CC BY
3
(24-72 часа), образованные сфероиды имели неправильную форму, низкий уровень компактизации и характеризовались высокой вариабельностью в размерах (50-320 мкм). При этом часть клеток не принимало участия в сферогенезе. Культивирование суспензии клеток в V- образных чашках с низкоадгезионным покрытием приводило к формированию сфероидов 152+/-23 мкм в течение 48 часов. Гистологические исследования показали, что в составе полученных сфероидов клетки имеют упорядоченную организацию с высоким уровнем ком-пактизации в поверхностном слое и более низким в зоне ядра. Иммунофлуоресцентные окрашивания криосрезов эпироидов показали, что клетки сохраняют экспрессию мезотелиальных маркеров ^и, ЕрюапС1п), формируют плотные контакты, образованные на основе белка ZO-1, а также низкий уровень экспрессии гладкомышеч-ного альфа-актина, виментина и коллагена 1 типа, что указывает на сохранение эпителиоподобного статуса большинства клеток эпикарда в составе эпироидов. При стимуляции ТЭРр1 наблюдалось увеличение уровня ком-пактизации эпироидов и накопление белков внеклеточного матрикса (фибронектина, коллагенов 1 и 3 типа).
Таким образом, культивирования эпикардиальных клеток в V-образных чашках с низкоадгезионным покрытием может рассматриваться в качестве оптимального способа для сборки эпироидов в сравнении с другими исследованными подходами. Клетки в составе эпироидов сохраняют свойства клеток эпикардиального мезотелия и способность отвечать на воздействие профиброзного регулятора ТЭРр1, что позволяет рассматривать полученные сфероиды в качестве перспективной модели эпи-кардиального микроокружения.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 19-29-04164 «Разработка модели эпикардиального сфероида (эпироида) для изучения влияния воспаления и патологических факторов риска сердечной недостаточности на эпикардиальное микроокружение и механизмы репарации сердца»
СФЕРОИДЫ НА ОСНОВЕ
ЭПИТЕЛИОПОДОБНЫХ КЛЕТОК МЕЗОТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА (ЭПИРОИДЫ) — МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЗАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ ЭПИ-/ СУБЭПИКАРДИАЛЬНОГО ФИБРОЗА
К.В. Дергилев, З.И. Цоколаева, А^. Гусева, И.Б. Белоглазова, А.В. Андреев, Р.С. Акчурин, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: doctorkote@gmail.com
Ключевые слова: сфероид, эпикардиальное микроокружение.
Хроническая сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса является широко распространенным заболеванием сердца, ассоциированным с про-грессированием кардиального фиброза, и имеющем ограниченные возможности для медикаментозной коррекции. Отсутствие эффективных методов лечения этой патологии в определенной степени связно с отсутствием репрезентативных in vitro моделей, которые могут быть использованы для поиска лекарственных мишеней и разработки фармацевтических препаратов направленного действия. Особый интерес в этом отношении представляет клетки эпикардиального мезотелия, которые
способны формировать пул фибробластов сердца и участвовать в развитии/прогрессировании фиброза.
Цель исследования: разработать 30 модель эпикар-диального микроокружения (эпироид) и исследовать влияние профиброзного индуктора ТЭРЬ1 на ее свойства.
Эпителиоподобные клетки эпикардиального мезоте-лия выделяли из образцов, полученных в ходе операции аорто-коронарного шунтирования от пациентов с ишеми-ческой болезнью сердца. Для сборки эпироидов использовали метод культивирования в и- образных чашках с низкоадгезионным покрытием. Характеристику сфероидов проводили с помощью ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинга, методов иммуногисто/иммунофлуо-ресцентного окрашивания.
Показано, что сформированные эпироиды образуются путем компактизации клеток, сохраняющих маркеры эпикардиального мезотелия, формирующих ZO-1+ содержащие плотные контакты и имеющих низкий уровень экспрессии маркеров фибробластов и коллагенового матрикса, что соответствует организации зоны эпикарда в неповрежденном сердце. При воздействии рекомби-нантного ТЭРЬ1 происходит уменьшение размеров сфероидов, в центральной части которого клетки приобретают веретенообразуную форму, усиливают экспрессию генов мезотелиально-мезенхимального перехода, маркеров фибробластов и накапливают белки внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин), что указывает на признаки фиброзной трансформации.
Разработанная модель (эпироид) на основе клеток эпикарда с определенной долей допущения способна воспроизводить некоторые характеристики нативного эпикардиального микроокружения и модулировать клеточный ответ на воздействие профиброзного индуктора ТЭРЬ1. Эта модель может быть использована для дальнейшего изучения механизмов регуляции эпикардиаль-ного микроокружения и его участия в патогенезе развития фиброза сердца.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 19-29-04164 «Разработка модели эпикардиального сфероида (эпироида) для изучения влияния воспаления и патологических факторов риска сердечной недостаточности на эпикардиальное микроокружение и механизмы репарации сердца».
ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК КАРДИОСФЕР С ПОМОЩЬЮ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА 1 ВЫЗЫВАЕТ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИХ СЕКРЕТОМА
К.В. Дергилев, А^. Гусева, Е.С. Зубкова, А.В. Андреев, М.Ю. Меньшиков, З.И. Цоколаева, И.Б. Белоглазова, Ю.Д. Гольцева, Р.С. Акчурин, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: doctorkote@gmail.com
Ключевые слова: кардиосферы, воспаление.
В настоящее время большое внимание уделяется регуляторным эффектам клеток кардиосфер, которые определяются действием биологически активных веществ, содержащихся в их секретоме. Направленная модуляция состава секретома клеток рассматривается как перспективная стратегия для разработки
инновационных лекарственных препаратов для лечения заболеваний сердца.
Цель исследования: исследовать воздействие реком-бинантного трансформирующего фактора роста бета 1 (ТЭРЬ1) на клетки кардиосфер с целью противовоспалительного профилирования их секретома.
Для получения кардиальных сфероидов (кардиосфер) использованы образцы ушка правого предсердия, полученных от пациентов с ИБС в ходе операции аорто-коронарного шунтирования. Кардиосферообразующие клетки получали методом эксплантной культуры, сборку сфероидов проводили на чашках с низкоадгезионным покрытием (ро1у-НЕМА). Характеристику клеток проводили с помощью проточной цитофлуориметрии, иммуно-блоттинга, ПЦР в реальном времени. Стимуляцию клеток сфероидов проводили с помощью ТЭРЬ1 (20 нг/мл) в течение 24 часов. Анализ секретома выполняли с помощью мультиплексного иммуноанализа Мадр1х.
Показано, что добавление в среду культивирования ТЭРЬ1 способствовало ускорению сборки и 3-кратному повышению числа сфероидов, имеющих размер 100-150 мкм. Обнаружено, что клетки кардиосфер наряду с классическими маркерами прогениторных клеток сердца, экспрессируют ТЭРЬ1, ТЭРЬ2, ТЭРЬ3 рецепторы. В кондиционированной среде клеток кардиосфер после стимуляции ТЭРЬ1 наблюдалось снижение содержания провоспалительных (Т1\1Ра (60,9+/-2,8 уэ 0,7+/-0,4 пг/мл), 11_1а (57,9+/-2,8 уэ 7,1+/-2,6 пг/мл), М1Р1а (57,9+/-2,8 уэ 1,8+/-0,5 пг/мл), М1Р1Ь (58,9+/-2,8 уэ 0,7+/-0,1 пг/мл), 1_7 (53,9+/-2,8 уэ 4,3+/-0,9 пг/мл), 1Р10 (СХС_10) (55,9+/-2,8 уэ 22+/-4,8 пг/мл), 1_1Ь (47,9+/-2,8 уэ 1,5+/-0,4 пг/мл), 1_15 (41,9+/-2,8 уэ 2,4+/-0,4 пг/мл), !Р1\1д (32+/-2,8 уэ 2,8+/-0,7 пг/мл), СС_5 (59,9+/-2,8 уэ 12,1+/-7,5 пг/мл)) и повышение противовоспалительных факторов (!_4 (50,9+/-2,8 уэ 193,6+/-70,8 пг/мл), ЭСЭР (26,9+/-2,8 уэ 44,5+/-11,9 пг/мл).
Таким образом, ТЭРЬ1 может способствовать противовоспалительному профилирования секретома клеток кардиосфер. Прекондиционирование клеток кардиосфер с помощью ТЭРЬ1 может служить основой для создания подходов для разработки препаратов с противовоспалительными свойствами направленного действия (на основе компонентов секретома) для лечения заболеваний различной этиологии. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 19-15-00384 «Исследование механизмов активации эпикарда при повреждении сердца и возможности стимулировать репаративный ангиоге-нез и репарацию миокарда после ишемического повреждения путем активирующих воздействий на эпикард».
ДЕФИЦИТ РЕЦЕПТОРА АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНОГО ТИПА ВЕДЕТ К НАРУШЕНИЮ АНГИОГЕННЫХ СВОЙСТВ ВАСКУЛОГЕННЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ, РАЗВИТИЮ ВАСКУЛОПАТИИ И ФИБРОЗА В СЕРДЦЕ МЫШИ
К.В. Дергилев, И.Б. Белоглазова, З.И. Цоколаева, Ю.Д. Гольцева, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: doctorkote@gmail.com
Ключевые слова: урокиназный рецептор, васкулопатия, фиброз
Активатор плазминогена урокиназного типа и его рецептор (uPAR) образуют интегрированный на клеточной мембране мультимолекулярный комплекс, который выполняет как протеолитическую, так регуляторные функции, необходимые для поддержания тканевого гомеостаза.
Цель: исследовать участие uPAR в реализации ангио-генных свойств васкулогенных клеток-предшественниц (ВКП) и развитии кардиального фиброза.
В работе использованы ВКП, полученные из сердец uPAR-/- и мышей дикого типа, и охарактеризованные с помощью методов проточной цитофлуориметрии, ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинга, иммуноцитохи-мии, микроэррей анализа, подходов для оценки ангио-генных свойств (tube assay, трансплантация клеток в составе матригеля). Исследование уровня васкуляризации миокарда и фиброза выполнялось с помощью иммуно-гистохимических и гистологических методов с последующем анализом в программе Image J. Диастолическая функция сердца оценивалась с помощью ЭХОКГ.
Сравнительное исследования показало, что в сердце uPAR-/- животных наблюдается снижение числа капилляров и артериол в сравнении с животными дикого типа. Мы также обнаружили, что у uPAR-/- мышей наблюдается снижение числа васкулогенных клеток-предшественниц (ВКП). Мы показали, что uPAR-/- ВКП имеют признаки сниженной жизнеспособности, более легко способны вступать в апоптоз, имеют сниженную секрецию проан-гиогенных факторов роста (VEGF, ангиогенинов и анги-опоэтинов) и подавленную способность к ангиогенезу in vitro и in vivo. Кроме того, у uPAR-/- мышей снижение ангиогенного поведения клеток сочеталось с признаками интерстициального фиброза в сочетании с развитием диастолической дисфункции, чего не наблюдалось у животных дикого типа.
Таким образом, дефицит uPAR ведет к нарушению ангиогенного поведения ВКП и васкулопатии, что может лежать в основе развития интерстициального фиброза в сердце. uPAR-/- мыши могут рассматриваться в качестве модели для изучения молекулярных механизмов развития кардиального фиброза и недостаточности с сохраненной фракцией выброса. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 21-15-00327 «Изучение механизмов формирования профиброзного микроокружения сердца на модели кардиосфер: роль урокиназного рецептора».
РЕЦЕПТОР АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНОГО ТИПА НА ПЕРЕПУТЬЕ МЕЖДУ РЕПАРАЦИЕЙ И ПАТОЛОГИЕЙ СЕРДЦА
К.В. Дергилев, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: doctorkote@gmail.com
Ключевые слова: урокиназный рецептор, фиброз.
В последнее десятилетие новым перспективным направлением биомедицинских исследований стала клеточная терапия. В ее основе лежит использование различных видов стволовых/прогениторных клеток, которые как сами могут быть трансплантированы и использованы для реконструирования тканей, так и служить инструментов для переноса факторов, активирующих эндогенные механизмы репарации. Между тем, механизмы
