CC BY
10раздражающим действием на кожу (крысы), не раздражает слизистую глаз кроликов (IV класс опасности).
При постановке длительного (90 дней) эксперимента с введением доз, рекомендуемых для применения в практике, и в десять раз выше, не было получено четкой картины токсического воздействия препарата на организм экспериментальных животных. Гибель по одному животному в группе при введении доз, равных 100 и 1000 мг/кг массы тела, в поздние сроки эксперимента свидетельствует о низкой кумулятивной способности препарата (Ccum > 3). По результатам исследований препарат Reglalg предложен для регистрации и включения в «Список разрешенных к применению средств защиты растений на территории Молдовы» в качестве регулятора роста.
Список литературы
1. Асмангулян А.А. Исследование соотношения интегральных и специфических реакций организма при оценке риска воздействия регуляторов роста растений//2-й съезд токсикологов России. Тезисы
докладов. - М.: РПОХВ, 2003. - С. 56-57.
2. Войтович А.М., Наджарян Л.А., Котеленец А.И. и др. Оценка потенциальной мутагенной активности 2,4-эпибрассинолида // Цитология и генетика, 2004. - T. 38. - № 6. - C. 49-53.
3. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. - Киев, 1988. - С. 16-51.
4. Наджарян Н.А. Медико-биологические аспекты безопасности применения фиторегулято-ров // Белорусский медицинский журнал, 2004. -№ 2(8), www.bsmu.by/bmm/02.2004/index.html.
5. Шевелуха В.С. Регуляторы роста растений. - М.: Агропромиздат, 1990. - 185 с.
6. EPA, 40 CFR (Code of Federal Regulations), the Office of Pesticide Programs (OPP), - Chapter I. -Part 158.
7. Gudumac V., Baciu E, Marin V. et al. Inves-tigatii enzimologice. Elaborare metodica. Chisinau, 2000. - P. 37.
Материал поступил в редакцию 21.08.07.
T.G.Stratulat1, R.F.Syrku1, A.P.Daskalyuk2, P.T.Sokolyuk1 PRIMARY TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF A NEW PLANT-GROWTH REGULATOR «REGLALG»
1State Scientific and Practical Center of Preventive Medicine, Ministry of Health of Moldova Republic Center of Advanced Biological Techniques, Institute of Genetics and Physiology of Plants, Moldova Academy of
Sciences, Kishinev
It was found out that the growth regulator Reglalg refers to the class of low hazardous compounds (LD50 per os for rats and mice > 5000 mg/kg), possesses low absorptive properties (LD50 per cutanum for rats > 5000 mg/kg). The preparation does not irritate rabbit skin and eye mucous layer. After three months of administration, it does not lead to the development of structural and functional changes demonstrating the development of toxic process in the animal organism.
УДК [615.33:577.18].099:612.8
И.А-Дьяченко1*, АЛ.Мурашев1, Т.В.Овчинникова2 ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ ПЕПТАИБОЛОВ ЗЕРВАМИЦИНОВ
Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл. 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва
В опытах на мышах CD-1 обнаружено дозозависимое нейротоксическое действие зервамицинов. Нейротокси-ческие эффекты в дозе 0,5 мг/кг не выявлены. Доза 2 мг/кг является пороговой в проявлении нейротоксических свойств. Нейротоксическое действие зервамицинов носит обратимый характер. /гу-ПВ вызывает более выраженные нейротоксические эффекты, чем /гу-ПА.
Ключевые слова: тест Ирвина, мыши СВ-1, пептаибол, зервамицин, нейротоксическое действие.
Введение. Пептаиболы представляют собой семейство мембрано-активных антибио-
* Фрагмент диссертационной работы
тических пептидов, выделенных из мицели-альных спорообразующих грибов. Они содержат в своей структуре а,а-диалкиламинокис-лоты, в частности а-аминоизомасляную кисло-
ту (Aib), а также С-концевой 1,2-аминоспирт. К семейству пептаиболов относится группа антибиотиков зервамицинов, выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata [2]. В культурах различных штаммов гриба обнаружено и охарактеризовано 11 изоформ пептида, среди которых преобладающими являются зервамицин IIA (Zrv-IIA) и зервамицин IIB (Zrv-IIB) [3]. Первичные структуры Zrv-IIA и Zrv-IIB различаются лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении: Zrv-IIA содержит а-аминоизомасляную кислоту, а Zrv-IIB — D-изовалин. У зервамицинов была выявлена ней-ротропная активность [1, 4], сходная с активностью пептаибола ампуллоспорина (Amp), выделенного из культуры штамма гриба Sepedonium ampullosporum [5]. У крыс в тесте «Открытое поле» было показано, что как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB в дозе 2 мг/кг снижают локомоторную и исследовательскую активность [1]. У мышей было обнаружено, что Zrv-IIA проявляет поведенческие эффекты в диапазоне доз от 0,05 до 2,0 мг/кг, тогда как Zrv-IIB — в дозах от 0,5 до 12,0 мг/кг [4]. Известно, что снижение локомоторной активности у животных может быть результатом нейротоксического действия [6,7]. Целью данного исследования являлась оценка возможных нейротоксических эффектов зервамицинов IIA и IIB.
Материалы и методы исследования. Исследование было выполнено на самцах мышей CD-1 в возрасте двух месяцев. Животных содержали в стандартных условиях: 12-часовой период освещения, комнатная температура воздуха 18—26°С, влажность 30—70%. Корм и воду мыши получали ad libitum. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями комиссии ФИБХ РАН по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных.
Для изучения нейротоксического действия пептидов был использован тест Ирвина, заключающийся в комплексной оценке поведенческого и физического состояния мышей [6, 7]. Тестирование животных проводили в клетке содержания, на открытой площадке, а также осуществляли осмотр в руках. При обследовании животных в клетке содержания определяли следующие показатели: поза на боку, неспособность к передвижению, сгорбленость, застывшая поза, возбуждение, облизывание или покусывание лап, конвульсии, тремор, затрудненное дыхание. При тестировании животных на откры-
той площадке наблюдали общую локомоторную активность, исследовательскую активность, обнюхивание, подёргивание мышц головы, подергивание ушей, пошатывание, потерю равновесия, падение, стелющиеся движения, грумминг, уринации, дефекации. Осмотр животных в руках включал в себя определение гиперсаливации, пилоэрекции, закрытых век глаз, а также наблюдение за сенсорными рефлексами: визуализацией объекта, силой хватания, координацией движений в момент падения. Данные показатели оценивали в баллах от 0 до 3, наиболее выраженному эффекту присваивали максимальное количество баллов [8]. Реакцию на резкий звук и ответ на прикосновение оценивали количеством баллов от 0 до 1; эти показатели определяли на открытой площадке [7].
Тестирование животных проводили через 20, 60 и 120 мин после введения препаратов. /гу-ПА и /гу-ПВ растворяли в 30% этаноле и вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 0,5, 2,0 и 4,0 мг/кг массы тела животного. В качестве контроля использовали интактных животных (кон-троль-1) и животных, которым вводили 30% этанол в объеме 2 мл/кг (контроль-2).
I □ 1 И 2 D3 Е34 И 5~|
Ztt-ПА Ztt-ПВ Zrv-IIA Zrr-ПВ Zrr-IIA /л lili
20 мин 60 мин 120 мин
Рис. 1. Апатия (А), сгорбленная поза (Б) и покусывание лап (В), обнаруженные в тесте Ирвина под влиянием зервамицинов IIA и IIB у мышей CD-1
Примечание. Здесь и на рис. 2 и 3: # - р < 0,05 по MannWhitney U тесту относительно интактных животных; * - р < 0,05 по Mann-Whitney U тесту относительно животных, которым вводили 30% этанол; 1 - интактные, 2 - 30% этанол, 3 -зервамицины (0,5 мг/кг), 4 - зервамицины (2 мг/кг), 5 - зер-вамицины (4 мг/кг)
□ 1 ■ 2 П 3 94 И 5
□ 1 ■ 2 □ 3 H 4 0 5
В
Ztv-ПА Zrv-IIB 20 мин
/гт-ПЛ zrr-ira
60 мин
/г.-ПЛ /Г.-1
120 мин
Рис. 2. Локомоторная активность (А), исследовательская активность (Б), обнюхивание (В), исследованные в тесте Ирвина под влиянием зервамицинов IIA и IIB у мышей CD-1
Zrv-IIA Ziy-QB
20 мин
ZIV-ПЛ ZIY-ПВ
60 мин
ZiT-IIA ZIT-ПВ
120 мин
Рис. 3. Сила хватания, исследованная в тесте Ирвина под влиянием зервамицинов IIA и IIB у мышей CD-1
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы Statistica 7+, используя Mann-Whitney U тест. Изменения показателей считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты осмотра животных в клетке представлены на рис. 1. В дозе 4 мг/кг как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB через 20 и 60 мин после введения статистически достоверно увеличивали у животных апатию, вызывали сгорбленную позу и покусывание лап. Эти изменения были обратимы и возвращались к норме через 120 мин после введения препаратов. В дозе же 2 мг/кг только Zrv-IIB статистически достоверно увеличивал у животных апатию че-
Таблица
Затрудненное дыхание и стелящиеся движения, обнаруженные в тесте Ирвина под влияние зервамицинов IIA и IIB у мышей CD-1
Параметр Группа 20 минута 60 минута 120 минута
Интактные 0 0 0
30% этанол 0 0 0
Затрудненное дыхание Zrv-IIA, 2 мг/кг 0 0 0
Zrv-IIB, 2 мг/кг 0,4+0,2" 0 0
Zrv-IIA, 4 мг/кг 1,4+0,2" 1,4+0,2" 0,2+0,1"
Zrv-IIB, 4 мг/кг 2,1+0,1" 1,8+0,1" 0,4+0,2"
Интактные 0 0 0
30% этанол 0 0 0
Стелящиеся движения Zrv-IIA, 2 мг/кг 0 0 0
Zrv-IIB, 2 мг/кг 0,2+0,1" 0 0
Zrv-IIA, 4 мг/кг 1,4+0,3" 1,3+0,2" 0,6+0,2"
Zrv-IIB, 4 мг/кг 1,8+0,1" 1,7+0,2" 0,4+0,1"
Примечание: * — р < 0,05 по Mann—Whitney test относительно интактных животных;
* — р < 0,05 по Mann—Whitney test относительно животных, которым вводили 30% этанол.
рез 20 и 60 мин после введения, не вызывая при этом сгорбленной позы и покусывания лап. Zrv-IIA в этой дозе вообще не оказывал влияния на данные параметры. Оба зервамицина в дозе 0,5 мг/кг не вызывали у животных апатию, сгорбленную позу и покусывание лап (рис. 1).
При осмотре животных на открытой площадке были исследованы такие параметры как локомоторная активность, исследовательская активность и обнюхивание. Как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB статистически достоверно уменьшали данные параметры в дозах 2,0 и 4,0 мг/кг через 20 и 60 мин после введения (рис. 2). Через 120 мин после введения только Zrv-IIB было обнаружено снижение локомоторной активности и обнюхивания. При использовании дозы 0,5 мг/кг не было обнаружено статистически достоверных изменений параметров, изучаемых на открытой площадке, относительно животных, получавших 30% этанол (рис. 2).
Как показывают данные на рис.3, осмотр животных в руках показал, что как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB в дозах 2 и 4 мг/кг статистически достоверно уменьшали силу хватания через 20 и 60 мин после введения препаратов. Данные изменения носили обратимый характер и через 120 мин уже не выявлялись. Применение дозы 0,5 мг/кг не оказывало влияние на силу хватания (рис. 3).
Затрудненное дыхание и стелящиеся движения были обнаружены только у животных, получавших зервамицины в дозах 2 и 4 мг/кг (табл.). Zrv-IIB вызывал более выраженное изменение данных параметров по сравнению с Zrv-IIA. Это воздействие также носило обратимый характер.
Выводы. 1. Zrv-IIA и Zrv-IIB в дозах 2,0 и 4,0 мг/кг оказывают на мышей CD-1 нейротоксиче-
ское действие, имеющее обратимый характер.
2. Zrv-IIB проявляет более выраженные ней-ротоксические эффекты, чем Zrv-IIA, несмотря на сходные структуры, отличающиеся только одним аминокислотным остатком.
3. Нейротоксические эффекты зервамицинов в дозе 0,5 мг/кг не выявлены. Доза 2 мг/кг является критической в проявлении нейротоксиче-ских свойств зервамицинов.
Работа выполнена при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (государственные контракты № 02.512.11.2037от 19.02.2007г. и № 02.522.11.2007от 11.05.2007г.).
Список литературы
1. Овчинникова Т.В., Мурашев А.Н. // Доклады академии наук, 2007. - Т. 414. - № 5. - С. 707-709.
2. Argoudelis A.D., Dietz A., Johnson L.E. // J. An-tibiot, 1974. - V 27. - № 5. - P. 321-328.
3. Rinehart K.L. Jr., Gaudioso L.A., Moore M.L. et al. // J. Am. Chem. Soc, 1981. - V. 103. - P. 6517-6520.
4. Ovchinnikova T.V., Levitskaya N.G., Voskresen-skaya O.G. et al. // Chem. Biodivers., 2007. - V. 4. -№. 6. - P. 1374-1387.
5. Ritzau M., Heinze S., Dornberger K. et al. // J. Antibiot, 1997. - V. 50. - № 9. - P. 722-728.
6. Daughtrey W.C., Gill M.W., Pritts I.M. et al. //J. Appl. Toxicol., 1997. - V. 17. - Suppl. 1. - P. 57-64.
7. Moser V. // Neurotoxicol. Teratol., 2000. - V. 19. - № 6. - P. 407-415.
8. Abou-Donia M.B., Goldstein LB, Shah D. U. et al. // Pharmacol. Biochem. Behav, 2002. - V. 72. -№ 4. - P. 881-890.
Материал поступил в редакцию 14.08.07.
I.A.Dyachenko1, A.N.Murashev1, T.V.Ovchinnikova2 INVESTIGATION OF NEUROTOXICITY OF PEPTAIBOL ZERVAMICINES
'Branch of Academicians M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region 2Academicians M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow
In experiments on CD-1 mice a dose-dependent neurotoxic action of zervamicines was found out. Neurotoxic effects were not revealed at a dose of 0.5 mg/kg. A dose of 2 mg/kg is a threshold one in the display of neurotoxic properties. Neurotoxic effects are of a reversible character. Zrv-IIB induces more expressed neurotoxic effects than Zrv-IIA does.
