CC BY
14
МСК также показали свою эффективность для терапии последствий операции Касаи. Это процедура удаления поврежденных вследствие билиарной атрезии желчных протоков и создание анастомоза между печенью и двенадцатиперстной кишкой. Однако, операция связана с последствиями, наиболее распространенными из которых является печеночный холангит из-за инвазии микрофлоры кишечника.
У 2х детей с БА после процедуры Касаи развился тяжелый рецидивирующий холангит, который требовал пересадки печени в обоих случаях, в связи с нарастающей печеночной дисфункцией. На фоне терапии МСК в обоих случаях удалось остановить воспалительноый процесс и восстановить функциональную активность печени. На данный момент от начала терапии МСК дети находятся под наблюдением на протяжении 3 лет 9 месяцев и 2 лет 6 месяцев. На протяжении всего периода мониторинга у обоих пациентов не обнаружено рецидива холан-гита, нарушений в функции печени не выявлено, показания к проведению трансплантации печени отсутствуют.
Таким образом, МСК являются эффективным средством терапии для печеночных патологий.
Литература:
1. Gholamrezanezhad A., Mirpour S., Bagheri M. et al. Nucl. Med.
Biol. 2011. V. 38. P. 961.
2. Zhang, Z.D., Lin H., Shi M. et al. J. Gastroenterol. Hepatol. 2012.
V. 27 (Suppl-2). P. 112.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОМНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИЕЙ
Е.В. Дементьева, С.В. Павлова, А.Е. Шульгина, К.А. Проняева, С.М. Закиян
ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
e-mail: dementyeva@bionet.nsc.ru
Ключевые слова: гипертрофическая кардиомиопатия, клиническое значение мутаций, индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки, система CRISPR/Cas, кардиомиоцит.
Внедрение методов секвенирования нового поколения в клиническую практику для проведения генетического анализа пациентов с гипертрофической кардиомиопа-тией (ГКМП) приводит к выявлению все большего числа мутаций в генах, ассоциированных с данным заболеванием. Однако не для всех обнаруженных генетических вариантов в настоящее время установлено их клиническое значение. Заключение о клиническом значении мутаций основывается преимущественно на популяционно-гене-тических данных и результатах анализа in silico. Новые перспективы для оценки клинического значения генетических вариантов открывают методы редактирования нуклеотидных последовательностей, в частности система CRISPR/Cas, которые позволяют вносить и/или исправлять исследуемые мутации. Редактирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и их последующая направленная дифференцировка дают возможность получать кардиомиоциты, различающиеся наличием и/или отсутствием только одной мутации, и оценивать ее влияние на развитие заболевания.
В ходе секвенирования клинического экзома пациентов с ГКМП нами были обнаружены две мутации
с неясным клиническим значением: р.Аэп515Се! в гене MYBPC3 и р.М^659!!е в гене MYH7. Кардиомиоциты, полученные при направленной дифференцировке ИПСК пациентов с данными мутациями, демонстрировали увеличенный размер, нарушения в осцилляции ионов кальция и повышение уровня экспрессии регуляторных генов кар-диомиоцитов и генов саркомерных белков. Тем не менее остается неясным, являются ли обнаруженные признаки ГКМП следствием влияния мутаций р.Аэп515Се! в гене MYBPC3 и р.М^659!!е в гене MYH7. Мы прим. ли систему СП!8РП/Саз9 для внесения данных мутаций в ИПСК здорового донора. В докладе будут представлены результаты редактирования генов MYBPC3 и MYH7 в ИПСК здорового донора, характеристика линий ИПСК с внесенными мутациями и анализ кардиомиоцитов, полученных в результате дифференцировки ИПСК с внесенной в ген MYBPC3 мутацией р.Аэп515Се!. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00271.
БРОНХИАЛЬНЫЕ И ЛЕГОЧНЫЕ ОРГАНОИДЫ ИЗ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ МУКОВИСЦИДОЗА
А.Г. Демченко1, Е.В. Кондратьева1, В.Ю. Табаков1, Е.Л. Амелина2, А.В. Лавров1, С.А. Смирнихина1
1 ФГБНУ Медико-генетический научный центр им. Н.П. Бочкова, Москва, Россия
2 ФГУ НИИ Пульмонологии ФМБА, Москва, Россия
e-mail: demchenkoann@yandex.ru
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, органоиды, муковисцидоз, CFTR
Бронхиальные (БО) и легочные органоиды (ЛО), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чИПСК), могут быть применены в персонализированной диагностики и терапии муковисцидоза. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, и в более чем 50% вызван мутацией F508del. В результате мутаций нарушается транспорт ионов хлора и натрия через канал CFTR в клеточной мембране. Проводимость CFTR-канала in vitro оценивают форсколиновым тестом. Целью работы было получить и охарактеризовать бронхиальные и легочные органоиды из чИПСК здорового донора и донора с муковисцидозом с гомозиготной мутацией F508del, а также оценить пригодность полученных органоидов, для функционального теста проводимости CFTR-канала.
Дифференцировку чИПСК [1, 2] в БО и ЛО проводили по опубликованным протоколам с модификацией некоторых этапов [3, 4]. Характеризацию БО и ЛО на экспрессию маркеров клеток легкого проводили методами иммуноцитохимического окрашивания, проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. Функциональный анализ CFTR-канала в органоидах проводили методом форсколин-индуцированным набуханием (ФИС). Изображения анализировали в программном обеспечении ilastik и CellProfiler.
Получены бронхиальные и легочные органоиды из чИПСК здорового донора и донора с гомозиготной мутацией F508del в гене CFTR. БО экспрессируют маркеры ба-зальных, бокаловидных и крупных секреторных клеток. ЛО, помимо вышеперечисленных маркеров, экспрессируют маркеры альвеолоцитов 1 и 2 типов. В обоих типах органоидов, полученных из чИПСК здорового донора, подтверждена экспрессия гена CFTR. При ФИС, БО и ЛО из чИПСК
здорового донора набухали на 24 ч в среднем в 1,48 раз (p=0,0175) и 3,29 раз (p<0,0001) относительного исходного значения, соответственно. БО и ЛО из чИПСК донора с муковисцидозом демонстрировали отсутствие набухания на 24 ч относительного 0 ч.
Результаты работы демонстрируют клеточный состав бронхиальных и легочных органоидов, а также возможность их применения в качестве модели, для персонализированной оценки проводимости канала CFTR и, в дальнейшем, в качестве модели, для разработки новых методов лечения.
Литература:
1. Kondrateva E, Adilgereeva E, Amelina E et al. Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101933.
2. Salikhova DI, Leonov GE, Bukharova TB et al. Genes and Cells. 2019. V. 14. P. 46-53.
3. McCauley KB, Hawkins F, Kotton DN Curr Protoc Stem Cell Biol. 2018. V. 45. P. e51.
4. Leibel SL, McVicar RN, Winquist AM et al. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020. V. 54. P. e118.
УЧАСТИЕ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ БЕЛКА Р53 В ОСТРЫЙ И РАННИЙ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ ПОСЛЕ ИНСУЛЬТА
С.В. Демьяненко, В.В. Гузенко, С.А. Батальщикова
Лаборатория «Молекулярная нейробиология», Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия
e-mail: demYanenkosvetlana@gmail.com
Ключевые слова: деацетилазы гистонов, р53, апоптоз, фо-тотромботический инсульт
Пост-трансляционное ацетилирование остатков лизина гистоновых и негистоновых белков регулирует важнейшие функции клеток [1]. Гистонацетилтрансферазы (НАТ) переносят ацетильные группы от ацетил-коэнзима А на в-аминогруппу остатков лизина, а гистондеацетилазы (HDAC) катализируют удаление ацетильных групп. На клеточных и животных моделях ишемии было показано, что ингибиторы HDAC (iHDAC) защищают нервные клетки и способствуют восстановлению после инсульта [2]. Однако использование неселективных iHDAC имеет ряд побочных эффектов [2]. Поэтому поиск изоформ hAt/ HDAC, участвующих в пост-трансляционной модификации сигнальных белков и факторов транскрипции необходим для выяснения причин цитотоксичности iHDAC и разработки новых модуляторов HAT/HDAC для терапии инсульта.
Все исследования проведены на модели фототром-ботического инсульта (ФТИ). Протеомные исследования позволили определить глобальные регуляторы апоптоза клеток мозга после ФТИ — факторы транскрипции р53, E2F1 и c-Myc, а также изоформы HAT (HAT1, PCAF) и HDAC (HDAC1, HDAC2, HDAC6), участвующие в повреждении и репарации после ФТИ [3]. Исследования показали, что наиболее значительные изменения экспрессии р53 наблюдались через 24 часа после ФТИ причем как в ядрах, так и в цитоплазме клеток ишемической пенумбры, а в нейронах уровень белка оставался высоким и через 7 суток после ФТИ. С помощью базы данных UniProt (http:www.uniprot.org/) и программы GPS-PAIL 2.0 (http:pail.biocuckoo.org/online.php) удалось идентифицировать возможные сайты ацетилирования р53.
In vivo было показано, что ФТИ вызывает рост ацетили-рования р53 по К373 и К320 через 2A часа после ФТИ, ацетилирование р53 по К320 сохраняется и в период репарации. Эксперименты с активатором р53 WR1G65 показали, что ацетилирование р53 по К373 повышает стабильность белка, способствует транслокации р53 в ядра нейронов и росту апоптоза нейронов после ФТИ. Методами Duolink PLA (метод близкого лигирова-ния) и ко-иммунопреципитации было установлено, что р53 непосредственно взаимодействует с ацетилтранс-феразой PCAF и деацетилазами HDAC2 и HDAC6. Однако использование ингибиторов HDAC2 (MI192) и HDAC6 (HPOB, тубастатин А) показало, что модуляция активности р53 путем его ацетилирования по К373 не отвечает за нейропротекцию, опосредованную селективными ингибиторами HDAC2 и HDAC6, их противоапоптотическое действие было связано с сохранением уровня ацетили-рования р53 по К320.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00188.
Литература:
1. Spange S, Wagner T, Heinzel T, Krämer OH. Cell Biol. 2GG9. V.
Aim. P. 185-98.
2. Demyanenko S, Dzreyan V, Sharifulina S. Biomedicines. 2G21.
V. 9(10). P. 1AA5.
3. Demyanenko S, Uzdensky A. Mol Neurobiol. 2G17. V. SA^). P.
6839-6856.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПОСОБОВ
СБОРКИ КАРДИАЛЬНЫХ МЕЗОТЕЛИАЛЬНЫХ
СФЕРОИДОВ
К.В. Дергилев, З.И. Цоколаева, И.Б. Белоглазова,
А^. Гусева, Е.В. Парфенова
ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России,
Москва, Россия
e-mail: doctorkote@gmail.com
Ключевые слова: сфероид, эпикардиальное микроокружение.
Фундаментальные исследования последних лет позволили переосмыслить роль эпикарда в молекулярных и клеточных механизмах онтогенеза сердца и его репарации после повреждения. Однако его изучение крайне затруднено в связи с отсутствием релевантных моделей, моделирующих эпикардиальной микроокружение.
Цель исследования. Сравнить способы сборки эпи-кардиальных сфероидов (эпироидов) и охарактеризовать их свойства.
В работе использованы клетки эпикардиального ме-зотелия, полученные из эмбрионального сердца мыши методом эксплантной культуры. Для сборки эпироидов протестировано несколько подходов культивирования клеток: 1) на чашках с поли-Д-лизином; 2) методом «висячей капли»; 3) в V- образных чашках с низкоадгезионным покрытием. Характеристику сфероидов проводили с помощью иммуногистохимических и иммунофлуорес-центных методов окрашивания, световой и конфокальной микроскопии и анализа изображений с помощью пакета программ MetaMorph®
Показано, что культивирование клеток эпикардиального мезотелия на чашках с поли-Д-лизином и методом «висячей капли» не являются оптимальными подходами для сборки сфероидов. Культивирование в вышеуказанных условиях сопровождалось более длительным периодом формирования первичных клеточных скоплений
