CC BY
15Я H ВАРЬ
- Ф Е В РАЛ Ь 20 1 2
список литературы
1. Гигиенические нормативы. TH 2.1.6.686-98. Mинздрав России, Mосква, 1998.
2. Ртуть содержащие отходы потребления и их утилизация. http://www.komtek-eco.ru/index-4.html
3. Зибарев УИ., Чащин M.B., Захарова H.B., Почкарев HH. Ртуть как наиболее опасный источник техногенного загрязнения в России. //Вестник российской воен-мед. академии, 2008. - № 3(23), - Прилож. 2, ч.1. - С. 108 - 109.
4. Энциклопедический словарь медицинских терминов. Под ред. Петровского. M.: Советская энциклопедия, 1983.
- Т. 2, - С. 168.
5. Ершов Ю.А, Плетнева Т.В. Mеханизмы токсического действия неорганических соединений. - M. Mедицина, 1989. - 272 с.
6. Органические соединения ртути// №учные обзоры советской литературы по токсичности и опасности химических веществ. Вып. 117. Под ред. Измерова КФ. - M., Центр международных проектов., 1989. - 69 с.
7. Mалов A.M., Иванова T.M., Петров A.H., Семенов Е.В., Королева О.В., Петров A3., Сизова К.В., Колбасова E.H. Особенности диагностики и тактика ведения больных при меркуриализме. //- Токсикологический вестник. - 2004.-№ 5, С. 8 -15.
8. Ртуть и ее неорганические соединения. Под ред. Измерова КФ. - M., Центр международных проектов., 1998.
- 116 с.
9. Семенов НВ. Биохимические компоненты и константы жидких сред и тканей человека. - M.: Mедицина, 1973
- 243 с.
10. Тиц H. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. -M.: Лабформ, 1997.- 1325 с.
11. Mожаев E.A., Литвинов A.H. Биомониторинг металлов // Гигиена и санитария. - 1988. - № 7. С. 53 - 56.
12. Ревич БА. Гигиеническая оценка содержания некоторых химических элементов в биосубстратах человека // Гигиена и санитария. - 1986.- № 7. С. 59 - 62.
13. Рутковский Г.В., Mалов A.M., Сибиряков В.К. и др. Mетодические подходы к созданию стандартного образца предприятия состава ртути в крови // Здоровье и окружающая среда:. Вып. 10/ ГУ «Республиканский научно-практический центр гигиены». - Mmœ: Друк-С, - 2007. - С. 946 - 957.
14. Stanton A. Glantz, McGraw-Hill. Primer ofBiostatistics. Fourth edition, Inc.- New York.: 1997. - pages: xvi+473+computer program.
15. Ertas O.S., Tezel H. A validated cold vapor-AAS method for determining mercuiy in human red blood cells // J. Phaim Biomed. Anal. - 2004. - Nov. 19., Vol. 36(4), -P 893 - 897.
16. МУК 4.1.1470-03 «Атомно-абсорбционное определение массовой концентрации ртути в биоматериалах при гигиенических исследованиях» // Сборник методических указаний - 4.1. Методы контроля. Химические факторы - Атом-но-абсорбционное определение ртути в объектах окружающей среды и биологических материалах. М.: Минздрав России, 2003.
17. ГОСТ 26927-86 «Сырье и продукты пищевые. Методы определения ртути».
18. Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. Меньшикова В.В. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
19. Пыхтеева Е.Г., Большой Д.В., Селиваненко Н.Г., Шафран Л.М. Кадмий и ртуть. Токсикология тяжелых металлов - облигатных контаминантов природных вод. http://www.ecologylife.ru
20. Абрамова Ж.И., Гадаскина И.Д Ртуть и ее соединения. Руководство по гигиене труда. - М., Медгиз, 1963. - Т. 2. - С. 281 - 284.
21. Критерии санитарно-гигиенического состояния окружающей среды. Ртуть. - ВОЗ. Женева, 1979. - 246 с.
22. Pathological, clinical and epidemiological research about Minimata desease, 10 years after. Research commitee on Minimata desease. - Kumamoto, Kumamoto University. 1975. -149 p.
23. 23 Ewers U., Krause C., Schulz C., Wihlhem M. Reference values and human biological monitoring values for environmental toxins // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1999 .- V72.- P. 255 - 260.
24. 24. Drasch G., Bose-O'Reilly S., Maydl S., Roider G. Scientific comment on the German human biological monitoring values (HBM values) for mercury // Int. J. Hyg. Environ. Health. - 2002. - V205. - P. 509 - 512.
Malov A.M., Sibiryakov V.K., Semyonov Ye.V., Kolbasova Ye.N. Storing of mercury in blood of rats and humans
Institute of Toxicology, St. Petersburg
Based on experimental and clinical data, the distribution of mercury between blood erythrocytes and plasma in rats and humans was investigated. The top reference limit value of the mercury concentration in the human whole blood equal to 7 mkg/dm3 was substantiated.
Материал поступил в редакцию 01.11.2010 г
УДК 615.33
Сравнительное изучение токсического действия пептидных антибиотиков
Результат определения МТД для зервамици-нов не выявил достоверных различий между 2гу-ИА и 2гу-ИВ. По результатам исследования зервамицин может быть отнесен ко 2-му классу токсичности (2>ЛД50>20 мг/кг) для мышей CD-1. Пептидный антибиотик ареницин, в отличие от зервамицинов, может быть отнесен к 3-му классу токсичности (20>ЛД50>700 мг/кг) для мышей CD-1. Пептидный антибиотик аурелин проявляет
Дьяченко И.А.1, Мурашев А.Н.1, Якименко, З.А.2, Баландин С.В.2, Овчинникова Т.В.2
1 Лаборатория биологических испытаний Филиала ИБХ РАН, г Пущино
2 Учебно-научный центр ИБХ РАН, г Москва
выраженную токсическую картину в дозе 75 мг/кг, сопровождающуюся гибелью экспериментального животного. Однако в дозе 50 мг/кг гибель не наблюдалась, что позволяет предварительно отнести исследуемый пептидный антибиотик к 3-му классу токсичности для мышей CD-1.
Ключевые слова: токсичность, антибиотик
Токсикологический вестник № i (i i 2)
Введение. Антимикробные пептиды (АМП) - эволюционно древние факторы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в защите многоклеточных организмов от инфекции. К настоящему времени определены структуры около тысячи природных АМП. Фундаментальные структурно-функциональные исследования АМП тесно связаны с их важным прикладным значением: природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим антимикробным средствам. В связи с этим поиск природных АМП и создание новых пептидных антибиотиков на их основе являются актуальными задачами современной биологической науки.
В настоящей работе нами было проведено сравнительное исследование представителей трех классов пептидных антибиотиков: ареницина из цело-моцитов морского червя Arenicola marina [1,2], аурелина из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita [3] и зервамицина из мицелия спорообра-зующего гриба Emericellopsis salmocynnemata [4].
Ареницин является эндогенным пептидным антибиотиком беспозвоночного животного - пескожила морского, относящегося к классу Polychaeta (многощетинковые) типа Annelida (кольчатые черви). Пептид вырабатывается целомоцитами (фагоцитирующими клетками целома червя) и обладает антибактериальной и противогрибковой активностью. В ходе предшествующей работы нами были определены полные первичные структуры двух изоформ ареницина, ареницина-1 и ареницина-2, имеющих молекулярную массу 2758,3 Да и 2772,3 Да, соответственно, и различающихся лишь одним аминокислотным остатком в положении 11 (остаток Val в ареницине-1 и остаток Ile в ареници-не-2) [1]. Механизм действия ареницина предположительно состоит в избирательном нарушении барьерной функции клеточных мембран патогенных микроорганизмов, не затрагивающем мембраны клеток организма-хозяина. Ареницин является представителем принципиально нового семейства антимикробных пептидов и может найти применение в качестве антибиотика широкого спектра действия.
Аурелин, проявляющий антимикробную активность в отношении грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, был выделен из из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita -древнего беспозвоночного животного [тип - кишечнополостные (Cnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)]. Ранее нами была укстановлена полная первичная структура аурелина, который имеет молекулярную массу 4297 Да, содержит 40 аминокислотных остатков, в том числе 6 цисте-инов, образующих три дисульфидные связи [3]. По этому признаку, а также по структуре предшественника аурелин близок к АМП семейства де-фенсинов и некоторым другим цистеин-содержа-
щим АМП. Вместе с тем, порядок расположения остатков цистеина сближает его с представителями семейства блокаторов К+-каналов из морских анемон (BgK, ShK и др.) - молекулами, обладающими также иммуносупрессорными свойствами
[3].
Зервамицины относятся к пептаиболам -пептидам, содержащим в своей структуре а, а-диалкиламинокислоты и С-концевые ами-носпирты. Из культур различных штаммов гриба Emericellopsis salmosynnemata ранее было выделено 11 изоформ зервамицинов, среди которых преобладающими являлись зервамицин IIA (Zrv-IIA) и зервамицин IIB (Zrv-IIB). Первичные структуры зервамицинов Zrv-IIA и Zrv-IIB различаются лишь одним остатком в положении 4 (а-аминоизомасляная кислота в Zrv-IIA и D-изовалин в Zrv-IIB) [4]. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они обладают не только выраженной активностью против грам-положительных и грам-отрицательных бактерий
[4], но и проявляют антипротозойное действие по отношению к устойчивым формам возбудителя малярии Plasmodium falciparum [5].
Биологические свойства ареницина, аурелина и зервамицина позволяют рассматривать их в качестве потенциальных антибиотических лекарственных средств. Целью данного исследования было сравнительное изучение токсичности перечисленных выше пептидных антибиотиков на мышах CD-1.
Методика исследования. Рекомбинантные ареницин и аурелин были получены, как описано ранее [6-8]. Были получены конструкции для гете-рологичной экспрессии ареницина и аурелина под контролем промотора фага T7 в виде гибридных белков с бактериальной кетостероид-изомеразой и тиоредоксином А E.coli, а также продуценты пептидов на основе штамма E .coli BL21(DE3). Схема выделения рекомбинантных ареницина и аурелина включала аффинную металло-хелатную очистку гибридных белков, их расщепление бромцианом по искусственно введенному остатку метионина, а также финальную очистку целевых пептидов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ [6-8].
Исследования выполнялись на мышах CD-1. Животные были получены из НПП ФИБХ «Питомник лабораторных животных» и содержались в барьерных помещениях в стандартных условиях, рекомендуемых для содержания грызунов [9]. Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены биоэтической комиссией ФИБХ и соответствовали «Принципам надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р-53-434-2009). Пептиды вводили внутрибрю-шинно и внутривенно, используя стандартные объемы введения [10].
Определение класса токсичности, а также летальных (ЛД16, ЛД50) и максимальных толерантных доз (МТД) выполняли при однократном вве-
Я H ВАРЬ
- Ф Е В РАЛ Ь 20 1 2
дении вещества самцам мышей. Для определения класса токсичности использовали рекомендации руководства 420 OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) [11] классификацию И.В. Березовской [12]. Введение препаратов начинали со стартовой дозы 50 мг/кг. В зависимости от токсических проявлений в предыдущей группе следующим группам животных вводилась более высокая или низкая доза препарата. После введения за всеми животными проводилось наблюдение в течение 14 дней. Расчет ЛД16 и ЛД50 производили методом наименьших квадратов с использованием пробит-анализа [10]. За МТД принималась максимальная доза, при которой наблюдались выраженные признаки токсичности у нескольких животных и гибель не более одного животного в группе.
Результаты и обсуждение. Определение ЛД50 показало, что внутрибрюшинное введение зерва-мицинов в дозе 20 мг/кг вызывает практически однотипную клиническую картину отравления, которая не зависит от изоформы вводимых зерва-мицинов: через 1-3 минуты после введения отмечается выраженное угнетение животных, резкое снижение локомоторрной активности, урежение дыхания, кома в течение последующих 1-2 часов. Гибель животных регистрируется в течение первых двух часов. Результаты клинического осмотра показали, что у животного происходит угнетение дыхательного центра с выраженным угнетением центральной нервной системы. Результаты расчета ЛД50 представлены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели летальных доз лД16, лД50 и максимально толерантная доза (МтД) при его однократном введении самцам мышей CD-1.
Показатель Zrv IIA Zrv IIB Ареницин
ЛД16, мг/кг 4,3 4,2 32,6
ЛД50, мг/кг 5,5 5,4 38,1
МТД, мг/кг 4 4 30
Внутривенное введение ареницина в дозе 50 мг/кг вызвало гибель экспериментальных животных. Результаты расчета ЛД50 представлены в табл. 1. Последующее снижение дозировки до 45 мг/кг и 40 мг/кг приводило к гибели 20% животных из каждой экспериментальной группы. Осмотр в клетке показал, что после введения у всех экспериментальных животных наблюдалось прерывисто-поверхностоное дыхание Чейн-Стокса, которое свидетельствовало о высокой токсичности исследуемого препарата и сердечной недостаточности у экспериментальных животных. Обнаружено резкое покраснение кончиков ушей и хвоста, которое спадало через 10 минут после введения. Данный признак указывает на расширение периферических сосудов, возможную транзиторную гипертензию и учащенное сердцебиение. Осмотр животного на открытой площадки показал вялую двигательную активность и полное отсутствие исследовательской активности. У животных, получавших высокие дозировки ареницина, наблюдался тремор конечностей и общая прострация. Большинство животных при нахождений на открытой площадке передвигались несколько шагов в коматозном состоянии и замирали в сгорбленной позе. Обнаружено отсутствие реакций на резкий звук и прикосновение. В группах, получавших высокие дозировки, наблюдалась гибель животных через 15-18 минут после введения.
Снижение дозировки ареницина до 35 мг/кг способствовало выживанию 75% экспериментальных животных на 14 сутки после введения. Осмотр животных в клетке показал, что сразу после введения обнаружено покраснение ушей и кончика хвоста, однако уже через 7-8 минут покраснение спадало. Осмотр животного на открытой площадке: локомоторная активность - 1-2 (по 3-балльной шкале), исследовательская - 1-2 (по 3-балльной шкале), обнюхивание - в норме. Данные признаки наблюдались на протяжении 4-6 часов после введения, в дальнейшем животные не отличались по поведению от интактных животных.
Определение летальной дозы и МТД при внутривенном введении аурелина вызывает однотипную с ареницином клиническую картину отравления: через 1-3 минуты после введения отмечается угнетение двигательной и исследовательской активности, урежение дыхания, сгорбленная поза. Введение дозы 75 мг/кг вызывало гибель экспериментального жовотно-го через 2 часа после введения. Стартовая доза 50 мг/кг не вызывала гибели животных, однако, были обнаружены выраженные токсические признаки, характерные для ареницина.
Введение ареницина или аурелина в дозе <35 мг/кг не оказывало негативного влияния на состояние животных, поведение которых не отличалось от такового у интактных особей.
Токсикологический вестник № i (i 12)
Выводы. Результаты определения МТД для пептида зервамицина не выявил достоверных различий между 2гу-ПА и 2гу-ПВ. Клинические проявления для данных петидов были схожими. По результатам исследования зервамицины могут быть отнесены ко 2-му классу токсичности (2>ЛД50>20 мг/кг) для мышей CD-1.
Результаты клинического осмотра в первый день после введения ареницина показали, что гибель животных наблюдается в первые 20-25 минут после введения препарата в дозе 50 мг/кг. Проявление прерывистого дыхания и синюшной кожи сопровождается гибелью животного. Обнаруженные клинические признаки указывают на угнетение дыхательного центра, сердечно-легочную недостаточность, подавление ЦНС. Пептидный антибиотик ареницин может быть отнесен к 3-му классу токсичности (20>ЛД50>700 мг/кг) для мышей CD-1.
Пептидный антибиотик аурелин проявляет вы-
раженную токсическую картину в дозе 75 мг/кг с гибелью экспериментального животного. Однако, в дозе 50 мг/кг гибель не наблюдалась, что позволяет предварительно отнести исследуемый пептидный антибиотик к 3-му классу токсичности для мышей CD-1.
Введение ареницина или аурелина в дозе <35 мг/кг не оказывает негативного влияния на состояние животных, поведение которых не отличается от такового у интактных особей.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (проект НК-602П/19).
список литературы
1. 1 . Ovchinnikova T.V., Aleshina G.M., Balandin S.V., Krasnosdembskaya A.D., Markelov M.L., Frolova E.I., Leonova Y.F., Tagaev A.A., Krasnodembsky E.G., Kokryakov V.N. Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina // FEBS Lett. -2004. - V. 577. - No.1-2. - P.209-214.
2. 2. Овчинникова Т.В., Алешина Г.М., Баландин С.В., Маркелов М.Л., Краснодембская А.Д., Кокряков В.Н. Пептиды ареницины, выделенные из морского кольчатого червя Arenicola marina, обладающие антимикробным действием. // Патент на изобретение № 2261866. Заявка №2004103808. Приоритет изобретения 10 февраля 2004 г Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10 октября 2005 г
3. 3. Ovchinnikova T.V., Balandin S.V., Aleshina G.M., Tagaev A.A., Leonova Y.F., Krasnodembsky E.G., Men'shenin A.V., Kokryakov V.N. Aurelin, a novel antimicrobial peptide from jellyfish Aurelia aurita with structural features of defensins and channel-blocking toxins. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006. -V.348. - No.2. - P.514-523.
4. 4. Argoudelis A.D., Dietz A., Johnson L.E. Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by Emericellopsis salmosynnemata. // J. Antibiot. - 1974. - V.27. - No.5. - P.321-328.
5. 5. Nagaraj G. Uma M.V. Shivayogi M.S. Balaram H. Antimalarial activities of peptide antibiotics isolated from fungi. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001.- V.45 - No.1. - P. 145-149.
6. 6. Баландин С.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, кодирующая гибридный белок, содержащий антимикробный пептид ареницин морского кольчатого червя Arenicola marina, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - продуцент гибридного белка, содержащего ареницин // Патент на изобретение № 2316590. Приоритет изобретения 16 июня 2006 г. Заявка на патент РФ №2006121112 (022922) от 16 июня 2006г. Решение о выдаче патента от 02 июля 2007г Зарегистрировано в Государственном реесте изобретений РФ 10 февраля 2008 г.
7. 7. Баландин С.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Способ получения антимикробного пептида ареницина // Патент на изобретение № 2316595. Приоритет изобретения 16 июня 2006 г. Заявка на патент РФ №2006121111 (022921) от 16 июня 2006 г. Решение о выдаче патента 12 июля 2007 г. Зарегистрировано в
Государственном реесте изобретений РФ 10 февраля 2008 г
8. 8. Баландин С.В., Финкина Е.И., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Плазмидный вектор pE-Trx-Aur, штамм Escherichia coli для экспрессии антимикробного пептида аурелина и способ получения указанного пептида // Заявка на патент РФ №2009143085 от 24.11.2009.
9. 9. The Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996.
10. 10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005.
11. 11. Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. Guideline 420. Paris: OECD, 2001.
12. 12. Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парантеральных способах введения // Хим.-фарм. ж.-2003.-т.37. - № 3. - С. 32-34.
Dyachenko I.A.1, Murashev A.N.1, Yakimenko Z.A.2, Balandin S.V. 2, Ovchinnikova T.V.2
Comparative investigation of general toxic action of peptidic antibiotics
'Laboratory of Biological Testing, Branch of M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry, Settlement Pushchino, Moscow Region draining and Research Center, M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Research Institute of Bioo^anic Chemistry, Moscow
The outcome of the determination of the Maximum tolerance dose (MTD) did not show any authentic differences between Zrv-IIA and Zrv-IIB. Based on investigation results, Zervamicin can be referred to toxicity class 2 (2>LD50>20 mg/kg for mice CD-1). The peptidic antibiotic Arenicin unlike Zervamicins could be allocated to toxicity class 3 ( 20>LD50>700 mg/kg for mice CD-1). The peptidic antibiotic Aurelin manifests an expressed toxic picture at a dose of 75 mg/kg followed by the death of the laboratory animal. However, the death was not noted at the dose of 50 mg/kg which allows to presumably allocate the peptidic antibiotic investigated to toxicity class 3 for mice CD-1.
Материал поступил в редакцию 21.06.2010 г.
