CC BY
65
— Физика —
УДК 577.3
И.Н. Николаев, О.В. Левцова, А.К. Шайтан, К.В. Шайтан
взаимодействие зервамицина іга с липидными бислоями
Показано, что методом МД [1, 2, 3] изучается взаимодействие молекулы зервамицина ІІВ с модельными мембранами эукариотических и прокариотических клеток. В качестве модели мембраны эукариотической клетки использовался липидный бислой, состоящий из молекул пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (ПОФХ), а для моделирования мембраны бактериальной клетки липидный бислой из пальмитоилолеоилфосфатидилглицерол (ПОФГ) и пальмитоилолеоилфосфатидил-этаноламин (ПОФЭ) в соотношении 1:4. Исследована способность к агрегации молекул зервамицина ІІВ на поверхности мембраны, а также взаимовлияние пептидов на процесс связывания и встраивания в мембрану.
Ключевые слова: равновесная молекулярная динамика, управляемая молекулярная динамика, биологические мембраны, пептиды, аминокислотные остатки.
Процесс встраивания антимикробных пептидов в липидный бислой является важнейшей стадией, определяющей их дальнейшее функциональное действие. В статье методом равновесной молекулярной динамики (МД) изучается связывание зервамицина 11В с поверхностью мембраны. Методом управляемой МД моделируется встраивание пептида в липидный бислой.
Стартовые системы липидных бислоев собирались с помощью молекулярного конструктора так, чтобы плотность липидов соответствовала экспериментальным данным и составляла порядка 64 А2. При сборке структуры для избегания излишней симметрии липидов каждая молекула поворачивалась вокруг своей оси на случайный угол. Полученные липидные бислои были подвергнуты релаксации в NVT ансамбле при температуре 500 К с фиксированными атомами фосфора в течение 100 пс с целью уменьшить упорядоченность алкильных хвостов. Затем бислои гидратировались так, чтобы на один липид
НИКОЛАЕВ Иван Никитич - к.ф.-м.н., доцент, проректор по учебной работе ЯГУ имени М.К. Аммосова.
E-mail: n_ivan_n@mail.ru
ЛЕВЦОВА Ольга Владимировна - к.ф.-м.н., научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
E-mail: shaytan49@yandex.ru
ШАЙТАН Алексей Константинович - ведущий инженер биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
E-mail: alexeyshaytan@gmail.com
ШАЙТАН Константин Вольдемарович - д.ф.-м.н., профессор, зам. зав. кафедрой биоинженерии МГУ имени М.В. Ломоносова.
E-mail: shaytan49@yandex.ru
приходилось минимум 32 молекулы воды. Далее в систему с отрицательно заряженными липидами ПОФГ были добавлены ионы №+ для нейтрализации заряда. Состав систем приведен в табл.
Таблица
Мембрана Липиды Кол-во молекул воды Противо- ионы
эукариотическая 64 ПОФХ 2404 0
прокариотическая 53 ПОФЭ 13 ПОФГ 2796 13 Na+
На последнем этапе в системы были добавлены молекулы зервамицина ІІВ выпуклой (полярной) стороной к липидным головкам на расстоянии около 0,7 нм от поверхности мембраны. После релаксации системы в течение 200 пс с фиксированными связями без внешнего электрического поля производится расчет рабочей траектории не менее 10 нс методом равновесной молекулярной динамики с включенным внешним электрическим полем
0,01 В/нм для имитации трансмембранного потенциала. Используется следующий протокол МД:
• Программный пакет Gromacs 3.2.1
• Потенциальное поле OPLS-AA
• Длина траектории 10 нс-16 нс
• Температура термостата 300 К
• Термостат: стохастическая динамика
• Постоянная термостатирования т = 0,2 пс
• Баростат Берендсена
• Постоянная баростатирования - 10 пс
• Давление баростата вдоль нормали мембраны: 1 бар
• Давление баростата перпендикулярно нормали мембраны:
-50 бар
• Радиус обрезания для электростатических взаимодействий Rel = 20 А
• Радиус обрезания для взаимодействия Ван-дер-
Ваальса Rvjw = 20 А
• Внешнее электрическое поле - 0,01 В/нм
• Для численного интегрирования использовался алгоритм Leap-frog.
• Начальные скорости определялись с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла.
• Шаг интегрирования 1 фс.
• Шаг записи с траекторного файла 1 пс.
При изучении поверхностного связывания молекулы зервамицина с мембраной особое внимание уделялось ориентации пептида относительно поверхности, стабильности спиральной структуры и образованию водородных связей между аминокислотными остатками и липидными головками.
Взаимодействие с ПОФХ
В настоящее время широко известны 2 модели образования каналов: бочковая модель (BS-модель) для незаряженных пептидов [4, 5, 6] и модель тороидальных пор для поликатионных пептидов [7, 8, 9].
Согласно BS-модели, пептид при взаимодействии с поверхностью мембраны не должен проникать глубоко в область липидных голов. Для уточнения модели вдоль траектории отслеживалось положение и ориентация пептида относительно поверхности липидного бислоя. Для этого в первые и последние 500 пс траектории определялось среднее положение Са-атомов для каждого аминокислотного остатка зервамицина IIB относительно поверхности мембраны. Граница мембраны определялась как z координата атомов фосфора (вдоль оси нормали мембраны).
Как видно из рис. 1, зервамицин 11В лишь незначительно приближается к поверхности мембраны, поворачиваясь на 180° вокруг своей оси так, что вогнутая сторона обращена к поверхности мембраны. При этом N-конец расположен несколько ближе к липидным головкам, чем C-конец. Вероятно, этому способствует взаимодействие собственного дипольного момента пептида с внешним электрическим полем. Молекула ZrvIIB не взаимодействует с гидрофобными хвостами липидов, а остается в водном окружении, взаимодействуя с полярными головками липидов. Особую роль в стабилизации данной конформации пептида относительно мембраны играют остатки Gln3 и Gln11, которые взаимодействуют с полярными головками липидов. Остальные полярные аминокислотные остатки Thr6, Hyp10 и Hyp13 обращены в воду. Вероятно, это связано с тем, что гидроксильные группы остатков Thr и Hyp несильно возмущают сеть водородных связей водного окружения. Полярные группы Gln при взаимодействии с водой должны искажать сеть водородных связей. Таким образом, остаткам Gln более выгодно взаимодействовать с полярными частями липидов.
Как видно из рис. 2, карбоксильный кислород бокового радикала Gln11 взаимодействует с положительно заряженной группой N(CH3)3. Атомы водорода аминной группы Gln11 взаимодействуют с отрицательно заряженными кислородами фосфатной группы ПОФХ липида, так как потенциально все 4 кислорода фосфатной группы могут образовывать водородные связи с атомами водородов. Поэтому оценивалось расстояние между атомом азота остатка Gln и фосфора липидной головки. Распределение вероятности для расстояния между атомом азота остатка Gln и фосфора липидной головки имеет широкий пик, что соответствует различным комбинациям водородных связей (рис. 2 А). Карбоксильный кислород бокового радикала Gln3 образует внутримолекулярную водородную связь, а атомы водорода аминной группы взаимодействуют с атомами кислорода фосфатной группы липидной головки. В случае Gln3 распределение вероятности
Рис. 1. Положение Са-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя. Зервамицин 11В на поверхности мембраны после 10 нс равновесной молекулярной динамики
А
ПОФХ
В
о ПОФХ
Г
Рис. 2. А - расстояние между карбонильным кислородом бокового радикала остатка Gln11 и атомом азота липида ПОФХ (1) и атомом азота радикала Gln11 и фосфатом ПОФХ (2); Б - расстояние между азотом бокового радикала остатка Gln3 и атомом фосфата липида ПОПХ. Схематическое изображение водородных связей для Gln11 (В) Gln3 (Г)
расстояния между атомом азота бокового радикала и атомом фосфора липида имеет более выраженные два максимума, чем для Gln11, благодаря тому, что атом кислорода участвует во внутримолекулярной водородной связи и частично препятствует свободному вращению аминной группы. Разрыв и образование водородных связей происходит медленнее. Таким образом, взаимодействие /туПБ с модельной эукариотической мембраной стабилизируется тремя водородными связями.
На рис. 3 отображено изменение z-координаты Са-атомов аминокислотных остатков относительно центра масс пептида. Молекула зервамицина ІІБ поворачивается вокруг своей оси на 5-й нс динамики, при этом вконец двигается по направлению к мембране, а С-конец от мембраны. Такая динамика поворота объясняется действием внешнего электрического поля на диполный момент пептида. На рис. 3 В видно, что Gln11 принимает свое окончательное положение в течение 6 нс, в то время как остальные аминокислотные остатки продолжают двигаться относительно центра масс. Вероятно, в данном случае Gln11 выполняет роль своеобразного якоря, взаимодействуя с липидными головками.
1.0-Г
0.8
0.6-
0.4-
5 I 0.2-
© ~
0.0-
X
к
о I— -0.2-
о
о
СС -0 4
0.
-0 6-
-0.8-
-1.0-
1 Са О Г'п
с. 03 — 3 Са — 4 Са 5 Са
V
О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Время, пс А
1.0-
6Са
0.8- 7 Са
— 8 Са
0.6- — 9 Са
10 Са
0.4-
0.2-
0.0-
-0.2- ей
-0.4-
-0.6-
-0.8- -1.0- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 І І I
1000 2000 3000
4000 5000 6000
Время, ПС
7000 8000 9000 10000
Б
Б
В
Рис. 3. Изменение z-координаты Са-атомов аминокислотных остатков молекулы зервамицина 11В относительно центра масс пептида
Таким образом, при взаимодействии с модельной эукариотической мембраной молекула зервамицина 11В ориентируется параллельно поверхности мембраны вогнутой стороной на расстоянии порядка 5А, то есть не погружается в область липидных головок, а остается в водном окружении, что согласуется с BS-моделью действия мембран-активных пептидов. Остатки Gln3 и Gln11 образуют 3 водородные связи с полярными головками липидов, тем самым стабилизируя положение пептида относительно поверхности бислоя.
Взаимодействие с ПОФЭ и ПОФГ
Для оценки взаимодействия зервамицина 11В с модельной мембраной прокариотической клетки, так же как и в предыдущем эксперименте, было рассчитано среднее положение Са-атомов пептида относительно поверхности мембраны за первые и последние 500 пс рабочей траектории.
Молекула зервамицина 11В за счет направления внутримолекулярных водородных связей, стабилизирующих спираль, обладает дипольным моментом, направленным от С-конца к Оконцу и приблизительно равным 50D, что эквивалентно зарядам +0,4е и -0,4е на N и С-концах. Фосфатидилглицероловые липиды придают поверхности мембраны суммарный отрицательный заряд. Таким образом, вконец молекулы ЕгуПВ, несущий локальный положительный заряд, притягивается к поверхности мембраны, а С-конец удаляется от поверхности мембраны на расстояние ~ 1,7 нм. Внешнее электрическое поле также способствует такой ориентации пептида. Так же как и в случае с мембраной ПОФХ, пептид взаимодействует исключительно с полярной частью мембраны, но в данном эксперименте ^конец входит в область липидных головок и образует как минимум четыре водородные связи с молекулами липидов. Карбонильный кислород остатка Асе0 взаимодействует с положительно заряженной группой МН3+ липида ПОФЭ. Так как все атомы водорода эквивалентны, наличие водородной связи оценивается по расстоянию между атомом кислорода Асе0 и атомом азота ПОФЭ. Атомы водорода при азоте (основной цепи и бокового радикала) остатка Gln3 и гидроксильная группа остатка Тктб взаимодействуют с атомами кислорода фосфатных групп липидов ПОФЭ. Как видно из рис. 5, распределения плотности вероятности расстояний между атомами, участвующими в образовании водородной связи, имеют один ярко выраженный максимум в отличие от аналогичных распределений для мембраны ПОФХ, где наблюдалось несколько широких максимумов. Это свидетельствует о более прочном взаимодействии 2гуПВ с бактериальной мембраной, чем с эукариотической.
— 1 2
\
; '\
і \ і/ \
і к
\ V
1 Ъ -
- л.
2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 „ 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6
Расстояние, А А
Рис. 4. Положение Са-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя в начальной конформации и после 10 нс равновесной динамики
Расстояние, Б
При взаимодействии молекулы зервамицина ІІБ с мембраной, состоящей из ПОФЭ и ПОФГ липидов, не наблюдается поворота на 180° вокруг своей оси. Из рис. 4 можно видеть, что пептид поворачивается на угол ~ 40° относительно поверхности мембраны. На рис. 6 представлена динамика движения Са-атомов аминокислотных остатков относительно центра масс пептида. Молекула 2гуііБ разворачивается ^концом к мембране за первые 6 нс и далее аминокислотные остатки на Оконце лишь незначительно изменяют свое положение относительно центра масс пептида. При этом движение данных остатков было согласованным (рис. 6 А). Движение аминокислотных остатков на С-конце менее согласовано. Это связано с тем, что остатки на Оконце взаимодействуют с поверхностью мембраны, что фиксирует их относительно друг друга. Остатки на С-конце взаимодействуют в основном с молекулами воды, что делает их более подвижными относительно друг друга.
Н
ПОФЭ
В
н2
о
'с' 'С' Gin
HN Н \,u
н2 NbU
2 \ / 1
\ ?7'н2 +
\|/>С ^МНз
—о—Р с
II Н 2
о
А
ПОФЭ
Г
Рис. 5. А - расстояние между карбонильным кислородом остатка Асе0 и атомом азота липида ПОФЭ (1), расстояние между гидроксильным кислородом остатка Thr6 и кислорода фосфатной группы липида ПОФЭ (2); Б - расстояние между атомом азота бокового радикала остатка Gln3 и атомом фосфора липида ПОФЭ (1) и между атомом азота пептидной связи остатки Gln3 и атомом фосфора липида ПОФЭ (2). Схематическое изображение связей для Thr, Ace (В) и Gln (Г)
Б
В
Рис. 6. Изменение 7-координаты Са-атомов аминокислотных остатков молекулы зервамицина ІІВ относительно центра масс пептида
Таким образом, при взаимодействии с бактериальной мембраной зервамицин ІІБ ориентирует ^концом к поверхности мембраны за 6 нс под действием внешнего электрического поля. При этом первые три аминокислотных остатка входят в область полярных головок, а остальная часть пептида остается в водном окружении. Данное положение пептида стабилизируется 4-мя водородными связями между остатками АсеО, 01иЗ, Ткг6 и полярными головками липидов.
Димеризация молекул ZrvIIB на поверхности мембраны
В экспериментальных работах [10-11] было показано, что ковалентное связывание молекул аламетицина ^концами приводит к увеличению времени жизни канала до 100 мс. Взаимовлияние молекул 2гуііБ может сказаться не только на стадии образования канала, но также и на взаимодействии с мембраной. В данной работе изучалась динамика двух молекул зервамицина ІІБ на поверхности липидного бислоя, состоящего из липидов ПОФЭ и ПОФГ. В начальной конформации пептиды располагались параллельно друг другу на расстоянии 2,4 нм между центрами масс. Каждая молекула пептида была повернута выпуклой (полярной) стороной к поверхности мембраны. После предварительной релаксации системы моделировалась равновесная динамика в течение 10 нс под действием внешнего электрического поля.
Расстояние между молекулами зервамицина ІІБ сокращается за первые 6 нс с 2,4 нм до 1 нм. При этом молекулы образуют димер. В димере пептиды расположены параллельно друг другу. Как было показано выше, в водном окружении молекулы 2гуііБ не образуют димер, а близкое расположение молекул пептидов вызывает дестабилизацию спиральной структуры. Когда пептиды взаимодействуют на поверхности мембраны, они ориентируются по внешнему электрическому полю и притягиваются положительно за-
ряженным ^концом к липидным головкам. Поэтому на поверхности мембраны образуется параллельный димер. Две молекулы зервамицина 11В взаимодействуют гидрофобными областями, изолируя тем самым неполярные аминокислотные остатки от молекул воды и полярных головок липидов. Предположительно, образование такого димера должно облегчить прохождение молекул через область липидных головок. Как видно из рис. 7 А, Б, взаимодействие молекул зервамицина ПВ в данном эксперименте с мембраной сильнее, чем в случае одиночной молекулы. Обе молекулы приблизились Оконцами к липидам и расположены под углом ~ 20° к поверхности мембраны. вконец основной цепи одной молекулы димера входит в область липидных голов ниже плоскости атомов фосфора. У второй молекулы основная цепь находится в водном окружении, но боковые радикалы 4-х аминокислотных остатков находятся в области липидных голов. Вероятно, для дальнейшего встраивания в мембрану димер должен претерпеть конфор-мационные изменения, чтобы гидрофобные аминокислотные остатки оказались снаружи и могли взаимодействовать с гидрофобными хвостами жирных кислот.
Б
Рис. 7. Положение Са-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя в начальной конформации и после 10 нс равновесной динамики отдельно для каждой молекулы (А, Б)
При взаимодействии с липидными головками молекулы зервамицина 11В образуют порядка 8 водородных связей. Молекула, которая глубже проникла в липидный бислой, образует 3 водородные связи с участием боковых радикалов остатков Gln3 и Ткгб, причем водородная связь между Ткг и фосфатной группой менее стабильна. Второй пептид образует 5 связей с участием АсеО, Gln3, Ткгб и GlnП. Первая молекула, проникая в область липидных головок, стерически расталкивает молекулы липидов, тем самым, удаляя потенциальных доноров и акцепторов водородных связей. Поэтому образовывать стабильные связи могут только полярные остатки с длинными боковыми радикалами, например, Gln. Вероятно, подобное расталкивание делает липидные хвосты доступными для гидрофобного взаимодействия с неполярными аминокислотными остатками, что должно способствовать дальнейшему встраиванию пептида. Вторая молекула не вызывает таких сильных структурных изменения в бислое, поэтому потенциально может образовать больше водородных связей.
Таким образом, две молекулы зервамицина 11В образуют параллельный димер и проникают Оконцами в липидный бислой глубже, чем одиночная молекула.
Для оценки влияния взаимодействия пептидов на спиральную структуру были определены среднеквадратичные отклонения (RMSD) С -атомов для обеих молекул. Для молекулы, не взаимодействующей с гидрофобной областью липидного бислоя, значение RMSD составило 0,15 нм, что соответствует RMSD молекулы 21гПВ в воде. Для молекулы пептида, погруженного ^концом в липидный бислой, аналогичное значение выше и составляет 0,3 нм, причем резкий рост RMSD соответствует встраиванию пептида в гидрофобную область. Следовательно, в данном случае нестабильность структуры вызвана взаимодействием Оконца с молекулами липидов.
Так как начальное положение молекул зервамицина могло в значительной степени повлиять на образование димера, был проведен дополнительный эксперимент, в котором в начальной структуре пептиды располагались взаимно перпендикулярно. В данном случае через 14 нс наметилась четкая тенденция к образованию параллельного димера. Вероятно, на полное его формирование необходимо значительно большее время. Таким образом, 21гПВ способен образовать димеры на поверхности липидного бислоя, что не наблюдается в водном окружении.
Конформационные изменения молекул зервамицина ПВ в различных системах
Конформационная стабильность молекул зервамицина 11В оценивалась путем вычисления среднего квадратичного отклонения Са-атомов аминокислотных остатков относительно начального положения. При расчете RMSD не учитывалось движение пептида как целого. В отличие от длинных пептаиболов структура зервами-
цина достаточно жесткая и во всех исследуемых системах в течение 10 нс претерпевала лишь незначительные изменения. В водном окружении спиральная структура пептида сохраняется, но увеличивает изгиб спирали. Также небольшое изменение структуры наблюдается на поверхности бислоя, состоящего из ПОФХ. Боковой радикал Gln3 поворачивается на вогнутую сторону, что обусловлено взаимодействием с липидными головками.
При взаимодействии с обеими липидными бислоями наблюдаются небольшие конформационные изменения последних трех аминокислотных остатков. Начальная структура 2ігПВ была получена методом ЯМР на мицеллах, где не учитывалось влияние трансмембранного потенциала. Следовательно, есть основания полагать, что это вызвано действием внешнего электрического поля.
На рис. 8 приведены среднеквадратичные отклонения Са-атомов относительно начального положения для молекулы зервамицина ІІВ в различных системах. RMSD для 2іуПВ в воде и в метаноле одинаково и составляет порядка 0,14 нм. RMSD для аламетицина в воде составляет 0,75 нм. На поверхности мембраны RMSD для аламетицина уменьшается до 0,25 нм, что свидетельствует о стабилизирующем влиянии липидного бислоя на спиральную структуру аламетицина. В случае зервамицина ІІВ начальная конформация в воде и метаноле сохраняется стабильной в течение как минимум 10 нс, а на поверхности мембраны претерпевает быстрые изменения. Как видно из рис. 8, RMSD для 2ігПВ на поверхности ПОФХ бислоя в первые 4 нс соответствует RMSD в воде и метаноле, после чего пептид разворачивается вокруг своей оси и образует водородные связи с липидными головками. При этом структура немного искажается и после поворота RMSD составляет 0,33 нм. Изменение конформации С-концевых аминокислотных остатков также вносит вклад в RMSD.
0.45-
Время, ПС
Рис. 8. Среднеквадратичное отклонение положения Са-атомов молекулы зервамицина ІІВ от начального положения в различных системах
При взаимодействии 21гПВ с липидами ПОФЭ и ПОФГ при повороте пептида относительно поверхности мембраны RMSD увеличивается до 0,33 нм. Рост RMSD вызван попеременным образованием и разрывом водородных связей между аминокислотными остатками и липидами. За 10 нс конформация пептида в значительной степени возвращается к начальной конформации, о чем свидетельствует падение RMSD.
Встраивание зервамицина ПБ в мембрану
Для исследования динамики встраивания зервамици-на в липидный бислой с помощью метода управляемой динамики был проведен ряд численных экспериментов, в которых внешняя сила прикладывалась отдельно к С и Оконцам и к Са-атомам. В качестве начальной структуры использовались системы, состоящие из липидного бислоя и молекулы зервамицина после 10 нс релаксации на поверхности мембраны.
Встраивание в ПОФХ
Под действием силы 4,3 ккал/(моль-А), приложенной к С-концу, 21г11В в течение 10 нс разворачивается С-концом к мембране, но не углубляется в область гидрофобных хвостов. Вероятно, это связано с торможением за счет образования водородных связей между остатками Нур10, Gln11, Нур13, РЫ16 и липидными головками. В эксперименте, где внешняя сила 0,27 ккал/(моль-А) была приложена ко всем Са-атомам пептида, 21гПВ в течение 10 нс оставался в области липидных головок параллельно поверхности бислоя. Когда сила была приложена к Оконцу, пептид за 10 нс вошел в область липидных головок, не вызвав при этом существенных структурных изменений в липидном бислое. Таким образом, данные эксперименты подтверждают гипотезу, что встраивание в мембрану происходит ^концом. Так как приложение силы ко всем Са-атомам не привело к встраиванию пептида, то можно сделать вывод, что воздействие на пептид, переводящее его из поверхностного состояния в трансмембранное, в основном, направлено
&
А
В
Рис. 9. Положение молекулы зервамицина IIB относительно атомов фосфора липидных головок через 10 нс при приложении силы 4,3 ккал/мольА к N-концу (А), С-концу (Б) и силы 0,27 ккал/мольА ко всем Са-атомам (В). Указан C-концевой остаток PHL
на N-конец молекулы. Это хорошо согласуется с моделью потенциал-зависимой активации канала, согласно которой трансмембранный потенциал разворачивает дипольный момент молекулы, то есть «тянет» несущий локальный положительный заряд N-конец внутрь мембраны.
На следующем этапе работы более детально был исследован процесс встраивания молекулы зервамицина IIB в липидный бислой. Для этого были рассчитаны три траектории, в которых к N-концу (к Ca-атому остатка Ace0) была приложена сила, равная 4,3; 5,7 и 8,6 ккал/ (моль-А), с целью определить оптимальное значение внешней силы для дальнейшего исследования.
На рис. 10 показано изменение z-координаты остатка Ace под действием внешнего ускорения. При ускорении, эквивалентном 4,3 ккал/(моль-А), встраивание происходит медленно, и за 10 нс N-конец преодолел только верхний монослой. Под действием 5,7 ккал/(моль-А) ZrvIIB полностью встраивается за 7 нс и остается в трансмембранной конформации. При силе 8,6 ккал/(моль-А) пептид проходит сквозь мембрану и выходит в водное окружение, не испытывая значительного торможения от энергетических барьеров. Таким образом, для изучения
динамики встраивания 21тНВ в липидный бислой нужно использовать значение внешней силы 5,7 (ккал/моль-А).
Динамика встраивания пептида происходит неравномерно. Можно выделить три стадии. Вначале вконец движется в водном окружении, приближаясь к липидным головкам. На первой стадии аминокислотные остатки Асе0-Трг1-11е2 входят в гидрофобную область мембраны. Далее Gln3 и ТИг6 образуют водородные связи с полярными головками липидов и тем самым замедляют дальнейшее встраивание пептида. На второй стадии в гидрофобную область входят остатки Gln3-Dva4-Ile5-ТИг6-АШ7-Ьеи8-АШ9, а Нур10 и Gln11 взаимодействуют с полярной областью мембраны и вызывают замедление динамики встраивания. На третьей (заключительной) стадии весь пептид встраивается в липидный бислой.
?•*>
1500 пс
3500 пс
5500 пс
7500 пс
Рис. 10. Изменение z-координаты Ы-конца зервамицина под действием внешней силы
Таким образом, при встраивании в мембрану пептид преодолевает 3 существенных энергетических барьера. Первый барьер соответствует прохождению остатка Асе0 через область липидных головок, второй - прохождению Gln3 и ТИг6 и третий - прохождению Нур10, Gln11 и Нур13 через полярную часть мембраны.
При встраивании 21гПВ Ы-концом в липидный бислой поочередно образуются водородные связи между аминокислотными остатками и липидными головками, однако в этом взаимодействии не участвуют более 2 остатков одновременно. При встраивании С-концом, как было описано выше, 4 аминокислотных остатка (Нур10, Gln11, Нур13, РЫ16) одновременно образуют водородные связи с полярными головками липидов, что создает большой потенциальный барьер и препятствует дальнейшему встраиванию. Таким образом, наличие на С-конце большего количества полярных остатков не позволяет пептиду встраиваться в липидный бислой С-концом. В противном случае активность зервамицина 11В проявлялась бы не только при «цис»-трансмембранном потенциале (когда пептиды находятся с той же стороны мембраны, что и катод).
Рис. 11. Положение 7гуПВ относительно атомов фосфора липидов ПОФХ в различные моменты траектории. Ван-дер-ваальсовыми сферами отмечены атомы фосфора и остатки Gln3, ТЫ-6 (1500 пс) и Нур10, Gln11 (3500 пс)
На рис. 11 представлены конформации молекулы зер-вацина 11В в различные моменты времени. Время 1500 пс и 3500 пс соответствует положению пептида в двух потенциальных ямах. В окне 1500 пс ван-дер-ваальсовыми сферами показаны остатки Gln3 и Ткг6, которые взаимодействуют с полярными головками липидов. В окне 3500 пс отмечены остатки Нур10 и Gln11, которые также вызывают замедление встраивания пептида в липидный бислой. Также видно, что на этой стадии спиральная структура пептида искажается за счет того, что Gln3 продолжает притягиваться к липидным головкам.
Через 5500 пс пептид полностью встраивается в липидный бислой. Причем сначала пептид располагается под углом к поверхности мембраны, что может быть объяснено взаимодействием полярных аминокислотных остатков с липидными головками мембраны, так как полярные остатки расположены преимущественно на выпуклой стороне мембраны. Это приводит к повороту пептида относительно поверхности бислоя. После разрыва водородных связей пептид разворачивается перпендикулярно поверхности мембраны и остается в таком положении при дальнейшем действии силы, а также после ее отключения. За следующие 2 нс пептид ориентируется перпендикулярно поверхности мембраны и далее не меняет своего положения.
Время, А
аминокислотных остатков, вошедших в липидный бислой на данной стадии.
Локальные минимумы кулоновской составляющей энергии взаимодействия пептида с липидами соответствуют образованию водородных связей. Как видно, после встраивания пептида в бислой, происходит небольшое понижение энергии кулоновского взаимодействия, это связано с взаимодействием остатков Тгр1 и РЫ16 с полярными участками мембраны. Эти два остатка служат своеобразными якорями, фиксирующими трансмембранное положение пептида.
Встраивание в ПОФГ и ПОФЭ
Под действием силы 4,3 ккал/(моль-А), приложенной к С-концу, 2гуПВ в течение 14 нс разворачивается параллельно поверхности мембраны. Видимо, взаимное отталкивание отрицательно заряженной поверхности мембраны и С-конца пептида препятствует встраиванию даже в область полярных головок, что можно было наблюдать для бислоя ПОФХ. В экспериментах, где такая же сила была приложена к Ы-концу, а сила 0,27 ккал/(моль-А) была приложена ко всем Са-атомам аминокислотных остатков, встраивание пептида в мембрану происходило так же, как и в случае с ПОФХ мембраной (рис. 13).
Б
Рис. 12. Кулоновская, ван-дер-ваальсовская энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина 11В с липидами (А) и водой (Б)
При встраивании молекулы 2гуПВ в липидный бислой энергия взаимодействия пептида с липидами, рассчитанная как сумма кулоновских и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, уменьшилась на 800 кДж/моль (рис. 12). Отметим, что энергия взаимодействия пептида с водой возросла на 800 кДж/моль. Как видно из графиков, основной составляющей энергии взаимодействия пептида с водой является кулоновское взаимодействие, а пептида с липидами - ван-дер-ваальсовское. Однако в сумме они дают примерно одинаковые вклады в изменение энергии при встраивании. Таким образом, потенциальная энергия взаимодействия зервамицина 11В с окружением при встраивании в липидный бислой практически не изменяется. На графике зависимости энергии взаимодействия от времени видно изменение энергии на каждой стадии процесса встраивания. Так, на первой стадии энергия падает на 200 кДж/моль, на второй стадии на 370 кДж/моль и на третьей - на 230 кДж/моль. Изменение энергии на каждой стадии пропорционально количеству
А
В
Г
Рис. 13. Положение молекулы зервамицина 11В относительно атомов фосфора липидных головок через 10 нс при приложении силы 4,3 ккал/(моль^А) к Ы-концу (А), С-концу (Б) и силы 0,27 ккал/(моль^А) ко всем Са-атомам (В). Указан С-концевой остаток РИЬ
Б
Для модельной мембраны эукариот также было изучено встраивание димера из двух молекул 21тПВ под действием силы 4,3 ккал/(моль-А), приложенной к Оконцам пептида. Как видно из рис. 14, за 10 нс одна из молекул димера погрузилась значительно глубже в гидрофобную область мембраны, чем одиночный пептид. Следовательно, можно сделать вывод, что взаимодействие молекул зервамицина 11В на поверхности мембраны и образование параллельного димера способствуют дальнейшему встраиванию пептида. Несмотря на это, образование димера не является обязательным при взаимодействии пептидов с поверхностью мембраны, т.к. время образования комплекса может превышать время встраивания пептида в мембрану.
В случае с бактериальной мембраной ее отрицательный заряд увеличивает первый потенциальный барьер. Время, требуемое на полное встраивание пептида в мембрану под действием внешней силы, значительно больше, чем в случае с эукариотической мембраной. Предположительно, селективность действия зервамицина определяется стадией взаимодействия с поверхностью мембраны, т.к. вероятность адсорбции на поверхность эукариотической клеткой оказывается меньше.
Так же как и в эксперименте с мембраной из липидов ПОФХ, наиболее достоверные результаты можно получить, прикладывая силу 5,7 ккал/(моль-А) к Оконцу (рис. 14). В данном эксперименте динамика встраивания более линейна и стадийность не так ярко выражена.
не отталкивался от поверхности мембраны. Дальнейшее продвижение пептида вызывает деформацию мембраны и изгиб спирали пептида за счет сильного взаимодействия положительного Оконца с отрицательно заряженной поверхностью мембраны. Липидные головки, находящиеся рядом с пептидом, двигаются вместе с ним в гидрофобную область мембраны. Через 7 нс Нур10 образует водородные связи с липидными головками и частично разворачивает пептид к поверхности бислоя. В течение следующих 2-х нс разрываются водородные связи между Gln3 и липидными головками, и структура бислоя нормализуется. Пептид встраивается до Нур10, который вместе с Gln11 взаимодействует с липидными головками. В последующие 5 нс продвижение Оконца в гидрофобную область мембраны вызывается распрямлением спирали пептида. Все это время Нур10 и Gln11 находятся в области липидных головок. На последней стадии Нур10 и Gln11 разрывают водородные связи с полярными головками и пептид полностью встраивается в липидный бислой.
» »« ь -
6 Л
2500 пс
7000 пс
Рис. 14. Изменение z-координаты Ы-конца зервамицина под действием внешнего ускорения
На первой стадии 21тПВ погружается в липидный бислой до Gln3, который, образуя водородные связи с липидными головками, удерживает пептид на поверхности. При этом пептид ориентируется перпендикулярно поверхности мембраны, так как сила дополнительно разворачивает пептид вдоль действия поля. В случае с ПОФХ мембраны из липидов такой сильный разворот не наблюдался, так как отрицательно заряженный С-конец
14000 пс
Рис. 15. Положение ZrvIIB относительно атомов фосфора липидов ПОФГ и ПОФЭ в различные моменты траектории. Ван-дер-ваальсовыми сферами отмечены атомы фосфора и остатки Gln3 (2500 пс) и Нур10, Gln11 (7000 пс, 9000 пс и 14000 пс)
Процесс встраивания 2гуПБ в мембрану ПОФЭ/ ПОФГ, так же как и в случае с мембраной РОРС, имеет три стадии: встраивание Оконца до Gln3, встраивание остатков до Нур10 и встраивание С-конца. При встраивании пептид преодолевает 3 энергетических барьера: прохождение Асе0 в гидрофобную область, разрыв водородных связей между Gln3 и липидными головками и разрыв
водородных связей между Нур10, Gln11 и липидными головками. На рис. 15 показаны конформации молекулы 2іуПВ в разные моменты времени. Видно, что основным различием в процессе встраивания в мембрану ПОФЭ/ ПОФГ является то, что липидные головки начинают взаимодействовать с Нур10 и Gln11 до того, как Gln3 входит в гидрофобную область, что вызывает не только изгиб спирали пептида, но и деформацию липидного бислоя.
На рис. 16 видно, что энергия взаимодействия пептида с липидами при встраивании уменьшилась на 600 кДж/моль, а энергия взаимодействия с молекулами воды увеличилась на 400 кДж/моль. Следовательно, в процессе встраивания потенциальная энергия взаимодействия пептида с окружением уменьшается на -200 кДж/моль. Потенциальная энергия трансмембранного состояния в случае с мембраной ПОФЭ/ПОФГ меньше, чем для пептида, связанного с поверхностью бислоя. Однако при одинаковой внешней силе времени на встраивание пептида в ПОФЭ/ПОФГ мембрану требуется больше, чем в
А
Б
Рис. 16. Кулоновская, ван-дер-ваальсовская энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина 11В с липидами (А) и водой (Б)
случае с мембраной ПОФХ, что свидетельствует о том, что пептиду необходимо преодолеть более высокий энергетический барьер. При сравнении рис. 16 А и рис. 16 Б видно, что во втором случае минимумы кулоновской энергии более выражены, что свидетельствует о более сильном взаимодействии полярных остатков с липидными головками. На суммарной энергии взаимодействия также видны энергетические барьеры, соответствующие образованию водородных связей остатков Gln3, Hyp10, Gln11 с липидными головками.
При взаимодействии молекулы ZrvIIB с модельной мембраной прокариот пептид ориентируется под углом к поверхности мембраны и направлен N-концом к ней, данное положение стабилизируется водородными связями между остатками Ace0, Gln3 и фосфатными и аминными группами липидов. В случае с модельной мембраной эукариот ZrvIIB не входит глубоко в липидный бислой, а располагается параллельно поверхности. При этом Gln3 и Glnl 1 образуют водородные связи с полярными головками липидов. Димеризация молекул зервамицина на поверхности мембраны способствуют более глубокому проникновению пептидов в полярную область бислоя.
Процесс встраивания ZrvIIB под действием внешней силы, приложенной к N-концу, имеет стадийный характер. Сам процесс встраивания происходит в три стадии: встраивание N-конца до Gln3, далее разрыв водородных связей между Gln3 и полярными головками и встраивание остатков до Hyp10; на заключительной стадии - разрыв водородных связей между липидными головками и Hyp10, Gln11 и встраивание C-конца.
Как было показано выше, сам процесс встраивания быстрее протекает для модельной мембраны прокариот, однако в случае с модельной мембраной эукариот взаимодействие пептида с поверхностью липидного бислоя сильнее. Таким образом, можно сделать вывод, что селективность действия зервамицина IIB осуществляется не на стадии встраивания в мембрану, а на стадии адсорбции пептида на поверхность мембраны. Вероятно, на сам процесс встраивания в большей мере влияет насыщенность и длина гидрофобных хвостов липидов, а не их заряд. Потенциальная энергия взаимодействия ZrvIIB с окружением при встраивании в мембрану ПОФХ не изменяется, а при встраивании в мембрану ПОФЭ/ПОФГ уменьшается на -200 кДж/моль, однако пептиду надо преодолеть более высокий энергетический барьер.
Л и т е р а т у р а
1. Николаев И.Н., Шайтан К.В. Молекулярное моделирование сложных биоструктур, содержащих мембранный компонент // Вестник Якутского государственного университета. - 2008. - Т. 5. - № 2. - С. 32-39.
2. K.V Shaitan, M.Yu. Antonov, Ye.V Tourleiqh, O.V Levtsova, K.B. Tereshkina, I.N. Nikolaev, and M.P. Kirpichnikov. Comparative Study of Molecular Dynamics, Diffusion, and Permeability for Ligands in Biomembranes of Different Lipid Composition.
Biochemistry (Moscow) supplement series A: Membrane and Cell Biology, 2008, vol.2, No.1, pp. 73-81.
3. Николаев И.Н., Левцова О.В., Шайтан К.В. Динамика зервамицина 11В в воде и в метаноле // Вестник Якутского государственного университета. - 2009. - Т. 6. - № 2. - С. 18-24.
4. Boheim G. Statistical analysis of alamethicin channels in black lipid membranes. J. Membr. Biol., 19, 1974, 277-303.
5. Boheim G., Janko K., Leibfritz D., Ooka T., Konig W.A., Jung G. Structural and membrane modifying porperties of suzukacillin, a peptide antibiotic related to alamethicin. Part B. Pore formation in black lipid films. Biochim. Biophys. Acta, 433, 1976, 182-199.
6. Jung G., Konig W.A., Leibfritz D., Ooka T., Janko K., Boheim G. Structural and membrane modifying properties of suzukacillin, a peptide antibiotic related to alamethicin. Part A. Sequence and conformation. Biochim. Biophys. Acta, 433, 1976, 164-181.
7. Oren Z., Shai Y. Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers, 47, 1998, 451-463.
8. Ludtke S.J., He K., Heller W.T., Harroun T.A., Yang L., Huang H.W. Membrane pores induced by magainin. Biochemistry, 35, 1996, 13723-13728.
9. Kobayashi S., Chikushi A., Tougu S., Imura Y, Nishida M., Yano Y., Matsuzaki K. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 43, 2004, 1561015616.
10. Okazaki T., Sakoh M., Nagaoka Y, Asami K. Ion channels of alamethicin dimer N-terminally linked by disulfide bond. Biophys. J., 85, 2003, 267- 273.
11. Sakoh M., Okazaki T., Nagaoka Y, Asami K. N-terminal insertion of alamethicin in channel formation studied using its covalent dimer N-terminally linked by disulfide bond. Biochim. Biophys. Acta, 1612, 2003, 117-121.
I.N. Nickolaeva, O.V Levtsova, A.K. Shaytan, K.VShaytan
Interaction between zervamicin IIB and lipid bilayer
The authors show that method of molecular dynamics [1, 2, 3] can be used to study interaction between molecule of zervamicin IIB and membranes of eukaryotic and prokaryotic cells. Lipid bilayer consisting of palmitoiloleoilphosphatidilholin (POPhH) was used to model membrane of eukaryotic cell. Lipid bilayer of palmitoiloleoilphosphatidilglycerol (POPhG) and palmitoiloleoilphosphatidilethanola min (POPhE) in proportion 1:4 was used to model bacterial cell. Zervamicin molecule’s ability to aggregate on a membrane’s surface was researched. In addition two-way influence of peptides on a binding and incorporation process.
Key words: equilibrium molecular dynamics, controlled molecular dynamics, biological membranes, peptides, amino-acid remains.
УДК 669
М.А. Емельянова, Г.Н. Романов, И.И. Ноев
ФОРМИРОВАНИЕ АБРАЗИВНОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ МЕДЬ-ТИТАН-АЛМАЗ
На основе классического представления об объемных изменениях порошковых тел при твердофазном спекании исследовалась возможность формирования абразивного материала на основе медь-титан-алмаз. Изделия, полученные методом порошковой металлургии, не изменяли свои формы и размеры, что упрощало дальнейшую их обработку. Наилучшие свойства показали образцы, содержащие в равных долях металлическую связку и алмазный порошок.
Ключевые слова: система, порошок, смесь, пресс-форма, пористость, спекание, твердость, алмаз, абразивный материал.
ЕМЕЛьЯНОВА Маргарита Алексеевна - к.т.н., доцент ФТИ ЯГУ
E-mail: meggye@rambler.ru
РОМАНОВ Георгий Николаевич - к.ф.-м.н., доцент ФТИ ЯГУ
E-mail: romgeorg@ykt.ru
НОЕВ Иван Иванович - к.т.н., доцент ФТИ ЯГУ E-mail: meggye@rambler.ru
Влияние пористости, температуры спекания и концентрации титана на объемные изменения прессовок системы ^- ТС
Для приготовления смесей, содержащих 1, 2, 3 и 4 ат.% титана, использовались порошки меди марки ПМС и титана марки ПТЭ со средней величиной частиц меньше 50 мкм.
б4
