клетки в составе эпироидов сохраняют свойства клеток эпикардиального мезотелия и способность отвечать на воздействие профиброзного регулятора ТЭРр1, что позволяет рассматривать полученные сфероиды в качестве перспективной модели эпи-кардиального микроокружения.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 19-29-04164 «Разработка модели эпикардиального сфероида (эпироида) для изучения влияния воспаления и патологических факторов риска сердечной недостаточности на эпикардиальное микроокружение и механизмы репарации сердца»
СФЕРОИДЫ НА ОСНОВЕ
ЭПИТЕЛИОПОДОБНЫХ КЛЕТОК МЕЗОТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА (ЭПИРОИДЫ) — МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЗАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ ЭПИ-/ СУБЭПИКАРДИАЛЬНОГО ФИБРОЗА
К.В. Дергилев, З.И. Цоколаева, А^. Гусева, И.Б. Белоглазова, А.В. Андреев, Р.С. Акчурин, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: сфероид, эпикардиальное микроокружение.
Хроническая сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса является широко распространенным заболеванием сердца, ассоциированным с про-грессированием кардиального фиброза, и имеющем ограниченные возможности для медикаментозной коррекции. Отсутствие эффективных методов лечения этой патологии в определенной степени связно с отсутствием репрезентативных in vitro моделей, которые могут быть использованы для поиска лекарственных мишеней и разработки фармацевтических препаратов направленного действия. Особый интерес в этом отношении представляет клетки эпикардиального мезотелия, которые
способны формировать пул фибробластов сердца и участвовать в развитии/прогрессировании фиброза.
Цель исследования: разработать 30 модель эпикар-диального микроокружения (эпироид) и исследовать влияние профиброзного индуктора ТЭРЬ1 на ее свойства.
Эпителиоподобные клетки эпикардиального мезоте-лия выделяли из образцов, полученных в ходе операции аорто-коронарного шунтирования от пациентов с ишеми-ческой болезнью сердца. Для сборки эпироидов использовали метод культивирования в и- образных чашках с низкоадгезионным покрытием. Характеристику сфероидов проводили с помощью ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинга, методов иммуногисто/иммунофлуо-ресцентного окрашивания.
Показано, что сформированные эпироиды образуются путем компактизации клеток, сохраняющих маркеры эпикардиального мезотелия, формирующих ZO-1+ содержащие плотные контакты и имеющих низкий уровень экспрессии маркеров фибробластов и коллагенового матрикса, что соответствует организации зоны эпикарда в неповрежденном сердце. При воздействии рекомби-нантного ТЭРЬ1 происходит уменьшение размеров сфероидов, в центральной части которого клетки приобретают веретенообразуную форму, усиливают экспрессию генов мезотелиально-мезенхимального перехода, маркеров фибробластов и накапливают белки внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин), что указывает на признаки фиброзной трансформации.
Разработанная модель (эпироид) на основе клеток эпикарда с определенной долей допущения способна воспроизводить некоторые характеристики нативного эпикардиального микроокружения и модулировать клеточный ответ на воздействие профиброзного индуктора ТЭРЬ1. Эта модель может быть использована для дальнейшего изучения механизмов регуляции эпикардиаль-ного микроокружения и его участия в патогенезе развития фиброза сердца.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 19-29-04164 «Разработка модели эпикардиального сфероида (эпироида) для изучения влияния воспаления и патологических факторов риска сердечной недостаточности на эпикардиальное микроокружение и механизмы репарации сердца».
ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК КАРДИОСФЕР С ПОМОЩЬЮ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА 1 ВЫЗЫВАЕТ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИХ СЕКРЕТОМА
К.В. Дергилев, А^. Гусева, Е.С. Зубкова, А.В. Андреев, М.Ю. Меньшиков, З.И. Цоколаева, И.Б. Белоглазова, Ю.Д. Гольцева, Р.С. Акчурин, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: кардиосферы, воспаление.
В настоящее время большое внимание уделяется регуляторным эффектам клеток кардиосфер, которые определяются действием биологически активных веществ, содержащихся в их секретоме. Направленная модуляция состава секретома клеток рассматривается как перспективная стратегия для разработки
