CC BY
17МАРТ - АПРЕЛЬ 2 Ol О
Конкурс «Лучшая работа молодого ученого»
Дьяченко И.А.
Учреждение РАН Филиал Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, (Пущино) Лаборатория биологических испытаний ФИБХ РАН
Сравнительный анализ нейротоксического действия изоформ зервамицина из гриба EmeпceПopsis salmosynnemata
Показано, что побочное действие зервамицинов на ЦНС носят обратимый характер. Выявлено, что, несмотря на большую гомологию в структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком, Zгv-IIB в высоких дозах проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Zгv-IIA. Установлено,
Рейтинговое голосование читателей
проводится на сайтах ФГУЗ РПОХБВ Роспотребнадзора www. rpohv.ru и журнала toxreview.ru.
Лекарственная токсикология УДК 615.065
что зервамицины в дозе 0,01 мг/ кг оказывают влияние на двигательную активность у мышей СБ-1, тогда как нейротоксичес-кое действие, они проявляют в дозе 2 мг/кг. Показана зависимость между структурой и активностью: при использовании дозы 0,01 мг/кг Zгv-IIB на 20-ой минуте после введения снижал двигательную активность,
а Zrv-IIA - нет, напротив на 60-ой минуте Zrv-IIA увеличивал двигательную активность, Zrv-IIB - нет. Обнаружено, что зервамицины уменьшают болевую чувствительность и вызывают снижение температуры тела.
Ключевые слова: мыши CD-1, пептаибол зервамицин, нейротоксическое действие
Введение. Развитие резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам требует постоянного пополнения арсенала новых препаратов [1]. Так, поиск новых антибиотиков является важной задачей современной фармакологии.
В 1973 Argoudelis и Johnson получили патент на новые антибиотики, выделенные из гриба Emericellopsis salmosynnemata, которые были названы зерва-мицинами. Зервамицины относятся к пептаиболам - пептидам, содержащим в своей структуре а,а-диалкиламинокислоты, например, а-аминоизомасляную кислоту, и С-концевые ами-носпирты. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они обладают не только выраженной активностью против грамположи-тельных и грамотрицательных
бактерий [2,3], но и проявляют антипротозойное действие по отношению к устойчивым формам возбудителя малярии Plasmodium falciparum [4]. Это позволяет рассматривать их как потенциальные антибиотические лекарственные средства. Из культур различных штаммов гриба Emericellopsis salmosynnemata было выделено до 11 изоформ зервамицинов, среди которых преобладающими являлись зервамицин IIA (Zrv-IIA) и зервамицин IIB (Zrv-IIB) [2]. Zrv-IIA и Zrv-IIB по своей структуре отличаются друг от друга только одним аминокислотным остатком в четвертом положении. Исследования ней-ротоксических свойств позволит нам изучить зависимость токсичности фармакологических веществ от их структуры. Работы по изучению активнос-
ти зервамицинов показали, что зервамицины проявляют: ней-ротропную [5], гипотермичес-кую и обезболивающую активности [6], а также выраженное нейротоксическое действие [7]. Результаты данных работ не позволяют однозначно интерпретировать нейротоксическое воздействие каждого из изучаемых зервамицинов.
Таким образом, целью данной работы явилось проведение сравнительного анализа ней-ротоксического действия двух изоформ зервамицина ^^-ПА и Zгv-IIB), выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata.
Материалы и методы исследования. Исследование было выполнено на самцах мышей СБ-1 в возрасте двух месяцев. Животные содержались в стандартных условиях: 12-часовой период освещения, комнатная
температура воздуха от 180С до 260С, влажность от 30% до 70%. Корм и воду мыши получали ad libitum. Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с требованиями институтской комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных.
Для изучения токсических свойств эксперименты проводили в опытах на животных, зервамицины растворяли в 30% этаноле и вводили внутрибрю-
Тестирование двигательной активности проводили на 20-ой и 60-ой минутах после введения веществ.
Полученные данные представлены как средние арифметические значения и их стандартные ошибки (Mean+SEM). Статистические сравнения результатов исследований проводили с использованием t-критерия Стью-дента, дисперсионного анализа ANOVA и Mann-Whitney U теста. Различия считали статистически значимыми при Р<0,05.
Результаты. Определение ЛД50 показало, что внутрибрю-шинное введение зервамицинов вызывает практически однотипную клиническую картину отравления, которая не зависит от вводимых зервамицинов: через 1-3 минуты после воздействия отмечается выраженное угнетение животных, резкое снижение локомоторной активности, урежение дыхания, кома в тече-
шинно в объеме 2 мл/кг. Животные контрольных групп получали раствор 0,9% №С1 и/или раствор 30% этанола.
Проводили определение ЛД50 и максимальной толерантной дозы (МТД) при однократном внутрибрюшинном введений мышам СБ-1. Срок последующего наблюдения составил 3 суток, в течение которых учитывали характер и длительность симптомов интоксикации, сроки гибели и количество павших животных от каждой введенной
ние последующих 1-2 часов. Гибель животных регистрировали в течение первых двух часов. В дальнейшем у выживших животных общее состояние нормализовалось. Результаты клинического осмотра показали, что у животного происходило угнетение дыхательного центра с выраженным угнетением центральной нервной системы.
Таким образом, максимальная толерантная доза при однократном внутрибрюшинном введений мышам СБ-1, как для Zгv-IIА так и Zгv-IIВ составляло 4 мг/кг, ЛД50 - 5,5 мг/кг, и 5,4, соответственно.
В соответствии с нормативными актами [8] одним из обязательных параметров, регистрируемых при изучении токсического действия вещества является, двигательная активность. Изучение двигательной активности позволяет оценить нейротоксичес-
дозы. Количественные параметры токсичности с уточнением характеристик потенциальной опасности смертельного отравления рассчитывали пробит-анализом по методу Литчфилда и Уилкоксона.
Определение двигательной активности проводили с помощью компьютеризированной установки «OPTO-VARIMEX» и программы «Auto-Track» (Columbus Instruments, США). В данном эксперименте животные были разделены на 12 групп:
кое действие исследуемого вещества.
Для более детального изучения влияния зервамицинов на двигательную активность была применена компьютеризированная установка «OPTO-VA-RIMEX» и программа «AutoTrack» (Columbus Instruments, США). Как показывают данные, приведенные на рис.1, на 20-ой минуте после введения Zrv-IIA достоверно снижал двигательную активность относительно контрольных животных в дозах от 0,1 мг/кг до 4 мг/кг. Zrv-IIB также дозозависимо снижал двигательную активность, однако, в отличие от Zrv-IIA он начинал проявлять этот эффект в дозе 0,01 мг/кг. На 60-й минуте обнаружено, что достоверно пониженный уровень двигательной активности сохранялся при введении Zrv-IIA в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг, тогда как Zrv-IIB - в дозах 0,5 мг/кг, 2 мг/кг и
Номер группы Вещество Доза, мг/кг Количество животных
1 0,9% NaCl - 15
2 30% этанол - 15
3 Zrv-IIA 0,001 6
4 Zrv-IIB 0,001 6
5 Zrv-IIA 0,01 15
6 Zrv-IIB 0,01 15
7 Zrv-IIA 0,5 10
8 Zrv-IIB 0,5 10
9 Zrv-IIA 2,0 22
10 Zrv-IIB 2,0 22
11 Zrv-IIA 4,0 12
12 Zrv-IIB 4,0 12
МАРТ - АПРЕЛЬ 2 01 О
Таблица 1
Гибель животных после внутрибрюшинного введения антибиотиков пептаиболов зервамицинов.
Исследуемое Доза Кол-во животных Кол-во погибших
Вещество (мг/кг) в группе животных
8 7 7
7 7 6
Zгv-IIA 6 7 5
5 7 2
4 7 0
8 7 7
7 7 6
Zгv-IIB 6 7 6
5 7 2
4 7 0
4 мг/кг. Кроме того, характерной особенностью Zгv-IIA оказалось то, что при введении в дозе 0,01 мг/кг он на 60-й минуте достоверно увеличивал двигательную активность как относительно контрольных животных, получавших 30% этанол, так и животных, получавших Zгv-IIB (рис.1). Таким образом, показано, что у мышей СЭ-1 под действием Zгv-IIА и Zгv-IIB двигательная активность дозо-зависимо снижалась на 20-й минуте после введения, при этом эффективная начальная доза для Zгv-IIА была 0,1 мг/кг, а для Zгv-IIB - 0,01 мг/кг. Кроме этого, было обнаружено, что на 60-й минуте после введения дозы равной 0,01 мг/кг, Zгv-IIА увеличивал двигательную активность, тогда как Zгv-ПB не оказывал такого действия. Полученные данные свидетельствуют о том, что Zгv-IIА и Zгv-IIB обладают нейротропным действием, при этом они отличаются по эффективности несмотря на сходство в структурах.
Обсуждение. Высокая степень гомологии структур Zгv-ПА и Zгv-IIВ, они различаются лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении, показало, что они обладают характерными особенностями в действии на двигательную систему. В дозе 0,01 мг/кг Zгv-ПА увеличивает двигательную активность, а Zгv-IIВ уменьшает. Дальнейшее увеличение
Рис.1. Двигательная активность, измеренная на установке «ОРТО-УАШМЕХ», на 20-ой минуте (А) и 60-ой минуте (Б) после введения 7гу-!!А и 7гу-!!В у мышей 0Р-1.
Примечание: # - Р<0,05 относительно группы «0,9% №0!»; * - Р<0,05 относительно группы «30% этанол»; $ - Р<0,05 относительно 7гу-!!А.
дозы приводит к снижению двигательной активности как под действием Zrv-IIB, так и Zrv-IIA, однако, Zrv-IIB проявляет более выраженный эффект. Однако определение максимальной толерантной дозы как для зервамицина (Zrv-IIA), так и для зервамицина (Zrv-IIB) показано, что она составила 4 мг/ кг. ЛД50 для Zrv-IIA составила 5,5 мг/кг, для Zrv-IIB - 5,4 мг/кг. Не обнаружено различий между зервамицинами ни по максимальной толерантной дозе, ни по величине ЛД50. Обнаружены различия в проявлении у зер-вамицинов нейротоксического действия. У животных, получавших зервамицин IIB в дозе 2 мг/ кг, наблюдали затрудненное дыхание и стелящиеся движения, тогда как при получении зерва-мицина IIA эти признаки проявлялись только при использовании дозы 4 мг/кг. Зервамицин
1. Lawrence et all. Microbial development of drug resistance: mechanisms and clinical significance / Lawrence RM and Hoeprich PD // CRC Crit Rev Clin Lab Sci. 1975 Mar;5. pp. 365-86.
2. Argoudelis A. Zervamicins I and II, olypeptide antibiotics produced by emericellopsis salmosynnemata / Argoudelis AD, Dietz A, Johnson LE.// J Antibiot.-1974. May;27(5):321-8.
3. Abou-Donia M. Uranyl acetate-induced sensorimotor deficit and increased nitric oxide generation in the central nervous system in rats /, Abou-Donia M.B., Goldstein LB, Shah DU, Bullman SL, Khan
IIB обладает более выраженным нейротоксическим действием, чем зервамицин IIA. [6]. Побочные эффекты зервамици-нов носят обратимый характер и сопровождаются уменьшением болевой чувствительности и снижением температуры тела. Болевая чувствительность под действием Zrv-IIB снижалась в использовании дозы 2 мг/кг, а Zrv-IIA - 4 мг/кг. Обнаружены различия в характере изменения температуры тела под действием зервамицинов [7].
Выводы. Показано, что побочное действие зервамици-нов на ЦНС носят обратимый характер. Выявлено, что, несмотря на большую гомологию в структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком, Zrv-IIB в высоких дозах проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Zrv-IIA. Макси-
WA. // Pharmacol Biochem Behav.- 2002 Jul;72(4):881-90.
4. Moser V. Dose-response and time-course of neurobehavioral changes following oral chlorpyrifos in rats of different ages / Moser V //Neurotoxicol Teratol. Volume 19, Number 6, 1 November 2000, pp. 407-411(5)
5. Овчинникова Т.В. Антибиотик -пеп-таибол Зервамицин обладает нейротроп-ной активностью / Овчинникова Т.В., Мурашев А.Н // Доклады академии наук 2007, том 414, №5, С 1-3.
6. Дьяченко И. Нейротоксическое действие пептаиболов зервамицина IIA и зер-
мальная толерантная доза для зервамицина составляет 4 мг/ кг, а ЛД50 - 5,5 мг/кг и 5,4 мг/ кг, соответственно. Установлено, что зервамицины в дозе 0,01 мг/кг оказывают влияние на двигательную активность у мышей CD-1, которая была выявлена с помощью установки «OPTO-VARIMEX», тогда как нейротоксическое действие, обнаруженное в тесте Ирвина, они проявляли в дозе 2 мг/кг. Показана зависимость между структурой и активностью: при использовании дозы 0,01 мг/кг Zrv-IIB на 20-ой минуте после введения снижал двигательную активность, а Zrv-IIA - нет, напротив, на 60-ой минуте Zrv-IIA увеличивал двигательную активность, Zrv-IIB - нет. Зер-вамицины в дозе 2 мг/кг и выше уменьшают болевую чувствительность и вызывают снижение температуры тела.
вамицина 11В / Дьяченко И. А., Мурашев А.Н., Овчинникова Т.В. // Токсикологический вестник. - 2008. - №3 - С. 35-38.
7. Дьяченко И. Особенности ней-ротропной активности зервамицинов 11А и 11В / Дьяченко И. А., Мурашев А.Н., Овчинникова Т.В. // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 419, №3 - С. 403-405.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена - корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева. - 2-изд., пере-раб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.: ил.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Dyachenko I.A.
Comparative analysis of neurotoxic activity of zervamicin isoforms isolated from fungi Emericellopsis
salmosynnemata
Academicians M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Pushchinо, Moscow
It was shown that the side-effect of the zervamicins impact on the central nervous system is of a reversible character. It was found out that despite a larger homology in structures only differing by a single amino-acid residue, Zrv-IIB in high doses produces more expressive neurotoxic effects than Zrv-IIA. It was shown that zervamicins in a dose of 0.01 mg/kg affect the motor ability in CD-1 mice while they produce a neurotoxic effect in a dose of 2 mg/kg. The relationship between the structure and activity is shown as follows: using the dose of 0.01 mg/kg, Zrv-IIB lowers the motor ability 20 min after administration and Zrv-IIA does not. On the contrary, Zrv-IIA brought up the motor ability after 60 minutes and Zrv-IIB did not. It was revealed that zervamicins relieve pain and induce lowering of the body temperature.
Материал поступил в редакцию 11.02.2010 г.
51
