CC BY
45
- Физика -
УДК 577.3
И.Н. Николаев, О.В Левцова, К.В. Шайтан
ДИНАМИКА ЗЕРВАМИЦИНА 11В В ВОДЕ И В МЕТАНОЛЕ
Приводятся материалы по сравнительному изучению молекулярной динамики (МД) зервамицина 11В в воде и в металоне. Исследовано влияние аминокислотных замен на динамическое поведение и стабильность структуры пептида, также проведен сравнительный анализ динамики трех мутантов зервамицина II: с заменой а&^1у в 7-м (&уП^1у7) и 9-м положениях ^гуП^1у9), а также с добавленным gly в 8-е положение ^гуП^1у8). Определена последовательность аминокислот, отвечающая за отсутствие шарнирных движений у коротких пептаиболов.
Ключевые слова: молекулярное моделирование, молекулярная динамика, пептиды, аминокислотные остатки, мембрана, пеп-таиболы, флуктуации.
Возрастающая устойчивость патогенных микроорганизмов к используемым антибиотикам является серьезной медицинской проблемой [1]. В связи с этим весьма актуальным становится исследование новых антимикробных агентов, в частности, мембран-активных пептидов с целью создания препаратов нового поколения с заданной активностью и селективностью.
Среди мембран активных пептидов особой популярностью пользуются пептаиболы. Пептаиболы выделяются из почвенных грибов родов Trichoderma и EmericeПopsis и представляют собой спиральные пептиды из 16-22 остатков с целым рядом специфических аминокислот, которые взаимодействуют с клеточной мембраной и образуют ионные каналы, тем самым, нарушая электрохимический баланс клетки. Они обладают интересными свойствами - несколькими хорошо определенными уровнями проводимости и потенциал-зависимостью. Размеры каналов, образованных молекулами пептаиболов, сравнительно небольшие, что делает их удобным объектом для исследования различных
НИКОЛАЕВ Иван Никитич - к.ф.-м.н., доцент, проректор по учебной работе ЯГУ имени М.К. Аммосова.
E-mail: n_ivan_n@mail.ru
ЛЕВЦОВА Ольга Владимировна - научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
E-mail: shaytan49@yandex.ru
ШАЙТАН Константин Вольдемарович - д.ф.-м.н., профессор, зав. кафедрой биоинженерии МГУ имени М.В. Ломоносова.
E-mail: shaytan49@yandex.ru
свойств мембранных каналов методами компьютерного моделирования.
Динамика антимикробных пептидов обсуждается нами на примере одного из ярких представителей класса пептаиболов - зервамицина IIB, выделяемого из Emericellopsis salmosynnemata. Приводимые данные важны для дизайна новых пептидных антибиотиков с заданной селективностью и активностью.
Зервамицин IIB - представитель класса пептаиболов, синтезируется грибом Emericellopsis salmosynnemata [2]. Молекула ZrvIIB состоит из 16 аминокислотных остатков:
Ace0-Trp1-Ile2- Gln3-Iva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9--Hyp10-Gln11-Aib12-Hyp13-Aib14-Pro15-Phl16
Ранее было показано, что зервамицин IIB обладает нейролептическим действием. Он уменьшает температуру тела и спонтанную двигательную активность у мышей в концентрациях порядка 0,5-12 мг/кг [3, 4].
В работе L.L. Karle and all [5] методом рентгеноструктурного анализа была определена структура Leu-зервамицина (Zrv-Leu), где Trpl заменен на Leu. В кристалле пептиды были упакованы в связки, формирующие каналы с молекулами воды.
Боковой радикал Gln11 одного из пептидов в каждой связке был обращен в пору канала. На основе этих данных была предложена модель, согласно которой переход из закрытого в открытое состояние под действием трансмембранного потенциала, происходит за счет движения боковых радикалов остатков Gln11 [5, 6, 7]. Однако данная модель не объясняет асимметрию вольтамперной характеристики и высокую потенциал-зависимость.
1S
Методом двумерного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) было показано, что зервамицин 11В обладает спиральной структурой в растворах различной полярности (от смеси хлороформ/метанол (9:1, ^) до смеси метанол/вода (1:1, v/v)), а также в растворе мицелл [8, 9]. Пептид формирует спираль длиной 26 А с изгибом на остатке Нур10, равном ~ 40° в метаноле и ~26° в мицеллах ДФХ. вконец пептида представляет собой а-спираль, а С-конец 310-спираль (рис. 1). В отличие от
Молекула зервамицина IIB представляет собой ам-фифильную структуру: полярные остатки пептида расположены на выпуклой поверхности изогнутой спирали, в то время как вогнутая сторона является гидрофобной, помимо боковых радикалов полярных остатков (Thr6, Hyp10, Gln11 и Hyp13) на выпуклой стороне экспонированы карбонильные кислороды, не участвующие во внутримолекулярных водородных связях, остатков Aib7, Aib9 и Hyp10. При формировании канала из связки параллельных молекул ZrvIIB данные карбонильные кис-лороды могут формировать сайт связывания для моновалентных катионов, заменяя им гидратную оболочку и определяя селективность канала. Подобным образом устроены сайты связывания грамицидинового канала и калиевых каналов KcsA, MthK и KvAp [11, 12, 13,14].
Длинные пептаиболы не обладают выраженной спиральной структурой в растворителе и только при связывании с поверхностью мембраны они способны образовывать спираль. Стабильность структуры зервамицина II в растворителях различной полярности дополнительно исследована в численных экспериментах, а также определено влияние на структуру и динамику зервамицина II аминокислотных замен в области изгиба спирали Aib7-Leu8-Aib9-Hyp10.
МД-протокол
Заряды на атомах для неприродных аминокислотных остатков Aib и Hyp были рассчитаны по Малликену методом Хартри-Фока.
МД расчёты 4-х пептидов (нативный зервамицин II, с заменой aib-gly в 7-м и 9-м положениях, а также с добавленным gly в 8-е положение) проводились в воде и
длинных пептаиболов, например аламетицина, 2гуНВ не обладает высокоамплитудными движениями, изгибающими спираль. Вероятно, это связано с тем, что длина молекулы достаточно маленькая, ее уменьшение за счет шарнирных движений может значительно изменить ди-польный момент пептида, а эффективной длины мономеров будет недостаточно, чтобы образовать трансмембранный канал [10].
метаноле. Использовались полноатомное силовое поле, а также стохастическая динамика, не приводящая к нарушению принципа равнораспределения энергии по степеням свободы. Основные параметры МД-протокола:
• Программный пакет Gromacs 3.2.1
• Потенциальное поле OPLS-AA
• Размер ячейки: 47А*3бА*3бА
• Длина траектории 10 нс
• Температура термостата 300 К
• Термостат: стохастическая динамика
• Постоянная времени изменения среды т=0,1пс
• Радиус обрезания для электростатических взаимодействий Rel=20А
• Радиус обрезания для взаимодействия Ван-дер-
Ваальса =20А
vdW
• Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле. Начальные скорости определялись с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла.
• Шаг интегрирования 1 фс.
• Шаг записи с траекторный файл 0,1 пс.
Влияние аминокислотных замен на динамику спиральной структуры зервамицина ИВ в воде и в метаноле
Исследовались 3 мутанта 2^П: с заменой шЬ^1у в 7-м и 9-м положениях (21гП^1у7, 2^П^1у9), а также с добавленным g1y в 8-е положение (21гП^1у8). Для оценки динамики изменения длины молекулы и наличия шарнирных движений рассчитывались распределения для расстояний между Са-атомами первого и последнего остатков.
а-С
спираль и г-
0 1- Г ' 2 _ [з А ♦ .5 „ А у тт7 т 8 _Ю _11
Ac 7W VI 7Q J I
U
O** U* U* P* FI
.13
310-спираль
,14
,16
Рис. 1. Водородные связи в молекуле зервамицина IIB------показана бифуркационная водородная связь.
Остатки Ace, Aib, Iva, Hyp и Phl в однобуквенном коде обозначаются Ac, U, J, O и Fl соответственно
Нативный зервамицин II в отличие от аламетицина сохраняет спиральную структуру в течение 10 нс и среднеквадратичное отклонение (RMSD) С^атомов составляет порядка 1,4 А, что хорошо согласуется с данными ЯМР
В результате уменьшается подвижность в области изгиба спиральной структуры ZrvII-gly7. Стерические ограничения aib в 7-м положении препятствуют образованию этих водородных связей, а замена aib на Gly делает замыкание водородных связей более вероятным.
Рис. 3. Распределение расстояний между атомом водорода Aib9 и карбонильным атомом кислорода Ile5
Замена Aib-Gly в 9-м положении также вызывает структурные изменения в спиральной структуре пептида (рис. 4). Как и в случае замены в положении 7, наблюдалось уменьшение интенсивности флуктуаций длины молекулы в обеих растворителях. Причем средняя длина молекулы зервамицина в метаноле составила 24 А в воде и 19 А в метаноле. На рис. 4 Б видно уменьшение длины ZrvII-gly9 в метаноле относительно нативного зервами-цина.
Б
Рис. 2. Распределение расстояний между Са- атомами первого и последнего остатков молекулы нативного зервамицина II (А) с заменой а&7^1у7 (Б) в воде и в метаноле
Как видно из рис. 2 А, изменение длины молекулы нативного зервамицина II составляет порядка 35% в воде и в метаноле. Структура 2Ш^1у7 является более жесткой. При этом значительных структурных изменений не наблюдается, так как 7-й аминокислотный остаток находится в а-спиральной части пептида. Замена стерически ограниченного остатка АШ на лабильный G1y могла бы привести к увеличению конформационной подвижности и возможности излома спирали. Однако в случае с зер-вамицином II, наоборот, данная замена в 7-м положении несколько уменьшила интенсивность шарнирных движений молекулы (рис. 2 Б). Это связано с образованием водородной связи между атомом водорода АШ9 и карбонильным кислородом Пе5 (рис. 3).
А
Время, пс Б
Рис. 4. А) Распределение расстояний между Са-атомами первого и последнего остатков для молекулы зервамицина II (при замене аіЬ9 на §1у9) в воде и в метаноле;
Б) Зависимость длины молекулы от времени
Молекула зервамицина 2гуП-§1у9 (с заменой АіЬ на G1y в 9-м положении) сохраняет спиральную структуру в обоих растворителях, но в метаноле структура выглядит более компактной и наблюдается более сильный изгиб спирали в области G1y9-Hyp10 (рис. 5).
С-конец
Отметим, что аминокислотный остаток Иу9 находится на границе а-спиральной части пептида, непосредственно перед Нур10, создающим изгиб спирали. Поэтому замена А1Ь на более лабильный остаток 01у вызывает в данном положении дополнительную подвижность в области изгиба, что приводит к реорганизации внутримолекулярных водородных связей пептида в метаноле (рис. 6). Молекулы воды более активно конкурируют с атомами аминокислотных остатков за образование водородных связей и поэтому в воде данные структурные изменения практически отсутствуют.
Для пептида в воде наблюдается образование водородной связи также между кислородом Ьеи8 и водородом А1Ь12, что свойственно а-спирали. Это соответствует более вытянутой структуре пептида. В метаноле водород А1Ь12 образует водородную связь с А1Ь9, что свойственно спирали 3 и соответственно вызывает изгиб пептида.
А
Б
Рис. 5. Структура зервамицина II с заменой аіЬ9-01у9 в воде (А) и в метаноле (Б) (выделен 01у9)
Рис. 6. Распределения длины водородной связи для ZrvII-01у9: А - в воде, Б - в метаноле
Обсуждаемая замена должна, предположительно, негативно сказаться на активности зервамицина, так как уменьшает эффективную длину молекулы до 17 А. Пептидная связь имеет дипольный момент, равный 3,5 D, направленный параллельно связям C=O и N=H. В конформации спирали эти связи ориентированы практически в одном направлении, что создает дипольный момент на молекуле зервамицина порядка 50 D. Внешнее электрическое поле мембраны действует на дипольный момент и дополнительно стабилизирует трансмембранное положение пептида. Уменьшение эффективной длины молекулы и изгиб спирали сильно уменьшает дипольный момент и должно крайне негативно сказываться на стабилизации трансмембранного состояния и агрегации с последующим формированием ионного канала.
Добавление Gly в восьмое положение полностью воссоздает консервативную последовательность Aib-Gly-Leu-Aib-Pro, ответственную за высокоамплитудные движения в длинных пептаиболах (рис. 7).
Как видно из этого рисунка, у молекулы пептида в обоих растворителях наблюдаются флуктуации длины с периодом порядка 6 нс, однако эти флуктуации сильно различаются по амплитуде: для зервамицина в воде они составляют 0,3 нм, а в метаноле около 0,7 нм. Таким образом, амплитуда флуктуаций возрастает при уменьшении полярности растворителя. Это может быть объяснено периодическим разрывом и образованием водородных связей (рис. 8). В нативном зервамицине II нет водородной связи между остатками Trh6 и Leu9, а для ZrvII-gly9 она с небольшой вероятностью образуется в воде и с большей - в метаноле. Для водородной связи между Leu9 Aib13 для ZrvII-gly9 в метаноле появляется второй пик, вероятно, разрыв этой водородной связи способствует увеличению амплитуды движений, изгибающих спираль (рис. 7 Б).
А
А
М \! %.
!« ■ \і Л
ft ^ Г'ц
! V
"Ч $
W
Время,ПС
Б
Рис. 7. А) Распределение плотности вероятности расстояния между С-атомами первого и последнего остатков молекулы зервамицина II с добавленным остатком 01у в 8-е положение в воде и в метаноле; Б) Зависимость длины молекулы от времени
Б
Рис. 8. Распределение расстояний между атомами кислорода Leu9 и водорода А1Ь13 (—) и - кислорода ТЬтб и водорода Leu9 (—) для ZrvII-G1y8 в воде (А) и в метаноле (Б)
Молекула зервамицина II в отличие от аламетицина сохраняет спиральную структуру в воде (в течение не менее 10 нс). В нативном зервамицине и зервамицине с заменой АЬ^1у в 7-м и 9-м положениях не наблюдается высокоамплитудных шарнирных движений, изгибающих спираль. Однако ZrvII-g1y9 в метаноле компактизуется за счет изгиба в области G1y9 за счет реорганизации водородных связей, в воде подобных структурных изменений не наблюдается. Добавление G1y в 8-е положение вызывает появление значительных флуктуаций длины пептида в метаноле, в воде амплитуда колебаний значительно меньше. Таким образом, в мутантах ZrvII-g1y9 ZrvII-g1y8 наблюдаются структурные изменения при уменьшении полярности растворителя. Это может критически повлиять на активность зервамицина II, так как длина молекулы ZrvII составляет около 24А, при наличии шарнирных движений длина молекулы может уменьшаться до 16А, как в случае с ZrvII-g1y9, что недостаточно для образования мембранного канала.
Длинные пептаиболы в отличие от зервамицина II обладают шарнирными движениями, которые в значительной степени способны изменять длину молекулы. Это изменение длины не уменьшает активность длинных пептаиболов, а предположительно способствует агрегации молекул и формированию канала.
Таким образом, замены в области изгиба спирали АШ7-Ьеи8-АШ9-Нур10 способны не только изменить структуру и динамику молекулы зервамицина II и сделать его чувствительным к растворителю, а также могут в значительной степени сказаться на мембранной активности пептида.
А
Димеризация молекул зервамицина ПВ в воде
Б
Для исследования способности молекул зервамицина ПВ к комплексообразованию была изучена динамика 2-х молекул зервамицина ПВ в водном окружении. В начальной системе молекулы пептида были расположены взаимоперпендикулярно на расстоянии 1,5 нм между центрами масс в кубической ячейке воды (5,6 нм х 5,6 нм х 5,6 нм), что соответствует концентрации 0,02М. За 20 нс равновесной молекулярной динамики молекулы не образуют больше одной водородной связи (рис. 9 А).
Как видно из рис. 9 (Б, В), молекулы зервамицина ПВ не образуют комплекс, а находятся на расстоянии друг от друга, и поэтому даже начальное достаточно близкое взаиморасположение 2ігПВ не приводит к комплексообразованию в водном окружении. Это хорошо согласуется с данными ЯМР [10]. Значение RMSD для каждой из молекул зервамицина ПВ за 10 нс динамики достигает 0,4 нм (рис. 9 А) и в дальнейшие 10 нс остается на этом уровне. Подобное увеличение значения RMSD свидетельствует о нестабильности структуры молекулы 2іуПВ при высокой концентрации в растворе пептида и дестабилизирующем взаимовлиянии молекул зервами-
В
Рис. 9. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) для Са-атомов молекул зервамицина ПВ относительно начального положения (А). Взаиморасположение молекул зервамицина ПВ в начале динамики (Б) и через 20 нс релаксации (В)
цина. Вероятно, причина дестабилизации спиральной структуры - гидрофобный эффект, возникающий между неполярными аминокислотными остатками.
H h t e p a t y p a
1. Chastre J. Evolving problems with resistant pathogens// Clin. Microbiol. Infect., 14 Suppl 3, 2008. - P. 3-14.
2. Argoudelis A.D., Dietz A., Johnson L.E. Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by emericellopsis salmosynnemata// J. Antibiot. (Tokyo), 27, 1974. - P. 321-328.
3. Ovchinnikova T.V., Levitskaya N.G., Voskresenskaya O.G., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Ovchinnikova A.Y, Murashev A.N., Kamenskii A.A. Neuroleptic properties of the ion-channel-forming peptaibol zervamicin: locomotor activity and behavioral effects// Chem. Biodivers., 4, 2007. - P. 1374-1387.
4. Ovchinnikova T.V, Murashev A.N. The peptaibol antibiotic zervamicin displays neurotropic activity// Dokl. Biochem. Biophys., 414, 2007. - P. 146-148.
5. Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Agarwalla S., Balaram P. Crystal structure of [Leu1]zervamicin, a membrane ion-channel peptide: implications for gating mechanisms// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 88, 1991. - P. 5307-5311.
6. Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Agarwalla S., Balaram P. Conformation of the flexible bent helix of Leu1-zervamicin in crystal C and a possible gating action for ion passage// Biopolymers, 34, 1994. - P. 721-735.
7. Agarwalla S., Mellor I.R., Sansom M.S., Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Uma K., Krishna K., Sukumar M., Balaram P Zervamicins, a structurally characterised peptide model for membrane ion channels// Biochem. Biophys. Res. Commun., 186, 1992. - P. 8-15.
8. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Efremov R.G., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. Spatial structure of zervamicin IIB bound to DPC micelles: implications for voltage-gating// Biophysical Journal, 82, 2002. - P. 762-771.
9. Balashova T.A., Shenkarev Z.O., Tagaev A.A., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. NMR strucrure of the channel-former zervamicin IIB in isotropic solvents// FEBS Letters, 466, 2000. -P. 333-336.
10. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Balashova T.A., Yakimenko Z.A., Baru M.B., Mustaeva L.G., Raap J., Ovchinnikova T. V., Arseniev A.S. High stability of the hinge region in the membrane-active peptide helix of zervamicin: paramagnetic relaxation enhancement studies// Biochem. Biophys. Res. Commun., 325, 2004. - P. 1099-1105.
11. Golovanov A.P., Barsukov I.L., Arseniev A.S., Bystrov V.F., Sukhanov S.V., Barsukov L.I. The divalent cation-binding sites of gramicidin A transmembrane ion-channel// Biopolymers, 31, 1991. - P. 425-434.
12. Doyle D.A., Morais C.J., Pfuetzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity// Science, 280, 1998. - P. 69-77.
13. Jiang Y, Lee A., Chen J., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. The open pore conformation of potassium channels// Nature, 417, 2002. - P. 523-526.
14. Jiang Y, Lee A., Chen J., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. Crystal structure and mechanism of a calcium-gated potassium channel// Nature, 417, 2002. - P. 515-522.
I.N. Nikolaev, O.V Levtsova, K.V Shaitan
Dynamics of zervamicin IIB in water and in methanol
Materials of comparative study of molecular dynamics of zervamicin IIB in water and in methanol are given in the article. The influence of aminoacid substitutions on execution behavior and on stability of peptide structure was researched. Also a comparative analysis of dynamics of 3 mutants of zervamicin II: with substitution of aib-gly in 7th (ZrvII-gly7) and 9th (ZrvII-gly9) positions and with addied gly in 8th (ZrvII-gly8) position was carried out. Sequence of aminoacids responsible for absence of articulated motion of short peptaibols was determined.
Key words: molecular modeling, molecular dynamics, peptides, aminoacid residue, membrane, peptaibols, fluctuations.
-------------------------------------
